冻干重组人三突变型HIF-1α腺病毒生物学效应考察

2011；31(3) 南方医科大学学报(J South Med Univ) ·469· ·基础研究· 冻干重组人三突变型HIF．1 a腺病毒生物学效应考察 陶 宇，王月刚，魏 旋，刘 城，陈冬冬，吴平生 南方医科大学南方医院心血管内科，广东 广州 510515 摘要：目的研究冻干对重组人三突变型HIF．1 0【腺病毒(Ad-HIF．1 c【．564／402／803)生物学效应的影响。方法 将前期构建的 Ad．HIF．1ct．564／402／803在HEK293A~W胞中进行扩增，用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化，X．Gal染色法测定重组 腺病毒转染效率，在适宜的条件下制成冻干剂。采用MTS试剂盒观察冻干前后Ad—HIF．1a一564／402／803对hMVECs增殖 的影响。分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点提取病毒DNA，进行PCR及PCR产物测序鉴定重组人三突变 型HIF一1a腺病毒基因；并在4个时间点以Ad—HIF．1a．564／402／803转染hMVECs，提取蛋白进行westernblot检测HIF—la 蛋白的达。结果 X—gal染色显示MOI为100pfu／cell时，转染效率趋于稳定。冻干前后重组人三突变型HIF．1旺且泉病毒 对hMVECs增殖影响无显著差异(P>0．05)。经PCR及基因测序鉴定，在四个时间点，腺病毒所携带的目的基因信息无丢 失或突变，HIF．1谣 白表达无差异(Jp>O．05)0结论 冻干能够长期保持重组人三突变型HIF．1 0l腺病毒的高生物活性。 关键词：HIF．1a；重组腺病毒；冷冻干燥；生物学活性 中图分类号：R392 文献标志码：A 文章编号：1 673．4254(20 1 1)03—0469．04 Characterization of the biological activities of lyophilized recombinant adenovirus expressing the triple mutant of hypoxia inducible factor-la TAO Yu．WANG Yue-gang,WEIXuan,LIUCheng,CHENDong-don~ WUPing-sheng Department ofCardiology,Nandang hospital,Southern medical University Guangzhou，510515,China Abstract：Obiecfive To investigate the influence of lyophilizafion on the biological activity of recombinant adenovirus．mediated triple mutant of hypoxia inducible factor一1 rAd．HIF一1 一564／402／803)．Methods Ad-HIF一1仅一564／ 402／803 was amplified from HEK293A cells and purified by ultracentrifugation in CsC1 gradient solutions．The infection efficiency was observed by X-gal staining．The lyophilized adenovirus was prepared under appropriate conditions．Before and after lyophilization,the effect of Ad—HIF一1 -564／402／803 on hMVEC proliferation was evaluated by MTS assay．Th e recombinant adenovirus was confirmed by PCR and DNA sequence analysis before and 1 day,6 months and 12 Ionths after lyophilization,and hMVECs infected with Ad—HIF一1a一564／402／803 at these time points were examined for HIF．1a protein expression using Western blotting．Results No significant changes were observed in the effect of lvophilized Ad—HIF一1 -564／402／803 on hMVECs proliferation at the optimal multiplicify of infection of 100 pfu／cell rP>0．05)．At the 4 time points,the recombinant adenovirus HIF一1c【showed no structural alterations or significant changes in the expression level of HIF一1 protein in the transfected hMVECs fP>0．O5)． Conclusion Lvophilized Ad，HIF一1仅，564／402／803 can maintain its biolo cal activities for a long time． Kev words：hvpoxia inducible factor一1：recombinant adenovirus；1yophilization；biological activities 近年来在缺血l生心脏病研究中，采用基因治疗促 进血管新生，建立有效的侧支循环，改善缺血心肌的血 供，为弥漫f生冠脉病变以及难以接受血管重建患者提供 了新的治疗途径，且已从基础研究发展到了临床试验。 低氧诱导因子．1(HIF一1)是细胞对缺氧作出适应性反应 的上游关键I生转录因子，可以直接或间接调节多种下游 靶基因如VEGF、FGF、PDGF、ANG．1等的表达，促进内 收稿日期：2010．10．29 基金项目：国家自然科学基金(30370587)；国家青年科学基金(308O0462) SuppoSed by National Natural Science Foundation ofChina(30370587)． 作者简介：陶 宇，博士研究生，E．mail：taoyu93@163．com 通讯作者：吴平生 ，教授，主任医师，博士生导师 ，电话：020—61641502， E—mail：wupingsheng123@yahoo．com 皮细胞增殖和管腔形成⋯。HIF．1a是HIF一1的调节亚 基，决定HIF．1的活性瞳]。在常氧条件下，HIF．1a氧依 赖降解结构域(ODDD)的Pro564、Pro402两个位点在脯 氨酸羟化酶的作用下经泛素途径降解b ，而转录激活域 C．TAD第803位天冬酰胺残基的羟化使HIF．1a的转 录活性受到抑制 ]。因此，HIF—la只有在低氧条件下才 能发挥功能，其蛋白形式在常氧下5 min即发生降解 。 我们前期将Pro564、Pro402和Asn803三个位点 联合突变 ，成 功构建 了重组腺病毒三 突变型 Ad—HIF．1a564／402／803，获得了在常氧条件下可稳定 表达且生物活性高的HIF—la ]。但是，腺病毒不耐热， 一 般保存在含有冷冻保护剂的缓冲液中，并于一80℃储 存。由于运输必须在干冰上进行、储存冷链限制、使用 · 470· 南方医科大学学报(J SouthMedUniv) 第31卷 前需要冻融等因素，限制了其临床应用，而冻干后的药 物可在长期4～8℃条件下保存，为进一步明确其应用前 景，我们通过实验考察冻干对Ad—HIF—l a．564／402／803 生物学效应的影响。 1和方法 1．1 材料 重组 腺病毒 三 突变型低 氧诱导 因子 ．1 (Ad—HIF．1 a．564／402／803)、空腺病毒载体(Ad-Nul1)及B 2半乳糖苷酶([32galactosidase)基因(简称Ad-LacZ)，均 由本课题组构建；HEK293A~m胞(Invitrogen公司)；人 微血管内皮细胞(hMVECs)由本实验室保存；X—Gal (Takara)；Cell Titer96 Assay MTS／PES试剂盒(Pro． mega)；病毒基因组DNA提取试剂盒d匕京天为时代公 司)；HIF—la cDNA诱变区片段引物(广州英骏生物技术 公司)；RIPA蛋白裂解液(北京鼎国公司)；鼠抗人D—ac． tin单克隆抗体和羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗 (Santa Cmz公司，北京中杉公司分装)，鼠抗人HIF．1 0【 单克隆抗体(Sigma)；BCA．100蛋白质定量测定试剂盒 (上海申能博彩公司)；ECL发光试剂盒(Pierce)。 1．2方法 1．2．1各组基因腺病毒载体的扩增、纯化、病毒最佳转染 效率测定 在HEK293A细胞中大量扩增腺病毒；氯化 铯密度梯度离心法纯化；Ad—LacZ以不同转染复数 MOI转染hMVECs经x—gal染色测定最佳转染效率。 1．2．2制备冻干重组人三突变型HIF一1o31,~．病毒 将纯化 的重组人三突变型HIF．1源 病毒原液与适宜的冻干保 护剂混合，应用德国christ真空冷冻干燥机，一40 c预冻 3 h；．33℃抽真空干燥12 h；25 oC抽真空干燥6 h制成冻 干剂型。 1．2．3 MTS法检测hMVECs增殖率 以每孔 100 gl，5× 10 接种细胞至96孔培养板，37oC 5％CO：孵箱中培 养。约6 h后观察细胞已贴壁 ，稀释的冻干前 Ad．HIF—l a．564／402／803、冻干 后Ad—HIF—l a．564／402／ 803以最佳MOI接种至细胞培养孔中，每组设5个复孔， 对照组不加病毒。转染后第24、48、72、96、120 h应用 MTS／PES试剂盒检测细胞增殖率，紫外分光光度仪以 490 nm波长测定吸光度。 1．2．4重组人三突变型HIF．1嫌 病毒DNA提取和鉴定 分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点采用病 毒基因组提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR及PCR 产物测序鉴定三突变型HIF一1 0【基因。 1．2．5 Western blotting检测HIF—la蛋白的表达 在冻干 前、冻干后ld、6月、l2月四个时间点以Ad-HIF—l cL一564／ 402／803转染hMVECs细胞，分别裂解细胞，并提取总 蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取40 g总蛋白进行SDS／ PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、一抗4 qC孵育过夜、二抗室 温孵育lh后ECL发光显影，对照组为Ad—Null。 1．2．6统计学处理 所有数据均采用 土 表示 ，用 SPSS 1 3．0统计软件进行相关分析，P<0．05为差异有统 计学意义。 2结果 2．1最佳转染效率 Ad—LacZ以不同MOI转染hMVECs，X—gal染色显 示MOI为100 pfu／cell时，转染效率趋于稳定。 2．2 冻干对重组人 三 突变型 HIF．1 c【腺病毒促进 hMVECs增殖作用的影响 用 MTS法对比分析了hMVECs生长速率，结果显 示，三组吸光度在前3 d逐渐增高，72 h达最高峰后逐渐 下降，考虑为细胞接触抑制引起。采用重复测量方差分 析 ，冻 干 前 Ad-HIF．1a-564／402／803组 、冻干 后 Ad．HIF．1 a一564／402／803组吸光度显著高于空白对照组 (P<0．01)，但冻干前Ad．HIF—la一564／402／803、冻干后 Ad．HIF．1 Cc一564／402／803两组 之间无显 著 差异 (19> 0．05)，如表1。提示冻干不会影响重组人三突变型 HIF．1 0l腺病毒促进hMVECs增殖作用。 表1重组腺病毒转染HMVECs后的吸光度值 Table．1 Values of the optical density of HMVECs infected with the recombinant adenovirus(Mean+SD) 与对照组比镜 P<0．01 2-3冻干对重组人三突变型HIF一1徘 病毒所携带目的 基因的影响 4个时间点提取的病毒DNA，以3对引物行PCR鉴 定，均得到380 bp、460 bp、214 bp的目的片段，如图1 (时间点为12 m)。测序后与GenBank的HIF—la cDNA 序列比对显示：402位密码子由CCA诱变为GCA，如图 · 472· 南方医科大学学报(J South Med Univ 1 第3l卷 参考文献： lIj Tekin D DursunAD，Xi L．Hypoxia inducible factor 1(H1F—1)and cardioprotection[J]．Acta Pharmacol Sin，20 l 0，3 1(9)：1 085—94． 12J Chua YL，DufoBr E，Dassa EP,et a1．Stabilization of hypoxia- inducible factor．1 alpha protein in hypoxia Occurs independently of mitochondrial reactive oxygen species production[J]．J Biol Chem， 2Ol0．285(4l1：31277-84 l3』Kaelin WG Jr,Ratcliffe PJ．Oxygen sensing by mctazoans：the central role of the HIF hydroxylase pathway[Jj．Mol Cell，2008，30 (4)：393—402． 14J Wang Feng C， Xue J， et al， Adenovirus—mediated 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