枸杞多糖对家兔动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶_2和血管内皮生长因子表达的影响

牡丹江医学院学报　　2008年　　第 29卷　　第 2期 枸杞多糖对家兔动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶 - 2和 血管内皮生长因子达的影响 潘秀丽 3 　代海萍 3 　关　跃 3 　姚丽岩 (佳木斯大学　黑龙江　佳木斯　　154007) 【摘　要】　目的 :通过观察枸杞多糖 (LBP)对兔动脉粥样硬化 (AS)斑块中基质金属蛋白酶 - 2 (MMP - 2)和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响 ,来进一步探讨 LBP治疗 AS的作用及机制。方法 : 40只雄性新西兰兔随机分为 4组 :正常组、自然消退组、 高剂量 LBP组、低剂量 LBP组 ,每组 10只。正常组始终喂饲普通饲料 ;自然消退组及两组 LBP组前 10周均喂饲普通饲料 +质 量分数为 2%胆固醇 ,在后 10周 ,自然消退组喂饲普通饲料 ,高剂量 LBP组与低剂量 LBP组分别喂饲普通饲料 + 20mg/kgLBP (高 剂量组 )和 10mg/kgLBP (低剂量组 )。在第 20周末 ,分别测量总胆固醇 ( Tch)甘油三脂 ( TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL - C)、 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL - C).第 20周一次处死所有动物并观察主动脉形态学变化及应用免疫组织化学染色进行指标的检测 及分析。结果 :与正常组比 ,自然消退组 Tch、TG、HDL - C 、LDL - C明显升高 (p < 0. 05) ;两组 LBP组与自然消退组比较 , Tch、 TG、LDL - C明显降低 (p < 0. 05) , HDL - C明显升高 (p < 0. 05) ;而高剂量 LBP组与低剂量 LBP组比较无明显差异。通过免疫组 织化学染色发现 , MMP - 2和 VEGF在 AS斑块中呈阳性表达。对比于自然消退组 ,MMP - 2和 VEGF在两组 LBP组中表达明显 减少。结论 : LBP不仅能够降脂 ,它还可以减少 MMP - 2和 VEGF在 AS斑块中的表达 ,这说明 LBP能够对 AS斑块性质产生影 响 ,由此阻止动脉粥样硬化的发生发展。 【关键词】　动脉粥样硬化 ;枸杞多糖 ;血管新生 ;基质金属蛋白酶 ;斑块 ;兔 【中图分类号】　R　331. 33　　　【文献标识码】　A EFFECTS O F LYC IUM BARBANUM POLY SACCHAR ID E O N THE EXPRESS IO N O F VEGF AND MM P - 2 IN RABB IT ARTER IO SCL ERO S IS PLAQUE PAN Xiuli et al (J iamusiMedical College　Heilongjiang　J iamusi　　154007) [ Abstract] 　O bjective: To investigate the effects of Lycium Barbarum Polysaccharide (LBP) on the exp ression of VEGF and MMP - 2 in rabbit arteriosclerosis(AS) p laques for a better insight into the role and mechanism of LBP on the therapy of AS p laques. M ethods: Forty healthy New Zealand rabbitswere random ized into 4 group s: normal group, natural regressive group, high LBP group, low LBP group. There were 10 rabbits in ack group. Normal group always fed with normal diet; natural regressive group and LBP group s fed with normal diet + 2% cholesterol before 10 weeks1Natural regressive group only received normal diet after 10 weeks and LBP group s received normal diet + 20mg/kgLBP ( high LBP group) or 10mg/kgLBP ( low LBP group ). A t the end of 20 weeks, total cholesterol ( Tch) , triglyceride (TG) , high density lipop rotein cholesterol(HDL - C) , low density lipop rotein cholesterol(LDL - C) were measured, all rabbitswere sacrificed. The morphological change of aorta was observed and further quantified using im2 munohistochem istry result. Results:Compared with nomal and natural regressive group, the LBP group s’TCh TG LDL - C lowered significantly(p < 0. 05) , HDL - C increased remarkably (p < 0. 05) , but the significant changes have not happened in high LBP group compared with in low LBP group. A s found with SABC immunohistochem istry,VEGF and MMP - 2 were localized in AS p laques1Compared with natural regressive group, the LBP group s showed significantly lower level of VEGF and MM P - 2 exp ression. Conclusion: In addition to reduction of blood lip ids, LBP appeared to markedly reduce the exp ression of VEGF and MM P - 2 in AS p laques. It underlies its effection on the p laque 　　[作者简介 ]潘秀丽 (1979 - ) ,女 ,在读硕士 ,医师 ,主要从事病理学与病理生理学研究3 　牡丹江医学院在佳木斯大学在读硕士研究生 ·51·JOURNAL　OF　MUDANJ IANG　MED ICAL　COLLEGE　Vol. 29　NO. 2　2008 牡丹江医学院学报　　2008年　　第 29卷　　第 2期 quality and by which LBP can p revent the development of AS. [ Key words] 　A therosclerosis; Lycium; Barbarum; Polysaccharide; Angiogenesis; Matrix metallop roteinase; Plaque; Rabbit 　　AS是一种常见的血管病变。近年研究发现 ,相对于传 统观点 , AS斑块的性质比斑块大小有着更为重要的临床意 义 [ 1 ]。枸杞是我国传统的名贵中药也是民间食品配料。 LBP作为枸杞的有效成分之一 ,它是酸性杂多糖与多肽或蛋 白质构成的复合多糖。目前对于 LBP研究较多的是降血脂、 抗氧化及抑制炎症反应等多种功能 ,而关于 LBP能否对 AS 斑块性质产生影响尚未见报道。本实验将在以往研究的基 础上 ,通过对 VEGF和 MMP - 2的检测来进一步探讨枸杞多 糖对 AS的治疗作用及作用机制。 1　与方法 111　材料和试剂 　新西兰白兔由牡丹江医学院实验动物中 心提供 ; LBP由西安小草植物科技有限公司生产 ,其中多糖 含量约为 60 % ;胆固醇购于郑州利伟生物实业有限公司。 112　动物分组及处理 　雄性新西兰白兔 40只 ,体重 2. 0～ 2. 5kg。随机分为四组 :正常组、自然消退组、高剂量 LBP组 和低剂量 LBP组。每组 10只 ,实验期为 20周。正常组始终 喂饲普通饲料 ; 在前 10周 ,自然消退组、高剂量 LBP组和低 剂量 LBP组每日每只喂饲普通饲料 + 高胆固醇 2. 0g;在后 10周 ,自然消退组喂饲普通饲料 ;高剂量 LBP组和低剂量 LBP组分别每日每只喂饲普通饲料 + 20mg/kgLBP (高剂量 组 )和 10mg/kgLBP (低剂量组 )。动物分笼饲养 ,自由饮水。 113　样本采集及血脂及脂质过氧化指标的测定 　于第 20 周末空腹 12h～14 h后从耳缘静脉采血 3mL～4mL,低温低 速离心分离血清。采用酶法测定 Tch 、TG (上海科欣生物技 术研究所生产 ) 、LDLC和 HDLC (长春汇力生物技术有限公 司生产 ) 。以上指标测定均按各试剂盒说明书进行。 114　动脉粥样硬化斑块面积测量 　第 20周末以空气栓塞 法处死动物 ,解剖后立即将主动脉至髂动脉分叉处离断取 出 ,中性福尔马林固定 ,石蜡包埋 ,切片厚度为 5μm ,用于 HE染色和 MMP - 2VEGF免疫组织化学染色。采用病理图 像分析系统 ,计算检测指标的阳性表达。 115　免疫组织化学染色及结果判定 　用 SABC法对 VEGF 和 MMP - 2进行免疫组织化学染色 , SABC试剂盒及抗 SMC 单克隆浓缩抗体均购自武汉博士德生物公司。石蜡切 片脱蜡至水。一抗孵育时间为 4 ℃过夜。阴性对照片以 PBS替代 SMC单克隆抗体 ,显色试剂为 DAB ,显微镜下控制 显色程度 ,自来水冲洗终止反应。常规脱水、二甲苯透明、中 性树胶封片。 将免疫组织化学染色切片经高清晰度彩色医学图文分 析系统分析每组随机取 8张切片 ,每张切片选 5个视野 ,测 定 SMC阳性细胞数 (凡染棕红色者 ) 及视野内细胞总数 (按 细胞核总数计算 ) ,计算 VEGF、MMP - 2阳性表达率。 116　统计学分析 　数据以 €x ±s表示 ,用 SPSS1310软件进行 统计分析 ,组间比较用方差分析及 q检验 ,以 P < 0105判定 差异的显著性。率的比较使用 X2 检验 ,多组间比较用 X2 分 析 ,两组间比较用 X2 分割。以 P < 0. 01判定差异的显著性。 2　结 　果 211　血脂含量变化 　20周后 Tch、TG、HDL - C、LDL - C测 定结果见表 1。与正常组比 ,自然消退组 Tch、TG、HDL - C、 LDL - C明显升高 (p < 0. 05) , ;两组 LBP组与自然消退组比 较 , Tch、TG、LDL - C明显降低 (p < 0. 05) , HDL - C则明显 升高 (p < 0. 05)。而高剂量 LBP组与低剂量 LBP组比较无 明显差异。 表 1　四组血脂含量变化 组 　别 n TCh (mmol/L) TG(mmol/L) HDL - C (mmol/L) LDL - C (mmol/L) 正常组 10 2. 679 ±0. 473 0. 411 ±0. 213 0. 739 ±0. 140 1. 855 ±0. 059 自然消退 10 79. 271 ±10. 572 4. 172 ±1. 413 6. 607 ±1. 961 5. 956 ±0. 902 LBP组 (低 ) 10 43. 63 ±8. 959 2. 43 ±1. 039 9. 207 ±1. 112 4. 395 ±1. 041 LBP组 (高 ) 10 45. 38 ±7. 931 1. 744 ±1. 174 8. 83 ±1. 783 4. 97 ±0. 638 　　注 :高剂量 LBP组与低剂量 LBP组比较结果无明显差异 ( P > 0. 05) ,其余各组间比较 P < 0. 05,结果有差异。 212　主动脉病理变化 　 (2)大体观察 :正常组兔主动脉内膜 光滑 ,肉眼观察无脂质斑块形成。自然消退组兔主动脉内膜 可见明显的脂质斑块形成 ;重者整条主动脉内膜可见弥漫分 布脂质斑块形成。LBP组兔主动脉内膜虽可见脂质斑块形 成 ,较自然消退组明显下降。 (2)显微镜观察 :正常组兔主动 脉内皮完整无损伤 ,中膜平滑肌排列规整 (图 1A ) ;自然消 退组主动脉内皮细胞下间隙增宽 ,纤维帽下可见大量泡沫细 胞 ,中膜近内膜处平滑肌受压萎缩 (图 1B ) ;两组 LBP组与 自然消退组比较主动脉内膜泡沫细胞数量明显少 ,中膜平滑 肌排列紊乱不显著 (图 1C、1D)。 ·61· JOURNAL　OF　MUDANJ IANG　MED ICAL　COLLEGE　Vol. 29　NO. 2　2008 牡丹江医学院学报　　2008年　　第 29卷　　第 2期 图 1　兔主动脉内膜显微镜照片 (HE染色 , ×100) A　为正常组 , B　为自然消退组 , C　为高剂量 LBP组 , D　为低剂量 LBP组 (同图 2、图 3) 2. 3　主动脉免疫组织化学染色结果 　实验动物标本的免疫 组织化学染色和图像分析结果显示 ,正常组血管内未见棕红 色颗粒 ,内膜完整 (图 2A、图 3A ) 。自然消退组内膜呈棕红 色 ,阳性细胞数量较多。两组 LBP组与自然消退组比较 , VEGF、MMP - 2阳性表达率显著减小。测定结果见表 2。 图 2　VEGF免疫组织化学染色阳性显色 ( SABC, ×100) 图 3　MMP - 2免疫组织化学染色阳性显色 ( SABC, ×100) 表 2　VEGF和 MMP - 2免疫组化结果 组别 /指标 VEGF阳性 切片数 MMP - 2阳性 切片数 正常组 2 /40 3 /40 自然消退组 38 /40 36 /40 枸杞多糖组 (低 ) 15 /40 20 /40 枸杞多糖组 (高 ) 17 /40 18 /40 　　注 :高剂量 LBP组与低剂量 LBP组比较结果无明显差异 ( P > 0. 01) ,其余各组间比较 P < 0. 01) ,结果有差异。 3　讨 　论 本实验结果显示 :家兔 AS斑块形成后 , LBP治疗组在血 脂水平上明显低于未给予治疗组 (自然消退组 ) ,说明 LBP 有降血脂作用 ,这与以往相关的实验结果一致 [ 2 ]。而两种剂 量 LBP组之间血脂水平及 VEGF与 MMP - 2的表达差异不 显著。原因可能是一定量 ( 10mg/kg)的 LBP达到了家兔能 够吸收的极限。也可能是 LBP降血脂作用与剂量成一定比 例关系。有研究表明 , LBP对 ·OH 自由基具有低浓度清除 比高浓度清除力效果更好 [ 3 ]。本实验没有证明其清除自由 基的作用 ,但是清除自由基、抗氧化减少了脂质过氧化反应 , 这样可以减少脂质积聚 ,从而降低血脂 ,即它们是相辅相成 的。但是本实验结果没有显示低剂量 LBP作用好于高剂量 LBP。这可能与选择的剂量有关 ,有待进一步研究。 血管新生作为可能与 AS斑块稳定性相关的因素是近年 来学者们研究的一个新的热点。它存在于 AS的各个阶段 , 且新生血管的检出率随着 AS的病变发展而逐渐增多 [ 4 ]。有 报道称 , AS导致的内膜深层缺氧及炎症反应是诱导内膜新 生的主要原因 ,且新生血管密度与动脉管腔狭窄程度呈正相 关。促血管生成因子是血管新生的直接刺激因素 ,而 VEGF 是最主要的诱导血管新生的促血管生成因子 ,且许多参与 AS发生发展的生长因子及细胞因子均可影响 VEGF的表 达。本实验采用 SABC法显示 VEGF在 LBP组中表达明显 少于自然消退组 ,由此推论 LBP组新生血管数量也将少于自 然消退组。可能机制是 LBP使 AS病变减轻 ,管腔狭窄程度 变小 ,同时因枸杞多糖有抗炎作用这也从另一方面减少了血 管新生的数量 ,使许多细胞生长因子分泌减少 ,导致平滑肌 细胞和巨噬细胞分泌减少 , VEGF生成减少。同时 ,我们观察 到 VEGF主要在斑块肩部和纤维帽分布 ,而肩部是斑块较容 易破裂的部位 ,这进一步证实了新生血管对斑块稳定性起到 了至关重要的作用。说明 LBP可以通过抑制血管新生而稳 定斑块 ,延缓斑块进一步发展。 细胞外基质对于 AS斑块稳定性同样至关重要。这是由 于斑块的纤维帽主要由细胞外基质组成 ,而纤维帽薄而不均 匀是不稳定斑块的主要特征。MMPs可以消化裂解细胞外基 质成分并影响基质重塑 ,所以它在维持这一平衡中发挥了重 ·71·JOURNAL　OF　MUDANJ IANG　MED ICAL　COLLEGE　Vol. 29　NO. 2　2008 牡丹江医学院学报　　2008年　　第 29卷　　第 2期 要作用 . MMPS是由巨噬细胞和其他多种细胞分泌的内肽酶 家族 ,在中性 PH条件下 ,依赖锌离子和钙离子为辅助因子而 激活. MMP - 2被称为明胶酶 A,主要降解非纤维状的胶原纤 维和弹性纤维蛋白 ,在正常动脉平滑肌中 MMP - 2主要以酶 原形式存在 ,而在 AS斑块中含有较多的酶原和激活的 MMP - 2,他是目前较为肯定的与 AS密切相关的基质金属蛋白酶 之一. 实验结果表明 LBP减少了 AS斑块中 MMP - 2的表达 数量。可能机制是 ( 1) LBP能够降血脂、抗氧化。它一方面 减少胆固醇在血管壁继续沉积 ,从而减轻 AS的病变程度 ;另 一方面能够刺激细胞分泌 MMP - 2的多种细胞因子或氧化 型低密度脂蛋白含量减少。这些因素使巨噬细胞和平滑肌 细胞减少分泌 MMP - 2从而维持细胞外基质代谢平衡。 (2) LBP能够抑制炎症反应 ,这使得血管内膜损伤减少 ,抑制一 些黏附分子和炎性介质的作用 ,从而抑制了动脉中膜平滑肌 移入内膜发生表型转化并增殖 ,这即能够减少胶原物质的合 成和分泌 ,又能抑制 MMP - 2的生成。当然这些机制还有待 进一步证实。 参考文献 1　V irmaniR, KolodgieFD, BurkeAP, etal. Lessons Fron Sudden Coronary Death: A Comp rehensive Morphological Classification Scheme For A th2 erosclerotic Lesions [ J ]. A rterioscler Thromb Vasc B iol, 2000, 20: 1262 - 1275. 2　曲红 ,王德山. 枸杞多糖的药理及临床研究概况 [ J ]. 山东医药工 业 , 2002, 21 (4) : 36. 3　倪慧 1EPR技术研究枸杞多糖清除 ·OH 自由基作用 [ J ]. 中药 材 , 2004, 27 (8 ) : 599 - 600. 4　Chen YX, Nakashima Y, Tanaka K, et al. Immunohistochem ical ex2 p ression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary arteries [ J ]1A rteriscler Thromb Vasc biol, 1999, 19: 131 - 139. 5　李志强 ,成永霞 ,韩立林. MMP - 13在家兔动脉粥样硬化斑块中 表达的研究 [ J ]. 牡丹江医学院学报 , 2006, 27 (4) : 1 - 3. 收稿日期 : 2008 - 02 - 20 环苯扎林的合成研究 袁晓环 　关成坤 　杨旭东 (牡丹江医学院黑龙江省普通高校重点实验室 　黑龙江 　牡丹江 　　157011) 【摘 　要 】　目的 :探讨合成环苯扎林的简捷有效的方法。方法 :首先以二苯并环庚烯酮为反应物进行溴化反应可产生溴代二 苯并环庚烯酮 ,可再经三乙基胺直接得到 5H -二苯并 [ a, d ]环庚三烯 - 5 - 酮。以 1, 3 - 二溴丙烷为起始物制得溴磷化合物 (3 -溴 -三苯基磷丙烷 )后 ,再以双甲基胺处理可得 3 - N, N - 二甲基 - 三苯基磷丙胺随后以胺基钠作用所产生的红色的魏 悌希试剂再与 5H -二苯并 [ a, d ]环庚三烯 - 5 -酮进行双键合成反应 ,即可得到产物环苯扎林。结果 :通过魏悌希反应进行 会聚式合成可得到纯度 95% ,产率 76%的环苯扎林。结论 :本方法原料易得 ,总收率高 ,是理想的工业化生产路线。 【关键词 】　环苯扎林 ; 魏悌希反应 ;二苯并环庚烯酮 ; 5H -二苯并 [ a, d ]环庚三烯 - 5 -酮 【中图分类号 】　R　96　　　【文献标识码 】　A STUD IES O N SY NTHES IS O F CYCLO BENZAPR INE Yuan Xiaohuan et al ( The Key Lab1of the Heilongjiang Provincial O rdinary College, Mudanjiang Medical College　Heilongjiang　M udanjiang　157011) [ Abstract] 　O bjective: To study the synthesis of cyclobenzap rine. M ethods: A t first, synthesis the brom ine - dibenzosuberenone with dibenzosuberone as raw materials1Then, we gat dibenzosuberenone via the reaction with Et3N1Synthesis the p rofenofoscompounds(3 - bromop ro - pyltriphenylphonium brom ide) with113 - dibromop ropane as a starting material, then under the double the double - am ine can available 3 - dimethylam inop ropyltripheny2 lphonium brom ide1Followed by am ino sodium arising from the red W ittig reagent react with 5H - 2benzo[ a, d ]cyclo2 hep tatriene - 5 - one for molecular synthesis reaction p roducts could be obtained Cyclobenzap rine. Results: It could get the Cyclobenzap rine of 95 percent purity and 76 percent yield by W ittig reaction convergence synthesis. Conclu2 sion: This method avoided using expensive reagents with a high overall yield, it was a good method to p roduce cyclo2 benzap rine. 　　[作者简介 ]袁晓环 , (1969 - ) ,女 ,副教授 ,硕士 ,从事药物分析工作。 ·81· JOURNAL　OF　MUDANJ IANG　MED ICAL　COLLEGE　Vol. 29　NO. 2　2008