根系活力的测定

实验十二 氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定植物根系活力 一、实验目的 掌握TTC 法测定植物根系活力的原理和。植物根系与植株整个生命活动紧密相关， 其作用主要有：对地上部的支持和固定；物质的贮藏；对水分和盐类的吸收；合成氨基酸、激素等物质。因此根系的活力是植物生长的重要生理指标之一，它直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。 二、实验原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是氧化电位为80 mV 的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲腙（TTCH或TTF），比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC 被广泛地用作酶促反应实验的氢受体。根系中脱氢酶的活性强弱与根的活力成正相关。所以TTC 还原量能示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 三、设备与试剂 分光光度计，电子天平，温箱，研钵，漏斗，试管架，药勺，石英砂，50 mL三角瓶，100 mL 量筒，10 mL移液管，10 mL 刻度试管，10 mL容量瓶，10 mL、1 000 mL 烧杯。 ①乙酸乙酯（纯）或丙酮，保险粉（连二亚硫酸钠，Na2S2O4）。 ②1％ TTC 溶液：准确称取TTC 1.0 g，溶于少量水中，定容到100 mL。用时稀释至需要的浓度。 ③0.1mol/L，pH7 磷酸缓冲液 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O或31.21gNaH2PO4·2H2O配成1000ml）； 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O 配成1000ml）； 取A液39ml+B液61ml，用水稀释至200ml） ④1 mol·L－1硫酸：用量筒取比重1.84 的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1 000 mL。 四、实验步骤 （一）制作标准曲线 取0.4％ TTC 溶液0.2 mL 放入10 mL 量瓶中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙。再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200 μg·mL-1的标准比色系列，以空白作参比，在485 nm波长下测定吸光度， 绘制标准曲线。 （二）样品处理 ①称取根尖样品大约0.5g，放入称量皿中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。 ②与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上。 ③把根取出，吸干水分后放入20ml试管中加10ml甲醇（以提出甲月替）盖上筛子放于避光处静置几个小时至根为白色为准 ④用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。 六、实验结果 按下列公式计算TTC的还原量（以鲜重计），求出根活力大小。 四氮唑还原强度（mg/(g.h)）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h） 时间为保温培养时间 七、注意事项 TTC 溶液贮于棕色瓶中，避光贮存并放入冰箱中贮存，最好现配现用。 0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。 【方法】 1. 定性测定 （1）配置反应液  把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。 （2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。 2. 定量测定 （1）TTC标准曲线的制作 吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。 （2）称取根样品0.5g，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。 （3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量 验三 作物根系脱氢酶活性测定（TTC法） 一、 意义 幼根或嫩壮根，呼吸作用较强，其脱氢酶的活性也较强；而老根或黑根，呼吸作用较弱，其脱氢酶的活性则亦弱，故可通过测定作物根系脱氢酶的活性了解根系的活力，并作为诊断作物生命活动和影响作物吸收养分的障碍因素的指标。 二、原理 由于脱氢酶在中性反应条件下，可将无色的三苯基氯化四氮唑（即TTC）还原为红色的三苯基甲月替（TPF）。其酶促反应如下： 三、方法 称取鲜根1-2 g，置于试管中，注入0.4% TTC溶液和0.1 mol/L磷酸缓冲液等量混合液10 mL，使根全部浸入此溶液中，置于37℃恒温箱内，反应3小时后，加入1 mol/L 硫酸2 mL，以停止酶的作用，然后取出根，擦干水分，放入研钵中，再往研钵中加入3-5 mL乙酸乙酯和少量石英砂进行研磨，使红色的三苯基甲月替溶解出来，并小心地转入50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯继续提取三苯基甲月替至干净（无色）为止，最后加入乙酸乙酯至刻度混匀，用1 cm比色杯在波长485 nm处进行比色测定，查标准曲线，即可求出每克鲜根所生成的三苯基甲量。 四、试剂 1．三苯基氯化四氮唑0.4%。 2．0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 由0.1 mol/L磷酸二氢钾、0.1 mol/L氢氧化钠及蒸馏水按50:29.54:20.46的容积比混合而成，也可用0.1 mol/L磷酸二氢钾和0.05 mol/L硼砂溶液按6.32:3.77的容积混合而成，此缓冲溶液的pH应为7.0。 3．1 mol/L硫酸。 4．乙酸乙酯。 5．连二亚硫酸钠（Na2S2O4）新鲜干燥粉末。 6．标准曲线的绘制 吸取0.4% TTC溶液，稀释至100 mg/L，然后用吸管分别吸取0.0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mL于8支大试管中，准确地加入乙酸乙酯溶液10 mL，混匀，加入极少量的连二亚硫酸钠粉末，充分振荡，使TTC还原为红色三苯基甲月替并溶于乙酸乙酯中，以上溶液中三苯基甲月替含量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0和20.0 mg/L。用1 cm比色杯于485 nm波长处，分别测定光密度，并绘制标准曲线。 五、注意事项 1．由于脱氢酶还原三苯基氮唑的反应适于中性反应，故测定时需在中性缓冲液(pH=7)，并在暗处进行。 2．如用乙酸乙酯提出的三苯基甲月替量少或提取溶液的红色较浅，可改用25 mL的容量瓶。 nm波长处，分别测定光密度，并绘制标准曲线。 五、注意事项 1．由于脱氢酶还原三苯基氮唑的反应适于中性反应，故测定时需在中性缓冲液(pH=7)，并在暗处进行。 2．如用乙酸乙酯提出的三苯基甲月替量少或提取溶液的红色较浅，可改用25 mL的容量瓶。