动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究

食品研究与开发 2007.Vol.28.No.12 徐蓓,徐志祥,王凤侠,张岩,王硕* (天津科技大学 食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津 300457) 动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联 免疫检测的研究 DEVELOPMENTOFELISAFORTHEDETECTIONOFAMETABOLITEOFFURAZOLIDONEINANIMALFOODS XUBei,XUZhi-xiang,WANGFeng-xia,ZHANGYan,WANGShuo* (KeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,MinistryofEducationofChina,TianjinKeyLaboratoryofFoodNutritionand Safety,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China) Abstract:Polyclonalantibodywasproducedtodetect3-amino-2-oxazolidinone(AOZ),astablemetaboliteofthe nitrofuranantibioticfurazolidone.AcarboxyphenylderivativeofAOZwasprepared,purifiedandconjugatedto immunogeniccarrierprotein.Theantibodywasselectedandpurified.ThelimitofdetectionofCPAOZwas0.2μg/L withcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).TheantibodywashighlyspecificforCPAOZand didnotcross-reactwithotherantibiotics. Keywords:furazolidone;AOZ;antibody;competitiveELISA;cross-reactivity 摘 要:3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物,通过选用对醛基苯甲 酸对 AOZ进行衍生制得 CPAOZ,以 CPAOZ作为半抗原,再与载体蛋白连接制成免疫原,经过免疫,制得多克隆抗 体。经过筛选纯化得到的抗体,用直接竞争酶联免疫检测方法得CPAOZ检出限为0.2μg/L,且与其他抗生素无交叉 反应,抗体特异性好。 关键词:呋喃唑酮;3-氨基-2-恶唑烷酮;抗体;直接竞争酶联免疫;交叉反应 呋喃唑酮(见图 1a),又名痢特灵,属于硝基呋喃 类药物,是一种人工合成的抗菌药,药效稳定,能抑制 或杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌,并对某些原虫、真 菌有一定作用。因其效高价廉,故在医药、畜牧及水产 养殖中都得到广泛应用。但呋喃唑酮有一定的副作用, 如引起视神经炎、药疹,精神障碍等,且长期摄入会产 生毒性反应,引起人体的各种疾病[1]。据 FAO和WHO 食品添加剂联合专家委员会第40次会议报告,该药有 致癌性,且易产生抗药菌株[2]。1995年,欧盟国家禁止 呋喃唑酮用于食品动物,随后美国、日本、澳大利亚等 国均取消呋喃唑酮在畜禽生产上的使用。2004年美国 FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的 11种 药物名单,其中包括呋喃唑酮。中国农业部 1997年规 定呋喃唑酮在动物性食品中为零残留(农牧[1997]7 号),2002年3月发布《食品动物禁用的兽药及其它化 合物清单》将呋喃唑酮列为禁用药。 呋喃唑酮原药在体内代谢速度很快,稳定性只有 数小时。经研究明,呋喃唑酮的代谢物中有相当数量 是以其完整侧链 3-氨基-2-恶唑烷酮即 AOZ(见图 1b)与蛋白结合的残留物形式存在,AOZ进一步代谢 可产生具致癌、致突变作用的羟乙基肼。给动物喂饲带 有示踪标记的呋喃唑酮代谢动力学实验表明,原药残 留检测的意义甚微,而结合残留物检测中,靶组织中结 合残留物总量与AOZ呈显著相关关系,虽然随代谢进 行,AOZ结合残留物约有 5%的降解或向其他形式结 合物的转化,但其仍是最合适的呋喃唑酮残留监测的 靶化合物[3]。 目前关于 AOZ检测常用的主要有仪器法和酶联 基金项目:天津市科技攻关,淡水水产品健康养殖技术研究与示范 作者简介:徐蓓(1981-),女,在读硕士,研究方向:营养与食品卫生。 通讯作者:王硕(1969-),教授,博士生导师,研究方向:食品安全和 免疫学检测。 检测 145 食品研究与开发2007.Vol.28.No.12 图1 呋喃唑酮、呋喃唑酮代谢物(AOZ)和AOZ衍生物(半抗原)的 化学结构 a.呋喃唑酮b.3-氨基-2-恶唑烷酮c.AOZ与对醛基苯甲酸形成 的衍生物 Fig.1 Chemicalstructuresofthefuralidone,itsmarkerresidue AOZandtheimmunogenhaptenCPAOZ a.Furalidoneb.AOZc.CPAOZ 免疫吸附分析法(ELISA)。仪器法有 LC/UV分析和 LC/MS、LC/MS/MS确证法[4-7],但这些方法所需仪器价 格昂贵,对操作人员的要求较高,难于推广;酶联免疫 吸附分析法有间接酶联免疫法检测呋喃唑酮[8],但实验 过程较繁琐,所需时间较长;也有直接酶联免疫法检测 AOZ的衍生物[9]。因此,本试验采用对醛基苯甲酸对 AOZ进行衍生为CPAOZ(见图1c)来作为半抗原,再与 载体蛋白连接制成免疫原制备多克隆抗体后,用直接 竞争酶联免疫法进行检测,以得到较高的灵敏度,可作 为用衍生AOZ方法进行检测的参考。 1 材料和方法 1.1 材料 牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白 (OVA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂:Sigma公司; 蛋白 A琼脂糖凝胶 ProteinA-Sepharose4B:Amersham 公司;辣根过氧化氢酶(HRP):Roche公司;羊抗兔IgG- 辣根过氧化物酶(HRP):华美生物工程公司;透析袋: 德宇生物技术有限公司;过氧化氢脲、四甲基联苯二胺 (TMB):Sigma公司;碳酸二甲酯(DMC)、β-羟乙基肼、 甲醇钠、对醛基苯甲酸:Sigma公司;N,N-二甲基甲酰 胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N-二环己基碳二亚 胺(DCC):Sigma公司;其他试剂均为分析纯; 洗板机:美国 BIO-RAD;酶标仪:Thermo公司;超 纯水系统:美国 MILLIPORE公司;回旋式振摇器- MS2:IKA公司;离心机:Eppendorf公司;恒温磁力搅拌 器:美国IKA公司。 1.2 常用溶液 包被缓冲液为 0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓 冲液,pH9.6;洗涤溶液为含 0.05%Tween-20的 PBS 溶液;封闭液为 1%BSA(溶解于 PBS中);样本稀释液 为PBS,pH7.4;底物液为TMB-过氧化氢脲溶液;终止 液为1.25mol/L的H2SO4溶液。 1.3 半抗原的合成 1.3.1 3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的合成 25mL三口烧瓶中加入 1.26mLDMC、0.68mLβ- 羟乙基肼、0.0243g甲醇钠、0.11mL甲醇,搅拌升温至 甲醇缓慢蒸馏,当甲醇蒸馏完毕,终止反应,即得3-氨 基-2-恶唑烷酮的合成液[10-12]。冷却至室温,加入一定 量乙醇,放于-20℃,静置至有固体析出,过滤,重结晶 3次得白色固体,即AOZ。 1.3.2 AOZ和对醛基苯甲酸(CPAOZ)的合成 在装有磁力搅拌器的圆底烧瓶中加入 1mL蒸馏 水和对醛基苯甲酸0.1076g,缓慢滴加N,N-二甲基甲 酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解,搅拌中加入 AOZ0.0510g,室温反应2h,过滤,水洗3次得白色固 体,即CPAOZ。 1.4 免疫抗原、包被抗原和酶标抗原的制备 免疫抗原为 CPAOZ-KLH偶联物,采用 DCC法: 取 CPAOZ10mg,NHS3.4mg,DCC12.4mg,溶于 260μLDMF中,室温搅拌反应 4h后,有沉淀产生, 5000r/min离心 10min,上清液为A液。称取 10mg KLH溶于 3mL0.13mol/L碳酸氢钠溶液(pH8.1)中, 即为B液。搅拌下,将A液逐滴加入到B液,4℃下搅 拌反应过夜。然后将反应液装入透析袋,用 PBS溶液 充分透析。 包被抗原为 CPAOZ-OVA偶联物,酶标抗原为 CPAOZ-HRP偶联物,制备方法同免疫抗原的制备 方法。 1.5 抗体的制备 1.5.1 免疫程序 选取健康的日本大耳白兔,雄性,体重 2.0kg。初 次免疫用免疫抗原加等量弗氏完全佐剂混合乳化后免 疫,采用多点皮内和肌肉注射。加强免疫用免疫抗原加 等量弗氏不完全佐剂混合乳化后免疫。分别于初次免 疫后2周、4周、8周、12周、16周加强免疫,共5次,分 别于第3、4、5、6次免疫后10d,耳静脉采血测定抗体 效价,当抗血清效价达到最高 (第 4次采血)时采用股 动脉采血法处死兔子。 1.5.2 抗血清效价的测定(间接酶联免疫检测法) (1)包被抗原:用包被液稀释包被原,在酶标板上 Furazolidone AOZ CPAOZ b a c H C 检测分析 146 食品研究与开发 2007.Vol.28.No.12 加入包被原溶液(100μL/well),于室温下温育过夜。然 后弃去孔中液体,并用PBST洗液洗板3次。(2)封闭: 室温下用封闭液(200μL/well)封闭 1h,弃封闭液,并 用PBST洗液洗板3次。(3)加抗血清:每列A孔作为 空白,B~H孔加入 100μL系列稀释的抗血清(溶于 PBS中),室温孵育1h,然后用PBST洗液洗板4次。 (4)加酶标二抗:每孔加入 100μL稀释度为 1:10000 羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标记物,室温孵育 30min,然后用PBST洗液洗板5次。(5)显色:每孔加 入 150μL底物液,于室温下反应 20min。(6)终止反 应:每孔加入50μL的终止液,终止反应。(7)读取OD 值:在双波长方式 (450~650nm)下用酶标仪读取OD 值。选择OD值在0.7-1.2范围内的抗血清稀释倍数, 即为抗血清效价。 1.5.3 抗体的纯化 采取免疫亲合层析法进行抗体纯化,用 Sepharose 4B-ProteinA作亲合层析介质纯化抗血清,所得的抗 体PBS透析后备用。 1.6 抗体特异性 对纯化后抗体的特异性即抗体与其他抗生素的交 叉反应程度进行测定,以抑制抗体最大结合率50%时 目标分析物的浓度IC50与其他抗生素抑制抗体最大结 合率50%时的浓度IC50′之比的百分数表示,即交叉反 应率 C.R(%)=IC50/IC50′×100,交叉反应越小,抗体特异 性越高。选择了呋喃唑酮、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、新 霉素和新霉胺进行交叉反应率的测定。 1.7 直接竞争酶联免疫检测方法 (1)包被抗体:用包被液稀释抗体,在酶标板上加 入抗体溶液(100μL/well),于室温下温育过夜。然后弃 去孔中液体,并用PBST洗液洗板3次。(2)封闭:室温 下用封闭液(200μL/well)封闭 1h,弃封闭液,并用 PBST洗液洗板4次。(3)直接竞争:每列 A孔作为空 白,B孔作为对照,C-H孔加入系列稀释的CPAOZ标样 溶液100μL和一定稀释度的酶标抗原溶液100μL,室 温孵育1h,然后用PBST洗液洗板5次。(4)显色:在每 个孔中加入150μL底物液,于室温下反应30min。(5) 终止反应:每孔添加50μL的终止液,终止反应。(6)读 取 OD值:在双波长方式(450nm~650nm)下用酶标仪 读取OD值。 2 结果与讨论 2.1 半抗原的合成 AOZ是呋喃唑酮在动物体内的代谢产物,也是残 留标示物,分子量 102,属于小分子物质,且空间结构 简单,没有免疫原性。即使偶联上蛋白质也不一定获得 针对半抗原特异性抗体,因此需要对半抗原进行衍生 修饰,衍生修饰可充分暴露半抗原的抗原决定簇。本试 验采用对醛基苯甲酸在AOZ上引入一个苯环,旨在制 备针对AOZ衍生物(CPAOZ)的特异性抗体。 AOZ作为呋喃唑酮的代谢物,是呋喃唑酮结构中 的一部分,其合成方法是在参考了大量AOZ合成的文 献和实际试验基础上得出的。首先选用DMC作为羰基 化剂,具有较大的反应活性可与β-羟乙基肼环化合成 AOZ;其次,催化剂选择甲醇钠,其用量以控制在物料 总量的 1.25%~3.00%为宜;再者,由于 DMC同 β-羟 乙基肼的反应为可逆反应,二者配比对反应结果影响 较大,故采用反应配比以控制在(1.2~1.6):1.0为佳;因 反应中有甲醇生成,需不断将反应中生成的甲醇移走, 所以反应时间以将甲醇完全蒸馏出为限;溶剂选择甲 醇,其用量为物料总量的4%左右为宜。 AOZ红外图谱(图2)所示3440cm-1、1753cm-1处 均有强吸收峰,3440cm-1为N-H伸缩振动峰,1753cm-1 为C=O伸缩振动峰,与AOZ的官能团一致。 CPAOZ红外图谱所示 2500cm-1~3000cm-1、 1737cm-1、1703cm-1、1477cm-1~1603cm-1处均有 图3 CPAOZ红外图谱 Fig.3 InfraredabsorbancespectrumofCPAOZ 图2 AOZ红外图谱 Fig.2 InfraredabsorbancespectrumofAOZ 检测分析 147 食品研究与开发2007.Vol.28.No.12 表1 抗体与CPAOZ及其他抗生素的交叉反应 Table1 Cross-reactivityofantibodywithCPAOZandother antibiotics 交叉反应率/%Cross-reactivity/% 100 1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 交叉反应药物Competitor CPAOZ 呋喃唑酮Furazolidone 氯霉素Chloramphenicol 磺胺二甲基嘧啶Sulfadimidine 新霉素neomycin 新霉胺neamin 强吸收峰,为缔合态 O-H伸缩振动峰,由于是缔合态 羟基,出现一个较宽的峰,主峰在2996cm-1,稍强的峰 出现在 2620cm-1,1737cm-1、1703cm-1为两个 C=O 伸缩振动峰,1477~1603cm-1为芳环骨架振动峰,与 CPAOZ的官能团一致,结果表明,AOZ通过衍生,成功 引入羧基。 半抗原结合比对抗体质量的影响有不同的观点, 研究证明,过多半抗原并不能得到预期结果,因为载体 上覆盖半抗原分子过多,可能不利于载体与淋巴细胞表 面结合,不能使载体引起免疫反应。从本试验结果分析, CPAOZ-KLH的结合比为25∶1,能产生特异性抗体。 2.2 曲线的绘制 以抑制率为纵坐标,CPAOZ浓度的对数值作为横 坐标做标准曲线,公式为 抑制率/%=1-A 样品-A空白 A对照-A空白! "×100 A是吸光值,从图 4中可得出:CPAOZ的 IC50= (1.2±0.2)μg/L,IC15=(0.2±0.02)μg/L。 2.3 抗体特异性 交叉反应率/%=IC50(CPAOZ)/IC50′(竞争物)×100 抗体与其他药物的交叉反应率见表1。 3 结论与展望 本研究报道了用对醛基苯甲酸对呋喃唑酮代谢物 AOZ衍生后,再与载体蛋白连接后进行免疫,得到针 对CPAOZ的多克隆抗体。其抗体通过直接竞争酶联免 疫法检测,可得检出限为0.2μg/L,且与其他抗生素药 物无交叉反应。本方法具有灵敏度较高,特异性强和耗 时短等优点,为进一步用直接竞争酶联免疫检测法检 测动物性食品中AOZ的残留提供了参考。 参考文献: [1] 宋阳威.呋喃类药物检验检疫现状及对策[J].中国动物检疫, 2003,20(3):37 [2] 周立靖,刘志祥.检测饲料中呋喃唑酮的几点经验[J].饲料工业, 2003,24(1):46 [3] 秦燕,朱柳明,庄逸林,等.水解衍生-酶联免疫分析在动物肌肉中 呋喃唑酮代谢物残留量检测中的应用[J].药物分析杂志,2005,25 (6):685-688 [4] YoshidaK,KondoF.Liquidchromatographicdeterminationoffura- zolidoneinswineserumandavianegg[J].JournalofAOACInterna- tional,1995,78(4):1126-1129 [5] RobertJ.McCracken,D.GlennKennedyDeterminationoffurazoli- doneinanimalfeedschromatographywithUVandthermospraymass detection[J]JournalofChromatographyA,1997,771:349-354 [6]RobertJ.McCracken,D.GlennKennedyDeterminationofthefura- zolidonemetabolite,3-amino-2-oxazonamone,inporcinetissuesus- ingliquidchromatography-thermospraymassspectrometryandthe occurrenceofresiduesinpigsproducedinNorthernIreland[J]Jour- nalofChromatographyB,1997,691:87-94 [7] 葛宝坤,王云凤,贺信,等.高效液相色谱法测定鸡肉、水产品中 呋喃西林和呋喃唑酮残留量的研究 [J].中国卫生检验杂志, 2002,12(6):661-662. 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