HPLC 法测定洛莫司汀-碘海醇复方脂质体的药物含量及包封率

- 38 - Drug Evaluation Research, Vol.32 No.1, August 2009 HPLC 法测定洛莫司汀-碘海醇复方脂质体的药物含量及包封率 杨硕晔 1，王杏林 2，杨志强 2 * ，司端运 2 1 河南大学药学院，河南 开封 475001 2 天津药物研究院，天津 300193 摘 要 目的：建立 RP-HPLC 法测定洛莫司汀-碘海醇复方脂质体中药物的含量及包封率。方法：使用 DiamonsilTM（钻 石）C18 色谱柱（200 mm × 4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈 - 水（65︰35），柱温 25 ℃，体积流量 1.0 mL/min， 检测波长为 230 nm，鱼精蛋白凝聚法分离游离药物，测定复方脂质体中洛莫司汀的含量及包封率；使用 Diamonsil TMC18 色谱柱（200 mm × 4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇 - 水（10︰90），柱温 25 ℃，体积流量 1.0 mL/min， 检测波长为 244 nm，鱼精蛋白凝聚法分离游离药物，测定复方脂质体中碘海醇的含量及包封率。结果：洛莫司汀 与辅料及溶剂峰分离良好，在 1.0 ~ 20.0 µg/mL 线性关系良好（r = 1.0, n = 5），回收率为 99.0 % ~ 101.0 %；碘海 醇与辅料及溶剂峰分离良好，在 6.0 ~ 60.0 µg/mL 线性关系良好（r = 0.999 9, n = 5），回收率为 99.0 %~ 101.0 %。 结论：该方法准确、简单，可用于洛莫司汀-碘海醇复方脂质体含量及包封率的测定。 关键词 洛莫司汀；碘海醇；复方脂质体；含量测定；包封率；鱼精蛋白凝聚法 中图分类号：R927.2 TQ460.72 文献标志码：A 文章编号：1674–6376（2009）01–0038–05 Determination of content and entrapment efficiency of lomustine-iohexol compound liposomes by HPLC YANG Shuo-ye1, WANG Xing-lin2, YANG Zhi-qiang2*, SI Duan-yun2 1 Pharmaceutical College of Henan University, Kaifeng 475001, China 2 Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract Objective: To establish an HPLC method for determining the content and entrapment efficiency of lomustine-iohexol compound liposomes. Methods: The separation was performed with a Diamonsil TM C18 column（200 mm × 4.6 mm, 5 µm）, the mobile phase was acetonitrile-water（65∶35）, the drug was detected at 230 nm wavelength and the flow rate was 1.0 mL/min, with column temperature of 25℃, protamine aggregation method was applied to separating the free drug and liposomes, for determining the content and entrapment efficiency of lomustine；the separation was performed with a DiamonsilTM C18 column（200 mm × 4.6 mm, 5 µm）, the mobile phase was methanol-water（10∶90）, the drug was detected at 244 nm wavelength and the flow rate was 1.0 mL/min, with column temperature of 25 ℃, protamine aggregation method was applied to separating the free drug and liposomes, for determining the content and entrapment efficiency of iohexol. Results: Lomustine and iohexol can be well separated with a good linear relationship in the rages 收稿日期：2009-06-10 基金项目：国家 973 科技（2006CB933303） 作者简介：杨硕晔（1983），男，河南省平顶山市人，河南大学硕士研究生，专业方向为药物制剂。 Tel: 15822947270；E- mail: wangyufeng345@163.com * 通讯作者：杨志强 Tel:（022）23006885； E- mail: yangyqss@sina.com 药物评价研究 第 32 卷 第 1 期 2009 年 8 月 - 39 - of 1.0 — 20.0 µg/mL（r = 1.0, n = 5）and 6.0 — 60.0 µg/mL（r = 0.999 9, n =5）, their average recoveries were both between 99.0 % — 101.0 %, respectively. Conclusion: This method is accurate and simple, and can be well used to determine the contentand entrapment efficiency of lomustine-iohexol compound liposomes. Key words compound liposome; content determination; entrapment efficiency; iohexol; lomustine; protamine aggregation method 洛莫司汀（lomustine）为亚硝基脲类烷化剂， 具有广谱抗肿瘤作用，临床主要用于治疗脑瘤、恶 性淋巴瘤、肺癌及恶性黑色素瘤等。目前，其临床 应用的剂型主要是胶囊剂，该剂型不良反应较为严 重，主要为消化道不良反应及迟发的骨髓抑制[1]。 碘海醇（iohexol）是常用非离子造影剂，具有水溶 性大、粘度小、渗透压低等优点，在临床中主要应 用于脊髓造影、血管造影、CT 增强、泌尿系统造 影、骨关节及淋巴管造影[2]。将碘海醇和洛莫司汀 一起包封，制成复方脂质体，通过造影明确肿瘤部 位，确定脂质体到达时间，同时同步在肿瘤内定位 释放化疗药物洛莫司汀，从而提高了疗效，避免了 全身化疗的副作用。本研究采用 RP-HPLC 法分别 测定复方脂质体中洛莫司汀和碘海醇的含量及包 封率，专属性强，操作简单。 1 仪器与试药 LabAlliance 高 效 液 相 色 谱 仪 ， 包 括 ： Series1500 泵、As3000 自动进样器、Model 500 检 测器、HT-230A 柱温箱、Anastar 色谱工作站； SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有 限公司）；Auto Science AS3120 超声清洗仪（天津 特纳科学仪器厂）；KA-1000 低速台式离心机（上 海安亭科学仪器厂）。 洛莫司汀对照品（质量分数 99.6 %，山东潍坊 制药厂）；碘海醇对照品（质量分数 99.4 %，浙江 司太立制药有限公司）；洛莫司汀-碘海醇复方脂 质体（自制，批号 081102、0081103、081105，含 洛莫司汀 1 mg/mL，碘海醇 240 mg/mL）；硫酸鱼 精蛋白注射液（上海第一生化药业有限公司）；乙 腈（色谱纯，美国 Fisher 公司）；甲醇（色谱纯， 天津市康科德科技有限公司）。 2 方法与结果 2.1 溶液配制 洛莫司汀对照品溶液：精密称取洛莫司汀对照 品适量，用甲醇溶解稀释得质量浓度 10 µg/mL 的 对照品溶液。 洛莫司汀供试品溶液：精密吸取复方脂质体1 mL （相当于洛莫司汀 1 mg）置 100 mL 量瓶中，加 甲醇溶解并定容，摇匀即得。 洛莫司汀对照品储备液：精密称取洛莫司汀对 照品适量，用甲醇溶解稀释得质量浓度为 20 µg/mL 的对照品储备液。 碘海醇对照品溶液：精密称取碘海醇对照品适 量，用流动相溶解稀释成质量浓度为 24 µg/mL 的 对照品溶液。 碘海醇供试品溶液：精密吸取复方脂质体 1 mL （相当于碘海醇 240 mg）置 100 mL 量瓶中，加 甲醇溶解并定容，摇匀。精密量取 1 mL 置 100 mL 量瓶中，加流动相定容，摇匀即得。 碘海醇对照品储备液：精密称取碘海醇对照品 适量，用甲醇溶解稀释得质量浓度为 60 µg/mL 的 对照品储备液。 2.2 洛莫司汀的含量及包封率测定 2.2.1 色谱条件与系统适应性实验 色谱柱为 DiamonsilTM C18（4.6 mm × 200 mm， 5 µm），流动相为乙腈 - 水（65︰35），柱温 25℃， 体积流量 1.0 mL/min，检测波长 230 nm，进样量 20 µL。理论塔板数按洛莫司汀峰计为 7 600。 2.2.2 专属性考察 分别取洛莫司汀对照品溶液、空白脂质体（按 复方脂质体制备处方及工艺，不加入洛莫司汀制得） 破乳溶液（吸取空白脂质体 1 mL 置 100 mL 量瓶 中，加甲醇破乳溶解并定容，摇匀即得）、复方脂 质体破乳溶液进样，色谱图见图 1。由图 1 可知， - 40 - Drug Evaluation Research, Vol.32 No.1, August 2009 图 1 洛莫司汀对照品溶液（A）、空白脂质体破乳溶液（B）、复方脂质体破乳溶液（C）的色谱图 Fig 1 Chromatograms of lomustine standard（A）, blank liposome（B）and compound liposomes（C） 洛莫司汀的保留时间为 7.7 min，碘海醇及辅料的 出峰时间在 3 min 以内，不干扰测定。 2.2.3 曲线制备 取洛莫司汀对照品适量，加甲醇制成 1.0、2.0、 4.0、10.0、20.0 µg/mL 的系列溶液，分别测定，以 洛莫司汀浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归， 得标准曲线方程：A = 1.348 3 × 104 C － 1 666.8, r = 1.0。结果表明，在 1.0 ~ 20.0 µg/mL洛莫司汀质量 浓度与峰面积线性关系良好。 2.2.4 重复性实验 精密吸取同一批号的复方脂质体样品适量，共 6 份，按“2.1”项下方法制得洛莫司汀供试品溶液， 进样测定，计算得洛莫司汀含量的 RSD 为 0.48％。 2.2.5 回收率实验 按处方比例取空白脂质体 0.1 mL 于 10 mL 量瓶中，共 15 份，分别精确加入 4.0、5.0、6.0 mL 洛莫司汀对照品储备液，各 5 份，用甲醇定容， 摇匀，得质量浓度为 8.0、10.0、12.0 µg/mL 的样 品溶液，进样测定。另取洛莫司汀对照品溶液进 样测定，计算回收率分别为 99.6 ％、99.9 ％和 100.2 ％，RSD（n = 5）分别为 1.26 ％、0.98 ％ 和 1.14 ％。 2.2.6 稳定性实验 取供试品溶液（洛莫司汀质量浓度为 10 µg/mL） 2 份分别置避光与光照环境（强度为 2 000 LX）中， 于 0、1、2、4、6、8、12 h 测定洛莫司汀的含量， 结果发现，在避光环境中洛莫司汀的含量 12 h 内 基本不变，峰面积的 RSD 为 0.23 %，而在光照环 境中洛莫司汀的含量 12 h 内下降了约 20 %，因此 在测定过程中须注意样品溶液的避光操作。 2.2.7 鱼精蛋白凝聚法的回收率测定 配制低（80 %）、中（100 %）、高（120 %） 浓度的洛莫司汀氯仿溶液（以氯仿为溶剂配制）各 3 份，60℃ N2 吹干，分别加入空白脂质体适量使 混合均匀，得脂质体混悬液。分别吸取脂质体混悬 液 100 µL，加入 100 µL 鱼精蛋白注射液，混匀，放 置约 3 min，精确加入 5.0 mL 纯净水，离心 15 min （相对离心力 350 × g），取上清液进样，记录峰 面积。计算得回收率分别为 97.2 ％、95.8 ％和 98.1 ％， RSD（n=9）为 1.58 ％。 2.2.8 洛莫司汀含量测定 分别取洛莫司汀对照品溶液和洛莫司汀供试 品溶液进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算 洛莫司汀含量。3 批供试品中洛莫司汀标示含量分 别为 102.3 ％、100.9 ％和 102.6 ％，RSD（n = 5） 分别为 1.42 ％、2.18 ％和 1.56 ％。 2.2.9 复方脂质体中洛莫司汀的包封率测定 采用鱼精蛋白凝聚法分离脂质体[3]。精密吸取 复方脂质体 100 µL 于离心管中，加鱼精蛋白注射 液 100 µL，振摇混匀，放置约 3 min，精确加入 5.0 mL 纯净水，离心 15 min（相对离心力 350×g）, 取 上清液进样，记录峰面积，由标准曲线计算游离药 物的浓度（C1）；另精密吸取复方脂质体 100 µL， 置 10 mL 容量瓶中，加入 5 mL 甲醇溶解，摇匀， A B C t/min t/min t/min 药物评价研究 第 32 卷 第 1 期 2009 年 8 月 - 41 - 进样测定峰面积，由标准曲线计算药物总浓度（C0）。 按包封率=（1 - C1/ C0）× 100 ％，计算得 3 批样品 的洛莫司汀包封率分别为 78.7％、75.4％和 72.9％。 2.3 碘海醇的含量及包封率测定 2.3.1 色谱条件与系统适应性实验 色谱柱为 DiamonsilTM C18（4.6 mm × 200 mm， 5 µm），流动相为甲醇 - 水（10︰90），柱温25 ℃， 流速1.0 mL/min，检测波长244 nm，进样量为20 µL。 理论塔板数以碘海醇峰计为 8 500。 2.3.2 专属性考察 分别取碘海醇对照品溶液、空白脂质体（按复 方脂质体制备处方及工艺，不加入碘海醇制得）破 乳溶液、复方脂质体破乳溶液进样，色谱图见图 2。 由图 2 可知，碘海醇（以峰 2 计，峰 1 为其无药 用效果的对映体）的保留时间约为 10 min，洛莫司 汀及辅料无明显色谱峰，不干扰测定。 2.3.3 标准曲线制备 取碘海醇对照品适量，加甲醇制成浓度为 6.0、 12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 µg/mL 的系列溶液， 分别进样测定，以碘海醇浓度为横坐标，峰面积为 纵坐标进行回归，得标准曲线方程：A = 1.568 2 × 104 C － 4 013.2, r = 0.999 9。结果表明在 6.0 ~ 60.0 µg/mL 与峰面积线性关系良好。 2.3.4 重复性实验 精密吸取同一批号的复方脂质体样品适量，共 6 份，按“2.1”项下方法制得碘海醇供试品溶液， 进样测定，计算得碘海醇含量的 RSD 为 1.12％。 图 2 碘海醇对照品溶液（A）、空白脂质体破乳溶液（B）、复方脂质体破乳溶液（C）的色谱图 Fig 2 Chromatograms of iohexol standard（A）, blank liposome（B）and compound liposomes（C） 2.3.5 回收率实验 按处方比例取空白脂质体 0.1 mL 于 100 mL 量 瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀。吸取 1.0 mL 置 于 3 个 10 mL 量瓶中，共 15 份。分别精确加入 3.2、4.0、4.8 mL 碘海醇对照品储备液，用流动相 定容，摇匀即得质量浓度为 19.2、24.0、28.8 µg/mL 的样品溶液，进样测定。另取碘海醇对照品溶液进 样，记录峰面积，计算回收率分别为 99.8％、99.5％ 和 99.2 ％，RSD（n=5）分别为 1.43 ％、1.26 ％ 和 0.58 ％。 2.3.6 鱼精蛋白凝聚法的回收率测定 配制低（80%）、中（100 %）、高（120 %）浓 度的碘海醇水溶液各 3 份，分别加入空白脂质体适 量使混合均匀，得脂质体混悬液。测定鱼精蛋白凝 聚法的回收率（操作同洛莫司汀的鱼精蛋白凝聚法 回收率测定），结果分别为 98.5 %、97.4 %、96.8 %， RSD（n=9）为 1.42 %。 2.3.7 碘海醇含量测定 分别取碘海醇对照品溶液和碘海醇供试品溶 液进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算碘海醇 含量。3 批供试品中碘海醇标示含量分别为 101.6％、 98.9％和 99.4％，RSD（n=5）分别为 2.34％、1.76％ 和 1.25％。 2.3.8 复方脂质体中碘海醇的包封率测定 采用鱼精蛋白凝聚法分离脂质体。按“2.2.9” 项下方法分离游离药物和脂质体，取上清液 100 µL 置 25 mL 量瓶中，加入流动相定容，摇匀，进样， 记录峰面积，由标准曲线计算游离药物的浓度（C1）； A B C t/min t/min t/min - 42 - Drug Evaluation Research, Vol.32 No.1, August 2009 另精密吸取复方脂质体 100 µL 置 10 mL 量瓶中，加 甲醇溶解并定容，摇匀，精密量取 100 µL 置 10 mL 量瓶中，加入流动相定容，摇匀，进样测定峰面积， 由标准曲线计算药物总浓度（C0）。按包封率=（1 - C1/ C0 × 1.25）× 100 ％，计算 3 批样品得碘海醇 包封率为 68.7％、65.4％、62.9％。 3 讨论 曾尝试采用同一种色谱条件同时测定洛莫司 汀和碘海醇，但由于碘海醇易溶于水，而洛莫司汀 水溶性差，两者的极性差别使保留时间相差很大。 此外，由于处方中洛莫司汀和碘海醇浓度差别很大 （洛莫司汀质量浓度为 1 mg/mL，碘海醇质量浓 度为 240 mg/mL），在同一色谱条件下很难同时准 确定量测定。因此，最终选择在两种色谱条件下， 分别测定洛莫司汀和碘海醇。 脂质体预处理，曾尝试采用葡聚糖凝胶过滤 法、透析法和超速离心法。结果显示，由于洛莫司 汀难溶于水，采用葡聚糖凝胶过滤法很难将游离的 洛莫司汀从凝胶柱上洗脱，收集组分至 2 h，游离 的洛莫司汀仍未完全流出；采用透析法，在 2 h 后 观察，发现游离的洛莫司汀与脂质体仍未完全分离， 且每次试验需消耗介质 5 L 以上；超速离心法对设 备要求较高，离心 1 h（相对离心力 20 000 × g），仍 不能将样品中的脂质体完全沉淀。鱼精蛋白凝聚法 是通过絮凝作用增加脂质体密度，在较低转速下就 可达到有效分离[4]。实验证明该法简单、快速，且分 离效果好、回收率更稳定。故最终选用。 参考文献： [1] 上海医药工业研究院合成药研究室．环己亚硝脲 （CCNU）.医药产品介绍[J]．医药工业，1975（5） : 33- 34． [2] 肖友梅，陈惠娟，彭秀珍．非离子造影剂碘海醇的应 用[J]．中国临床医药研究杂志，2003, 10 (2) : 44． [3] [英] Torchilin V P, Weissig V 编，邓意辉，徐晖主译. 脂 质体（第 2 版）[M]．北京：化学工业出版社，2007． [4] 李红茹，李淑芬.脂质体中药物包封率的测定方法[J]. 药物分析杂志，2007，27（11）:1844-1845. 《药物评价研究》第一届编委会会议通知 金秋十月，丹桂飘香，中华人民共和国 60 华诞之际，恰值《药物评价研究》的主办单位之一——天 津药物研究院建院 50 周年之时，同时也是我院《中草药》杂志创刊 40 周年、《中草药》英文版——《Chinese Herbal Medicines》创刊和刘昌孝院士创建药代动力学实验室 40 周年的大日子。兹定于 10 月 22~25 日在天 津举行庆典和学术活动。届时，《药物评价研究》杂志将召开第一届编委会，现诚邀编委与审稿专家光临 指导；同时也欢迎广大医药工作者参加学术会议。联系电话 022-23006822，邮箱：ywpjyj@126.com，详 情请见www.tjipr.com. 《药物评价研究》编辑部 2009 年 8 月