SNT 2733-2010 小反刍兽疫检疫技术规范

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 !" ! #!"## " !$%$ 小反刍兽疫检疫技术规范 $ %&'&()*(+ , '-)-.&/0-' , +1)+2+1 , +)*)1'%3*(&()1 !$%$4%%4$% 发布 !$%%4$&4$% 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：董俊、杨建民、严树发、杨云庆、艾军、叶玲玲、徐自忠、花群义、周晓黎。 Ⅰ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 小反刍兽疫检疫技术规范 １　范围 本标准规定了小反刍兽疫的病原分离及鉴定、聚合酶链式反应、血清抗体中和试验、酶联免疫吸附 试验检测。 本标准适用于小反刍兽疫的诊断和流行病学调查。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 小反刍兽疫　狆犲狊狋犲犱犲狊狆犲狋犻狋狊狉狌犿犻狀犪狀狋狊；犘犘犚 由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎 为特征。 ４　疾病简介 参见附录Ａ。 ５　现场检验检疫及采样 ５．１　现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。 ５．２　采样：按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。 ６　诊断方法 ６．１　病毒分离、鉴定（生物安全三级实验室进行） ６．１．１　试剂和 ６．１．１．１　小反刍兽疫标准阳性、阴性血清。 ６．１．１．２　细胞：羊肾原代细胞或非洲绿猴肾细胞（ＶＥＲＯ）。 ６．１．１．３　培养液：１９９或 ＭＥＭ 培养基中加１０％犊牛血清（经 ５６ ℃ ３０ ｍｉｎ灭能），含青霉素 ２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。 １ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．１．１．４　维持液：１９９或 ＭＥＭ 培养基中加２％的犊牛血清（经５６ ℃ ３０ｍｉｎ灭能），含青霉素 ２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。 ６．１．１．５　细胞分散液：配制见附录Ｂ。 ６．１．１．６　犊牛血清：不含细菌、支原体，５６℃灭能３０ｍｉｎ。 ６．１．１．７　ＰＢＳ缓冲液：配制见附录Ｂ。 ６．１．２　设备 ６．１．２．１　超净工作台。 ６．１．２．２　乳钵或组织捣碎器。 ６．１．２．３　倒置显微镜。 ６．１．２．４　二氧化碳培养箱。 ６．１．２．５　可调单头微量移液器（０．５μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。 ６．１．２．６　冷冻微量离心机。 ６．１．２．７　２４孔、９６孔细胞培养板。 ６．１．２．８　微型振荡器。 ６．１．３　样品采集 ６．１．３．１　活体动物采集眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子。采集全血时加肝 素抗凝剂。死亡动物，解剖尸体２头～３头，取淋巴结，特别是肠系膜和支气管淋巴结，脾和肠粘膜也应 采集。采集后立即密封、冷藏送检或置含抗生素的ＰＢＳ缓冲液中－２０℃密封保存。编号和作好记录。 ６．１．３．２　眼睑下结膜分泌物和鼻腔、颊部及直肠粘膜病料拭子：用拭子采取分泌物，拭子一并放入盛有 １．０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ缓冲液的１．５ｍＬ离心管中。编号，冷藏送检或低温密封保存。 ６．１．３．３　血液：无菌、肝素抗凝采集，密封、编号后保存于４℃送检。 ６．１．３．４　组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，密封、冷藏送检或低 温密封保存。 ６．１．３．５　精液：抽检的精液样品应不少于１ｍＬ，冻精样品每头每批次取样３管～５管，编号，置冰盒 送检。 ６．１．４　样品贮运 样品采集后，按批次放入密闭的采样袋内，低温、密封，送实验室。 ６．１．５　样品处理 ６．１．５．１　眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子 收到棉拭子样品后，５００μＬＰＢＳ溶解，样品振荡混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，经 ４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为组织培养的接种材料，编号备用。 ６．１．５．２　组织脏器 取待检样品２．０ｇ于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加１０ｍＬ细胞维持液混匀，４ ℃ ５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液转入无菌的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 ６．１．５．３　精液 用维持液将精液作１∶５稀释，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为接种分离病毒的材料。 ２ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．１．５．４　血液样品 ４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用移液器吸出血浆（不要破坏白细胞层），补充ＰＢＳ至原体积，轻轻 倒转试管几次：４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液（保留白细胞层）。加入等量无菌的去离子水， 轻轻倒转试管几次，使血细胞溶解；或用４０μＡ的超声波１ｍｉｎ打碎红血球，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，取上清液转入无菌的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 ６．１．６　病毒培养 ６．１．６．１　按常规方法制备羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞单层。 ６．１．６．２　样品接种：取经处理过的样品接种到已形成良好单层的羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞的２４孔 培养板中。每份样品接种４孔，每孔０．５ｍＬ。于３７℃吸附１ｈ，倾去接种液，用维持液洗１次～２次， 最后加入维持液１ｍＬ。置３７℃５％二氧化碳培养箱培养，逐日观察细胞病变；若５ｄ仍不致细胞病变， 则反复冻融３次，收取培养物继代于新制备的细胞上盲传３代，出现细胞病变者，收取培养物，保存于 －７０℃以下待鉴定。 ６．１．７　结果判定 ６．１．７．１　如盲传３代后无细胞病变，判为阴性。 ６．１．７．２　本病毒在羔羊肾细胞的细胞病变包括细胞变圆，细胞集合，呈葡萄串状、拉网、最后形成合胞 体。在ＶＥＲＯ上有时很难看到合胞体。 ６．１．７．３　取出现上述病变的细胞培养物，经冻融裂解两次后，以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液 作病毒中和试验。 ６．１．８　病毒中和试验 ６．１．８．１　毒价测定：方法同小反刍兽疫血清中和试验。 ６．１．８．２　分离物作病毒中和试验：用小反刍兽疫标准阳性血清和标准阴性血清（由ＯＩＥ推荐的小反刍 兽疫参考实验室提供）分别与该分离物作病毒中和试验（固定血清，稀释病毒法）。 ６．１．８．３　结果判定：能与小反刍兽疫标准阳性血清中和，使５０％以上细胞不出现细胞病变（ＣＰＥ）判为 阳性。 ６．２　聚合酶链式试验（犚犜犘犆犚） ６．２．１　试剂和材料 ６．２．１．１　ＲＮＡ提取液（Ｔｒｉｚｏｌ）。 ６．２．１．２　无水乙醇（纯）。 ６．２．１．３　ＡＭＶ反转录酶（１３Ｕ／μＬ）。 ６．２．１．４　ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）。 ６．２．１．５　ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）。 ６．２．１．６　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）。 ６．２．１．７　氯化镁（２５ｍｍｏｌ／ｍＬ）。 ６．２．１．８　引物（２５ｐｍｏｌ／μＬ）： 根据ＰＰＲ毒株编码核蛋白的Ｎ基因保守序列设计，扩增产物为３５１ｂｐ，上游引物Ｆ：５’ＴＣＴＣＧ ＧＡＡＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧ３’；下游引物Ｒ：５ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴ３’。 ６．２．１．９　焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）。 ３ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．２．１．１０　电泳缓冲液（ＴＢＥ）、溴化乙锭（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＤＥＰＣ水的配制见附录Ｂ。 ６．２．１．１１　琼脂糖（电泳级）。 ６．２．１．１２　ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００分子量标准。 ６．２．２　主要器械和设备 ６．２．２．１　离心机：低温高速离心机、微量高速离心机。 ６．２．２．２　旋涡振荡器。 ６．２．２．３　扩增仪。 ６．２．２．４　凝胶电泳仪、水平电泳槽。 ６．２．２．５　凝胶紫外检测仪。 ６．２．２．６　超声波捣碎仪。 ６．２．３　样品处理 ６．２．３．１　血液样品处理 无菌采集含１％ＥＤＴＡ的抗凝血１０ｍＬ；５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用移液器吸出血浆（不要破坏白 细胞层），补充ＰＢＳ至原体积，轻轻倒转试管几次；５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液（保留白细胞层）； 加入等量无菌、经ＤＥＰＣ处理（无ＲＮＡ酶）的去离子水，轻轻倒转试管几次，使血细胞溶解；或用４０μＡ 的超声波１ｍｉｎ打碎红血球。 ６．２．３．２　血凝块处理 无菌采集血液１０ｍＬ，凝固后取血凝块；冻融２次～３次；５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液备用。 ６．２．３．３　阳性对照样品的制备 将小反刍兽疫病毒按１０％接种羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞，于３７℃吸附１ｈ，加入维持液，３７℃ ５％二氧化碳培养箱中培养，待细胞病变（ＣＰＥ）达７５％时收获病毒悬液；冻融２次～３次，５０００ｒ／ｍｉｎ 离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。 ６．２．３．４　阴性对照样品的制备 将生长良好的羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞，冻融１次～２次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液 备用。 ６．２．４　犚犖犃的提取 ６．２．４．１　在样品处理区进行（除本标准规定的方法外，也可采用其他等效的ＲＮＡ提取方法，具体操作 见有关试剂说明书）。所有ＲＮＡ提取器皿用ＤＥＰＣ水浸泡２４ｈ，灭菌后方可使用。 ６．２．４．２　取狀个１．５ｍＬ灭菌离心管，其中狀为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每 管进行编号标记。 ６．２．４．３　每管加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ，然后分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各２５０μＬ，混匀，静置 ５ｍｉｎ；再加入２００μＬ三氯甲烷，混匀，静置５ｍｉｎ，于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。 ６．２．４．４　取相同数量的１．５ｍＬ灭菌离心管，加入５００μＬ异丙醇（－２０℃预冷），对各个管进行对应编 号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液吸取约５００μＬ（注意不要吸出中间白色 絮状层），颠倒均匀。 ６．２．４．５　于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。取出离心管，轻轻倒去上清液，加入１ｍＬ７５％乙 ４ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 醇，颠倒洗涤。 ６．２．４．６　于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。取出离心管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上， 吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。 ６．２．４．７　每管加入２０μＬ灭菌ＤＥＰＣ水，轻轻混匀，溶解管壁上的ＲＮＡ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ，冰上保 存备用。提取的ＲＮＡ应在２ｈ内进行ＲＴＰＣＲ扩增或放置于－７０℃冰箱备用。 ６．２．５　反转录合成犮犇犖犃 ６．２．５．１　ＲＮＡ变性：取作好标记的离心管依次加入，随机引物（Ｎ６），２μＬ；提取的ＲＮＡ７μＬ；ＤＥＰＣ 水，５μＬ。瞬时离心；７０℃１０ｍｉｎ，冰浴２ｍｉｎ。３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。 ６．２．５．２　反转录：于６．２．５．１离心管中依次加入：５×反转录酶缓冲液，４μＬ；ｄＮＴＰｓ，１μＬ；ＲＮａｓｉｎ， ０．５μＬ；ＡＭＶ反转录酶，０．５μＬ。瞬时离心，４２℃／６０ｍｉｎ；７０℃／１５ｍｉｎ；冰浴３ｍｉｎ，瞬时离心，立即 进行ＰＣＲ扩增或－２０℃保存备用。 ６．２．６　犘犆犚扩增反应 ６．２．６．１　在ＰＣＲ管中依次加入以下试剂：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ，氯化镁３μＬ，ｄＮＴＰｓ１μＬ，犜犪狇 ＤＮＡ酶０．５μＬ，引物Ｆ１μＬ，引物Ｒ１μＬ，ｃＤＮＡ４μＬ，ＤＥＰＣ水，３４．５μＬ。 ６．２．６．２　反应管瞬时离心，置ＰＣＲ仪内运行下列程序：９５℃／５ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ，５５℃／３０ｓ，７２℃／３０ｓ， ３０个循环；７２℃／１０ｍｉｎ，４℃保存。 ６．２．７　犘犆犚产物的检测 ６．２．７．１　１．０％琼脂糖凝胶的制备，见附录Ｂ。 ６．２．７．２　取扩增产物８μＬ与载样缓冲液混合，分别加入凝胶孔中。恒压５Ｖ／ｃｍ～８Ｖ／ｃｍ，电泳 ３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ紫外检测仪下观察结果、照相。 ６．２．７．３　结果判定：阴性样品无条带，阳性样品有条带，扩增条带为３５１ｂｐ的条件下进行判定，如被检 样品无条带则结果为病毒核酸阴性；如被检样品有条带，其扩增产物大小为３５１ｂｐ，则判为病毒核酸阳 性（ＲＴＰＣＲ扩增参考序列见附录Ｃ）。如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试 验，两次试验都为非特异性反应时，判为病毒核酸阴性。 ６．３　血清中和试验 ６．３．１　材料与试剂 ６．３．１．１　９６孔细胞培养板。 ６．３．１．２　小反刍兽疫标准种毒、标准阳性血清和阴性血清。 ６．３．１．３　羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞。 ６．３．１．４　被检血清。 ６．３．１．５　１９９或 ＭＥＭ培养基。 ６．３．２　设备 ６．３．２．１　倒置显微镜。 ６．３．２．２　二氧化碳培养箱。 ６．３．２．３　微量离心机。 ５ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．３．３　操作步骤 ６．３．３．１　病毒繁殖 将培养２４ｈ内已长成单层、形态良好羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞弃去培养液，用维持液将细胞洗 涤２次～３次，按细胞培养液培养量的１０％加入小反刍兽疫病毒，３７℃吸附１ｈ（其间轻轻摇晃数次）。 弃去病毒余液，用维持液洗涤２次～３次，加入细胞维持液置３７℃５％二氧化碳培养箱内培养，逐日观 察，当细胞ＣＰＥ达７５％时，将培养物放－７０℃保存。 ６．３．３．２　病毒毒价测定 将收获的细胞病毒液冻融３次，以５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取上清液作１０倍倍比稀释，在９６孔 细胞培养板上用羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞作５０μＬ病毒量的毒价测定，每孔总体积为２００μＬ，按改 良的ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ或Ｋａｒｂｅｒ方法计算ＴＣＩＤ５０，本试验要求毒价达１０４ 以上。经测定毒价符合要求的 病毒抗原分装小瓶置－７０℃或液氮中保存备用。超过３个月保存期的病毒用前需重新测定毒价。 ６．３．３．３　被检样品的采集和处理 用无菌注射器或专用采血管无菌自羊颈静脉采血，无菌分离血清编号备用。试验时，被检血清、阳 性血清、阴性血清分别经５８℃～５９℃温育３０ｍｉｎ灭能。 ６．３．３．４　被检血清稀释 被检血清用细胞培养维持液按１∶８稀释备用。 ６．３．３．５　病毒稀释 试验时，按需要量将被测得毒价的病毒作每５０μＬ含１００ＴＣＩＤ５０的稀释。 ６．３．３．６　细胞悬液制备 将经２４ｈ内培养长成单层，形态良好的羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞，倒弃培养液，用细胞维持液 将细胞洗涤两次，用分散液将细胞消化吹打分散，并以细胞培养液作适当稀释，按白细胞计数方法计算 细胞数量，用培养液配成每毫升含１．５×１０５～２×１０５ 个细胞的悬液。 ６．３．３．７　对照设立 细胞对照：设４孔细胞对照，每孔加细胞悬液１００μＬ，细胞维持液１００μＬ。 病毒对照：将病毒稀释成１００ＴＣＩＤ５０、１０ＴＣＩＤ５０、１ＴＣＩＤ５０、０．１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ，每一稀释度作 ４孔，每孔加病毒悬液５０μＬ，细胞悬液１００μＬ，细胞维持液５０μＬ。 阴性血清对照：设４孔，每孔加阴性血清５０μＬ，１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ的病毒悬液５０μＬ，细胞悬液 １００μＬ。 阳性血清对照：先将阳性血清作１∶２、１∶４……１∶１６稀释，每一稀释度４孔，每孔加阳性血清 ５０μＬ，１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ的病毒悬液５０μＬ，细胞悬液１００μＬ。 细胞毒性对照：每孔加待检血清５０μＬ，细胞悬液１００μＬ，细胞维持液５０μＬ。 ６．３．３．８　中和 移液器吸取已稀释好的待检血清５０μＬ，移入９６孔细胞培养板内，再加入５０μＬ１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ 病毒悬液，振荡混匀，３７℃５％二氧化碳培养箱中作用１ｈ。 ６ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．３．３．９　培养 血清和病毒中和１ｈ后，细胞培养板的中和孔，每孔加１．５×１０５／ｍＬ～２×１０５／ｍＬ的细胞悬液 １００μＬ，置３７℃５％二氧化碳培养箱中培养。 ６．３．３．１０　结果判定 ６．３．３．１０．１　判定条件 接种后７２ｈ初判结果。当阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照１∶８无细胞病变，被检 血清对照细胞无毒性（无细胞病变），细胞对照正常，病毒对照在出现下列结果时，方能初判： ———１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ均出现ＣＰＥ； ———１０ＴＣＩＤ５０／５０μＬ７５％出现ＣＰＥ； ———１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ２５％～５０％细胞出现ＣＰＥ； ———０．１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ细胞不出现ＣＰＥ。 弃掉有特异性细胞病变的孔，并把其他孔的培养液换成维持液，并继续旋转培养７ｄ，进行终判。 ６．３．３．１０．２　判定标准 被检血清１∶８稀释能抑制５０％或５０％以上的细胞出现ＣＰＥ者判为阳性。 ６．４　琼脂凝胶免疫扩散试验 ６．４．１　材料和试剂 ６．４．１．１　血清样品。 ６．４．１．２　ＰＰＲＶ抗原。 ６．４．１．３　ＰＰＲ阳性标准血清。 ６．４．１．４　ＰＰＲ阴性标准血清。 ６．４．１．５　生理盐水。 ６．４．１．６　叠氮钠。 ６．４．２　仪器与设备 ６．４．２．１　平皿：常用直径６ｃｍ的平皿，要求底面平整光滑。 ６．４．２．２　打孔器：与模板配套制作的，外径为５ｍｍ的不锈钢管。 ６．４．３　试验操作 ６．４．３．１　琼脂凝胶平板的制备 制备见附录Ｂ。 ６．４．３．２　打孔 中间１孔，周围６孔为一组，每个平皿打４组～６组。孔径５ｍｍ，孔距３ｍｍ。 ６．４．３．３　封底 用酒精灯烘烤平皿底部，使琼脂板底部微融，静置冷却。 ６．４．３．４　加样 按照图１，中心孔加抗原，１、３、５孔加标准阳性血清；２、４、６孔加被检血清。每个平皿设１组对照， ７ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 即１、３、５孔加标准阳性血清，２、４、６孔加阴性血清。加样后静置１０ｍｉｎ，移入湿盒内于室温（２２℃～ ２５℃）反应。 图１ ６．４．４　结果判定 ６．４．４．１　加样２４ｈ后判定结果。当阳性对照与抗原孔之间出现清晰沉淀线，阴性对照与抗原孔之间 无沉淀线时，进行判定。 ６．４．４．２　待检血清与抗原孔之间出现沉淀线，并与阳性对照沉淀线末端相融，该血清判定为“阳性”。 ６．４．４．３　待检血清与抗原孔之间未出现沉淀线，该血清判定为“阴性”。 ６．４．４．４　血清孔之间出现的沉淀线，判定为非特异性反应，非特异性反应的血清再做一次，结果仍为 非特异性反应的判为“阴性”。 ６．５　竞争酶联免疫吸附试验 ６．５．１　试剂和材料 ６．５．１．１　包被抗原：小反刍兽疫病毒Ｎ抗原重组蛋白。 ６．５．１．２　辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧＨＲＰ）。 ６．５．１．３　血清：小反刍兽疫标准阳性、阴性血清。 ６．５．１．４　针对小反刍兽疫Ｎ蛋白的单克隆抗体（ＭｃＡｂＮ）。 ６．５．１．５　包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液、终止液：见附录Ｂ。 ６．５．２　仪器和设备 ６．５．２．１　酶标仪。 ６．５．２．２　可拆９６孔酶标板。 ６．５．２．３　单孔道、多孔道可调微量移液器。 ６．５．２．４　３７℃恒温箱。 ６．５．３　操作步骤 ６．５．３．１　包被 将小反刍兽疫病毒Ｎ抗原重组蛋白用包被液稀释至工作浓度，分别加入到９６孔酶标板中，每孔 １００μＬ，置４℃冰箱过夜或３７℃作用１ｈ。 ６．５．３．２　洗板 取出酶标板弃去液体，每孔加洗液２００μＬ，洗板，共３次。最后一次倒置拍干。 ６．５．３．３　封闭 每孔加封闭液１００μＬ，３７℃反应２ｈ，洗板３次。 ８ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．５．３．４　加样 样品和弱阳性对照、阳性对照、阴性对照用稀释液作１∶５稀释，混匀，加入ＥＬＩＳＡ反应板（样品分 布详见表１），每孔５０μＬ３７℃反应１ｈ。 表１　样品分布示意 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ Ｓ１ Ｓ１ Ｓ９ Ｓ９ ＨＰ ＨＰ Ｓ２２ Ｓ２２ Ｓ３０ Ｓ３０ Ｓ３８ Ｓ３８ Ｓ２ Ｓ２ Ｓ１０ Ｓ１０ ＬＰ ＬＰ Ｓ２３ Ｓ２３ Ｓ３１ Ｓ３１ Ｓ３９ Ｓ３９ Ｓ３ Ｓ３ Ｓ１１ Ｓ１１ Ｎ Ｎ Ｓ２４ Ｓ２４ Ｓ３２ Ｓ３２ Ｓ４０ Ｓ４０ Ｓ４ Ｓ４ Ｓ１２ Ｓ１２ Ｓ１７ Ｓ１７ Ｓ２５ Ｓ２５ Ｓ３３ Ｓ３３ Ｓ４１ Ｓ４１ Ｓ５ Ｓ５ Ｓ１３ Ｓ１３ Ｓ１８ Ｓ１８ Ｓ２６ Ｓ２６ Ｓ３４ Ｓ３４ Ｓ４２ Ｓ４２ Ｓ６ Ｓ６ Ｓ１４ Ｓ１４ Ｓ１９ Ｓ１９ Ｓ２７ Ｓ２７ Ｓ３５ Ｓ３５ Ｓ４３ Ｓ４３ Ｓ７ Ｓ７ Ｓ１５ Ｓ１５ Ｓ２０ Ｓ２０ Ｓ２８ Ｓ２８ Ｓ３６ Ｓ３６ Ｓ４４ Ｓ４４ Ｓ８ Ｓ８ Ｓ１６ Ｓ１６ Ｓ２１ Ｓ２１ Ｓ２９ Ｓ２９ Ｓ３７ Ｓ３７ Ｓ４５ Ｓ４５ 　　注：Ｓ代表样品；ＨＰ为强阳性对照；ＬＰ为弱阳性对照；Ｎ为阴性对照。 ６．５．３．５　犕犮犃犫犖和羊抗鼠犐犵犌犎犚犘工作液配制 ＭｃＡｂＮ：按说明书，用ｐＨ７．４ＰＢＳ稀释成工作浓度，混匀。 羊抗鼠ＩｇＧＨＲＰ：按说明书，用ｐＨ７．４ＰＢＳ稀释成工作浓度，混匀。 ６．５．３．６　加 犕犮犃犫犖 每孔加５０μＬＭｃＡｂＮ工作液，振荡混匀。３７℃作用３０ｍｉｎ，洗板３次。 ６．５．３．７　加酶结合物 各孔加１００μＬ羊抗鼠ＩｇＧＨＲＰ，轻轻混匀。酶标板置３７℃作用３０ｍｉｎ，洗板３次。 ６．５．３．８　加底物液 每孔加１００μＬ底物液，３７℃作用１０ｍｉｎ。 ６．５．３．９　终止反应 取出反应板，每孔快速加入１００μＬ终止液，在３０ｍｉｎ内测其ＯＤ值。 ６．５．３．１０　测吸光值 用酶标仪在４５０ｎｍ波长下，测定其吸光值。 ６．５．４　结果计算 ６．５．４．１　抑制百分比（犘犐）计算见式（１）： 犘犐％＝１００－ 被检血清平均 ＯＤ值 阴性血清平均 ＯＤ值×１００ ………………（１） ６．５．４．２　结果判定：弱阳性、强阳性对照犘犐≥５０％的条件下，进行判定。被检血清抑制百分比犘犐≥ ５０％，判为小反刍兽疫抗体阳性，犘犐＜５０％判为被检血清小反刍兽疫抗体阴性。 注：竞争酶联免疫吸附试验中所述方法等效于其他商品化试剂盒。 ９ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （资料性附录） 小反刍兽疫简介 犃．１　地理分布及危害 该病在非洲的大多数国家发生（撒哈拉沙漠以南和赤道以北）和在中东几乎所有的国家一直到土耳 其，也在印度和亚洲西南地区广泛分布。自然条件下主要感染山羊和绵羊，在山羊身上的反应更严重。 发病率高达１００％，严重爆发时死亡率１００％，轻度发生时死亡率不超过５０％。幼年动物发病严重，发 病率和死亡率都很高。牛只有亚临床的感染，极少的情况下牛在感染小反刍兽疫病毒后也有可能引起 机能障碍，临床症状与牛瘟相似。 犃．２　病原学 小反刍兽疫病毒属副粘病毒科，麻疹病毒属。与牛瘟、犬瘟热和麻疹相似，小反刍兽疫病毒呈多形 性，通常为粗糙的球形，有囊膜。病毒有６种结构蛋白：Ｎ蛋白，它包裹该病毒基因组ＤＮＡ；Ｐ蛋白，与 多聚酶相连；Ｌ蛋白是大蛋白，还有 Ｍ、Ｆ、Ｈ蛋白。Ｍ蛋白与病毒囊膜的内部紧密联结，这样就产生了 病毒核衣壳外部与糖蛋白Ｈ和Ｆ连接。Ｈ和Ｆ蛋白的功能是吸附病毒，并协助病毒进入细胞。病毒 可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊睾丸细胞、Ｖｅｒｏ细胞上增殖，并产生细胞病变，形成合胞体。 犃．３　流行病学 该病主要感染山羊、绵羊、美国白尾鹿等小反刍动物，流行于非洲撒哈拉沙漠以南和赤道以北的大 多数国家和亚洲中东地区、西南地区、印度。在疫区，多为零星散发，当易感动物增多时，可爆发流行。 本病主要通过直接接触传染，病畜的分泌物和排泄物是传染源，处于亚临诊型的病羊尤为危险。人工可 感染猪，不出现临床症状，也不能引起疾病的传播，故猪在本病的流行病学中无意义。 犃．４　临床症状 小反刍疫潜伏期一般是３ｄ～１０ｄ，最长２１ｄ，自然发病仅见于山羊和绵羊，山羊发病严重，绵羊也 偶有严重病例发生。急性型体温高达４１℃，并持续３ｄ～５ｄ；患病动物精神烦燥，食欲减退，口鼻部干 燥，口鼻的分泌物逐渐的变成粘液脓性的鼻漏，呼出气体恶臭。如果这时动物没有发生死亡，症状将会 持续１４ｄ。在发热后的４ｄ之内，动物的牙龈开始充血，在口腔出现糜烂并伴随有大量的流涎，随后出 现坏死性病灶，开始口腔粘膜表面出现小的粗糙的红色浅表坏死病灶，逐渐变成粉红色，感染部位包括 下唇、下齿龈等处。严重病例坏死灶波及齿垫、腭、面颊部及乳头、舌等处。在后期一般都会出现带血水 样腹泻，严重脱水、消瘦，随之体温下降。咳嗽，胸膜音和腹式呼吸。患病率可以达到１００％，严重的 爆发时死亡率可达１００％，轻度发生时死亡率不会超过５０％。现场可根据这些临床症状做出初步现场 诊断。尸体剖检，病变与牛感染牛瘟后的症状相似。糜烂性的损伤从口腔一直到网胃和瘤胃连接处，患 畜可见结膜炎、坏死性口炎等肉眼病变。皱胃和盲肠、结肠处常出现病变，其他胃室很少出现病变，病变 特征性为线性坏死或斑马条纹。淋巴结肿大，脾脏出现坏死灶，还会出现肺尖部肺炎。确诊应通过实验 室检疫。 ０１ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犃．５　病理变化 该病毒对胃肠道淋巴细胞、上皮细胞具有特殊的亲和力，能引起特征性病变。在感染细胞中出现嗜 酸性胞浆包涵体及多核巨细胞。在淋巴组织中，小反刍兽疫病毒可引起淋巴细胞坏死。脾脏、扁桃体、 淋巴结细胞坏死。嗜酸性胞浆包涵体的多核巨细胞出现，极少有核内包涵体。在消化系统，病毒引起马 尔基氏深部的上皮细胞发生坏死，感染细胞产生核圆缩和核破裂，在表皮生发层形成含有嗜酸性胞浆包 涵体的多核巨细胞。 犃．６　诊断 犃．６．１　临床诊断：患病动物精神烦燥，食欲减退，口鼻部干燥，口鼻的分泌物逐渐的变成粘液脓性的鼻 漏，呼出气体恶臭。口腔出现糜烂并伴随有大量的流涎，随后出现坏死性病灶，感染部位包括下唇、下齿 龈等处。严重病例坏死灶波及齿垫、腭、面颊部及乳头、舌等处。在后期一般都会出现带血水样腹泻，严 重脱水、消瘦，随之体温下降。咳嗽，胸膜音和腹式呼吸等肺炎症状。皱胃和盲肠、结肠处常出现线性 坏死或斑马条纹病变，淋巴结肿大，脾脏出现坏死灶，出现肺尖部肺炎等可做出初步诊断。 犃．６．２　实验室诊断：进一步确诊方法有病原鉴定、血清学方法、分子生物学方法等。 犃．６．３　阳性动物的处理：对于确诊阳性动物的动物群，应按我国的有关规定进行处理。 １１ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犅 （规范性附录） 溶 液 配 制 犅．１　细胞分散液 氯化钠 ８．０ｇ 氯化钾 ０．４ｇ 碳酸氢钠 ０．６ｇ 乙二胺四乙酸二钠 ０．２ｇ 胰酶 ０．８ｇ 去离子水 至１０００ｍＬ 过滤除菌，分装，－２０℃保存。 犅．２　磷酸盐缓冲液（犘犅犛）的配制 氯化钠 ８．０ｇ 氯化钾 ０．２ｇ 十二水磷酸氢二钠 ２．９ｇ 磷酸二氢钾 ０．２ｇ 去离子水 １０００ｍＬ 将上述成分依次溶解，混匀，分装，调节ｐＨ为７．２，高压灭菌（１．０１×１０５Ｐａ，１５ｍｉｎ）。 犅．３　犜犅犈电泳缓冲液（５倍浓缩液） Ｔｒｉｓ ５４ｇ Ｈ３ＢＯ３ ２７．５ｇ ＥＤＴＡ ２．９２２ｇ 去离子水 １０００ｍＬ 用５ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调到ｐＨ８．０。使用时用去离子水稀释至０．５倍的ＴＢＥ电泳缓冲液。 犅．４　犈犅（溴乙淀）核酸染色液 用水配制成１０ｍｇ／ｍＬ的浓缩液。用时每１００ｍＬ琼脂中加５μＬ。 犅．５　上样缓冲液 每１００ｍＬ水溶液中含：溴酚蓝０．２５ｇ，蔗糖４０ｇ。 犅．６　犇犈犘犆水 取１ｍＬＤＥＰＣ（焦碳酸二乙酯）加入１０００ｍＬ去离子水中，３７℃过夜，１．０１×１０５Ｐａ高压灭菌 ２１ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ３０ｍｉｎ。 犅．７　１．０％琼脂糖凝胶的制备 在２００ｍＬ三角烧瓶中加入：电泳级琼脂糖，１．０ｇ；０．５×ＴＢＥ缓冲液，１００ｍＬ。微波炉中使之完 全溶解后，加入１０ｍｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液５μＬ充分摇匀，备用；待琼脂糖冷却到６０℃左右，倒入制胶板 并防止气泡产生，使琼脂糖厚度达３ｍｍ～５ｍｍ；待凝胶完全凝固后去掉梳子和两端封口物，将凝胶托 盘放入电泳槽，加入０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液使之高出凝胶２ｍｍ～３ｍｍ。 犅．８　１％（质量浓度）琼脂糖凝胶板的制备 称取琼脂糖（电泳级）１ｇ，叠氮钠０．１２５ｇ，置于１５０ｍＬ容量的三角烧瓶中，加入生理盐水１００ｍＬ。 加热至沸腾使琼脂糖完全熔化。将熔化后冷却至６０℃左右的琼脂糖溶液注入直径６ｃｍ的平皿中，每 个平皿加８ｍＬ。琼脂糖自然冷却凝固后，凝胶板厚约３ｍｍ，盖好平皿倒置放４℃冰箱保存备用。 犅．９　包被液（０．０５犿狅犾／犔狆犎９．６碳酸盐缓冲液） 碳酸氢钠 １．４６ｇ 碳酸钠 ０．９７ｇ（或Ｎａ２ＣＯ３·１０Ｈ２Ｏ　１．２ｇ） 水 ５００ｍＬ 溶解后置于４℃冰箱，１周内使用。 犅．１０　洗涤液（０．０１犿狅犾／犔狆犎７．４犘犅犛０．０５％吐温２０） 氯化钠 ４．０ｇ 磷酸二氢钾 ０．１ｇ 十二水磷酸氢二钠 １．４５ｇ 氯化钾 ０．１ｇ 吐温２０ ０．２５ｍＬ 水 ５００ｍＬ 溶解后置于４℃冰箱备用。 犅．１１　稀释液 牛血清白蛋白 ３ｇ 洗涤液 １００ｍＬ 置于４℃冰箱备用。 犅．１２　封闭液 １％牛血清白蛋白的ＰＢＳＴ。 ３１ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犅．１３　底物液 犅．１３．１　乙酸柠檬酸缓冲液（狆犎６．０） 乙酸钠（Ａ液）： 乙酸钠 １．６４ｇ 水 ２００ｍＬ 溶解后置于４℃冰箱备用。 柠檬酸（Ｂ液）： 柠檬酸 ２．１ｇ 水 １００ｍＬ 溶解后置于４℃冰箱备用。 配制：取Ｂ液约２ｍＬ至Ａ液中调ｐＨ值至６．０，置于４℃冰箱备用。 犅．１３．２　犜犕犅溶液 ＴＭＢ ３５０ｍｇ 甲醇 １００ｍＬ 加温溶解后于暗盒中存室温。 犅．１３．３　底物液（临用前配制） ｐＨ６．０乙酸柠檬酸缓冲液（３７℃）９．７ｍＬ ＴＭＢ溶液 ３００μＬ Ｈ２Ｏ２ ７μＬ 犅．１４　终止液（２犿狅犾／犔犎２犛犗４） 浓硫酸 ２２．２ｍＬ 水 １７７．８ｍＬ ４１ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犆 （规范性附录） 犚犜犘犆犚扩增参考序列 　　ＴＣＴＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧ ＡＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＣＧＴＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＧ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡ ＡＣＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＡＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＧＧＣＣＧＡＧＧＣ ＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧ 犛犖／犜２７３３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ３３７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 小反刍兽疫检疫技术规范 ＳＮ／Ｔ２７３３—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．２５　字数 ２９ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１６５３　定价 ２１．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售