[文章编号 ] 1000 - 4718 (2007) 03 - 0609 - 03
[收稿日期 ]2006 - 02 - 15 [修回日期 ]2006 - 08 - 30
Tel: 0352 - 7895399; E - mail: shenlhd@163. com
原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用
沈凌鸿 , 陈向东 , 王占海 , 李建巍 , 王 献 , 乔志灏 , 张宏松 , 朱 容
(同煤集团总医院 ICU,山西 大同 037003)
[摘 要 ] 目的 : 观察原花青素 ( GSP)对急性坏死性胰腺炎 (ANP)的治疗作用及其可能机制。方法 :采用
5%牛磺胆酸钠胰管逆行注射制备 ANP动物模型。SD雄性大鼠 48只 , 采用随机分配原则分 4组 :假手术组给予
NS 3 mL /kg; ANP模型组 ; GSP组给予腹腔注射 GSP 50 mg/kg; GSP + ANP组于造模型后给予腹腔注射 GSP
50 mg/kg。采用酶联免疫法 ( EL ISA) 检测血液及肺组织 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1含量。W estern boltting法检
测 GSP对 MAPKs信号通路的影响以及用电泳迁移率实验 ( EMSA )检测肺组织 NF -κB的 DNA结合活性。结果 :
GSP能够减轻 ANP大鼠胰腺和肺组织损伤。ANP大鼠血清及肺组织中 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1的水平、肺组
织 MPO水平均明显高于对照组 ( P < 0105)、ANP大鼠 ERKs、p38和 JNKsMAPKs的磷酸化水平及 NF -κB的 DNA
结合活性显著高于对照组。GSP +ANP组上述指标明显轻于 ANP组。结论 : GSP可能通过抑制肺 MAPKs及 NF -
κB通路的激活 ,抑制炎症因子的表达而减轻 ANP所致的肺损伤 ;对 ANP组大鼠胰腺损伤有显著的减轻作用。
[关键词 ] 胰腺炎 ; 肺损伤 ; 原花青素 ; NF -κB
[ KEY WO RD S] Pancreatitis; Lung injury; Grasp seed p rocyanidins; NF - kappa B
[中图分类号 ] R363 [文献标识码 ] A
原花青素是一种天然植物药物 ,在自然界有着丰富的资
源。研究表明原花青素 ( grasp seed p rocyanidins, GSP)都具有
显著的抗炎、抗氧化、降血脂、降血压与阻断各种信号转导通
路的作用 [ 1 - 3 ]。到目前为止 ,国内外还没有任何研究表明原
花青素是否具有抑制急性坏死性胰腺炎 ( acute necrotizing
pancreatitis, ANP)的作用。本文通过急性坏死性胰腺炎大鼠
模型 , 探讨抗氧化剂 GSP对 ANP肺损伤的治疗作用及其可
能的机制。
材 料 和 方 法
1 材料
SD雄性大鼠共 48只 , 体重 280 - 320 g, 由中国医学科
学院实验动物中心提供 ; 淀粉酶试剂盒购于 B&D公司 ; 5%
牛磺胆酸钠由 Sigma公司提供。原花青素由中国医学科学院
药物研究所提供。髓过氧化物酶活性 (MPO )检测试剂盒为
Sigma公司产品 ; TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1 EL ISA检测试剂
盒均购自美国 B&D公司。抗磷酸化与非磷酸化 ERK1 /2、JNK
及 p38抗体均购于 Cell Signaling公司。
2 动物模型的复制及分组
大鼠常规喂养 , 实验前 12 h禁食但不禁饮 ,可自由活
动。用 215%戊巴比妥钠注射液 ( 1 mg/kg BW ) 腹腔内注射
麻醉 , 造模前行右颈静脉插管 ,并用肝素液维持。腹腔正中
切口 , 打开腹腔 , 找到胆总管及胰管 ,在胆总管进入十二指
肠开口下缘处用金属夹夹住十二指肠及胰管远端 , 然后将针
头插入胰管内 , 插管后 5 m in内缓慢匀速注入 5%牛磺胆酸
钠 (1 mL /kg BW )制备 ANP动物模型。实验分为 4组 , 每组
大鼠 12只 , 采用随机分配原则分组。假手术组 , 给予 019%
NaCl溶液 ; ANP模型组 ; GSP组给予 GSP 50 mg/kg; GSP +
ANP组 , 造模型后 ,给予腹腔注射 GSP 50 mg/kg。ANP后再
继续分别观察 6 h后采用颈椎脱位法处死大鼠 , 并立即取
血、胰腺组织及肺组织供实验用。取胰腺组织及肺组织固定
部位约 100 mg,称重 ,用于计算湿 /干重比率。切取肺组织约
100 mg,即刻投入液氮中冻存 , 用于蛋白测定 ;再取约 100 mg
肺组织 , 液氮急冻后 - 80 ℃冻存 , 留待测定髓过氧化物酶
(myeloperoxidase, MPO)。另外 , 分别取胰头部位组织及肺
组织固定部位做病理学检查。
3 血清和肺组织细胞因子含量测定
各组动物在造模型 6 h后 , 经静脉采血 , 留取血清和肺
组织匀浆上清液置 - 70 ℃冰箱冻存 , 用酶联免疫吸附试验
( EL ISA) 测定血清和肺组织匀浆上清液中 TNF -α、IL - 1β、
MCP - 1及 IL - 6的含量 , 按试剂盒 (购自美国 B&D公司 )说
明书操作。
4 肺组织 M PO水平测定
灌洗后速取右肺 ,用生理盐水冲洗表面血迹 ,吸干水分
及血液 ,称湿质量 ,每克组织加入 6 mL 溴甙十六烷三甲胺 ,
冰浴中匀浆 5 s, 4 ℃ 20 000 ×g离心 10 m in,收集上清液 ,
沉淀物反复冻融 3次 ,再超声破裂细胞 10 m in, 然后 4 ℃
20 000 ×g再离心 10 m in,取所有上清液 , 37 ℃放置 3 m in,
每管分别加入 012 mol/L NaAc 1175 mL, 混匀后 , 读取
655 nm波长处吸光度值 (测定 1 m in) ,计算组织 MPO含量。
5 W estern blotting
用 PBS清洗肺组织后进行组织总蛋白提取 ,用 B radford
法测定总蛋白的含量。取适量样品 , 进行 SDS聚丙烯酰胺凝
·906·中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2007, 23 (3) : 609 - 611
胶电泳分析。电泳时浓缩胶恒压 80 V, 分离胶恒压 120 V,
电泳约 80 m in。PVDF膜用甲醇活化 15 m in后 , 在电转移架
上从负极到正极方向依次铺上滤纸 - 胶 - PVDF膜 - 滤纸 ,
恒压 100 V 转移 120 m in。 PVDF膜用含 5%脱脂奶粉的
TBST(在 1 000 mL 含 0102 mol/L Tris - HCl和 013 mol/L
NaCl的溶液中加入 1 mL Tween - 20于 4 ℃封闭 6 h。然后
用 TBST按 1∶200稀释各种多克隆抗体 ,与 PVDF膜于 4 ℃
下孵育过夜 ,并轻柔摇动。再用 TBST按 1∶5 000稀释鼠抗山
羊 IgGⅡ抗 ,与 PVDF膜孵育 1 h, 室温轻柔摇动。化学发光
法分别检测 PVDF膜上各种蛋白的表达。同样用 V ILBER
LOURMAT凝胶图像分析系统对条带吸光度扫描 ,以 GAPDH
为内参照 , 测定各样品的蛋白表达。
6 电泳迁移实验 EM SA
肺组织 NF -κB活性的检测 ,依 EMSA 试剂盒说明书进
行 ,主要步骤 : (1) 肺组织核蛋白的提取 , 用考马斯亮蓝定量
核蛋白 (牛血清白蛋白作参照 ) ; ( 2 ) NF - κB ( 5’- AGTT2
GAGGGGACTTTCCCAGGC - 3’)寡核苷酸探针的标记 ; ( 3)
寡核苷酸探针标记百分率的测定 ; (4) 未标记寡核苷酸的清
除 ; (5)寡核苷酸探针与细胞核蛋白的结合反应 ; (6) 7%非
解离聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; (7) 放射性自显影 ; ( 8) 将显影
结果经扫描仪扫入计算机中 , 然后用 Image Too1系统进行分
析 ,以积分灰度值表示 NF -κB的活性变化。
7 病理学检查
在光镜下观察胰腺及肺组织学改变。肺组织学观察与
计分参照 Hofbauer等 [ 6 ]的方法。即 ,在各组实验动物中随机
抽样做病理学检查。肉眼观察 :观察胰腺及周围有关皂化斑
的形成 ,胰腺水肿、出血、坏死程度 ,腹水颜色及量。观察肺
组织水肿、出血及坏死程度 , 胸腔有无积液及量。取各组胰
腺及肺组织 ,用 10%中性甲醛固定 ,石蜡包埋 , HE染色。光
镜下胰腺组织病理学评分指标为水肿、空泡形成、间质白细
胞浸润、腺泡坏死及胰腺组织灶性坏死 5个项目积分 , 并计
算其积分总和。
8 统计学处理
计量资料数据用 珋x ±s表示 ,应用统计软件 SPSS 1010进
行方差齐性检验 ,若方差不齐 ,采用平方根反正弦或对数变
量变换 ,达到方差齐性要求后再进行方差分析。
结 果
1 GSP对血清及肺组织中炎症因子水平的影响
结果表明 , ANP造模后 6 h,血清及肺组织 TNF -α、IL -
1β及 ICAM - 1水平明显高于对照组 ( P < 0105, P < 0101)。
GSP +ANP组炎症因子的水平则明显低于 ANP组 ( P < 0105,
P < 0101)。单独 GSP组的炎症因子没有明显变化 ,见表 1。
2 GSP对脂肪酶、淀粉酶和胰腺湿 /干重比率的影响
ANP组血脂肪酶、淀粉酶水平明显高于对照组 , GSP +
ANP组脂肪酶和淀粉酶明显低于 ANP组 ( P < 0105, P <
0101)。湿 /干重比率比较显示 GSP组胰腺湿 /干重比率低于
ANP组 (表 2)。
3 GSP对肺组织湿 /干重比率、病理和 M PO 的变化
胰腺炎组肺湿 /干重比率高于对照组 ; GSP组肺组织湿 /
干重比率则明显低于 ANP组。GSP组肺 MPO活力也明显低
于 ANP组 (表 2)。
表 1 GSP对 ANP大鼠细胞因子的作用
Tab 1 Effects of grasp seed p rocyanidins( GSP) on the levels of
cytokines in ANP rats (珋x ±s. n = 12)
Group Control ANP GSP GSP +ANP
Serum
TNF -α ( ng/L) 91. 4 ±8. 2# 788. 4 ±76. 333 88. 4 ±10. 6# 356. 7 ±35. 7#33
IL - 1β( ng/L) 121. 4 ±15. 6# 843. 2 ±115. 833 110. 9 ±10. 5# 366. 3 ±56. 6#33
ICAM - 1 ( ng/L) 57. 5 ±6. 8# 387. 3 ±26. 733 64. 6 ±8. 9# 145. 6 ±31. 3#33
Lung tissue
TNF -α ( ng/L) 64. 4 ±7. 7# 533. 7 ±78. 233 68. 2 ±8. 5# 305. 7 ±36. 3#33
IL - 1β( ng/L) 89. 4 ±11. 7# 718. 5 ±94. 333 92. 2 ±9. 5# 315. 8 ±56. 4#33
ICAM - 1 ( ng/L) 47. 3 ±6. 4# 307. 5 ±34. 633 52. 5 ±4. 8# 153. 2 ±18. 5#33
33 P < 0101 vs control group; #P < 0101 vs ANP group.
表 2 GSP对 4组大鼠淀粉酶和脂肪酶含量的影响
Tab 2 Effects of GSP on the levels of amylases and lipase (珋x ±
s. n = 12)
Group Control ANP GSP GSP +ANP
Amylases (U /L) 1 783. 4 ±122. 5# 8 063. 7 ±379. 833 1 885. 4 ±132. 3# 4 228. 6 ±254. 6#33
Pancreatwet/dry ratio 3. 29 ±0. 62# 6. 10 ±0. 8133 3. 35 ±0. 47# 4. 78 ±0. 37#33
L ipase ( IU /L) 86. 5 ±9. 4# 261. 4 ±32. 633 87. 9 ±11. 4# 148. 7 ±18. 5#3
Lung wet/dry ratio 4. 3 ±0. 4# 5. 8 ±0. 63 4. 2 ±0. 3# 4. 7 ±0. 3#3
MPO (U /g) 4. 7 ±0. 5# 11. 8 ±1. 133 4. 6 ±0. 7# 7. 60 ±1. 2#33
3 P < 0105, 33 P < 0101 vs control group; #P < 0101 vs ANP group.
Fig 1 Effects of GSP on the phosphorylation of MAPKs in ANP
rats. A: control; B: GSP group; C: ANP model; D:
ANP + GSP group.
图 1 GSP对 ANP大鼠 M APKs磷酸化的影响
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4 GSP对 ANP大鼠 M APK通路的影响
W estern blotting显示 , ANP造模后 6 h,大鼠 ERK1 /2、p38
及 JNKs的磷酸化显著增强。而 GSP +ANP组 , ERK1 /2、p38
及 JNKs的磷酸化被完全取消 (图 1)。
5 GSP对 ANP大鼠 NF -κB信号转导通路的影响
EMSA显示 , ANP造模后 6 h大鼠 NF -κB的 DNA结合
活性明显增加。GSP +ANP组大鼠的 NF -κB的激活作用被
完全取消 (图 2)。
Fig 2 Effects of GSP on the activation of NF -κB in ANP rats.
A: control; B: GSP group; C: ANP model; D: ANP +
GSP group.
图 2 GSP对 ANP大鼠 NF -κB激活的影响
讨 论
GSP是一种很强的抗氧化剂 , GSP有显著的降血脂、保护
心肌、抗脑缺血以及抗炎、抗糖尿病的治疗作用 [ 1 - 3 ]。研究已
证实 MAPK在急性炎症 , 如脓毒血症、AL I及 ANP的发病中
起非常重要的作用 [ 4, 5 ]。NF -κB 是炎症基因表达的关键调
节因子 , 许多炎症因子的启动子区都有 NF -κB结合位点 ,
而受 NF -κB的激活 [ 6, 7 ]。但是对于 GSP在 ANP的治疗目前
还没有任何研究。
本实验发现 ANP 后 6 h 大 鼠肺 与胰 腺 中的 NF
- κB明 显 活 化 , 应 用 GSP后 , ANP组 大 鼠 NF - κB
活性及炎症因子 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1水平大幅度降
低 , 提示 GSP可能通过抑制 NF -κB活化 , 阻止 NF -κB 从
胞浆进入胞核 , 降低 ANP大鼠体内炎症介质 TNF -α、IL -
1β及 ICAM - 1水平 , 减轻肺与胰腺的损伤。但 GSP作用的
确切机制有待进一步研究。
[参 考 文 献 ]
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