关节软骨钙化层研究进展

中国修复重建外科杂志2011年11月第25卷第11期 ·1339· 关节软骨钙化层研究进展 宋伟  王富友  杨柳 【摘  要】    目的  综述关节软骨钙化层的结构和功能及其在骨关节炎（osteoarthritis，OA）发病机制中的作 用。  方 法  广泛查阅近年来关于钙化层研究的文献，对钙化层的结构、成分、生物力学和生物化学功能进行总结分 析。  结果  钙化层有特殊的结构和材料特性，并且具备半透膜的性质，钙化层软骨细胞保留部分生长板细胞特性，在维 持正常软骨功能和 OA 发生、发展过程中起重要作用。因此重建关节软骨钙化层已成为近年来兴起的界面组织工程领域 研究热点。  结论  对软骨钙化层的研究需要进一步深入，这在 OA 治疗和组织工程骨 - 软骨复合体制备方面都具有重 要意义。 【关键词】    钙化层    非钙化软骨    软骨下骨    骨关节炎    界面组织工程 RESEARCH PROGRESS OF CALCIFIED CARTILAGE ZONE/SONG Wei, WANG Fuyou, YANG Liu. Center for Joint Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, P.R.China. Corresponding author: YANG Liu, E-mail: jointsurgery@163.com 【Abstract】 Objective To review the structure and function of the calcified cartilage zone and its role in the pathogenesis of osteoarthritis (OA). Methods Recent l iterature about calcified zone was reviewed and analyzed in terms of architecture, composition, biomechanics, and biological function. Results Calcified zone has particular structure and material properties, and functions as a semi permeable membrane; chondrocytes in the calcified zone retain some characteristics of growth plate cells, which play a crucial role in cartilage function maintenance and pathogenesis of OA. Therefore, reconstruction of the calcified zone at osteochondral conjunction has become one of the hot research in the fields of interface tissue engineering. Conclusion It is necessary to pay more attention to calcified cartilage zone, which is important for both the treatment of OA and the preparation of tissue engineered osteochondral composite. 【Key words】    Calcified zone Uncalcified cartilage zone Subchondral bone Osteoarthritis Interface tissue engineering Foundation item: National Natural Science Foundation of China (30870639) 钙化层是非钙化软骨和软骨下骨之间重要的界面 结构，起着传导分散应力、抵抗剪切力、紧密连接骨软 骨以及限制组织液在骨和软骨之间自由交换等作用。 钙化层软骨细胞保留了部分生长板细胞特性，在成熟 关节软骨中处于静止期，特定条件下如创伤、骨关节炎 （osteoarthritis，OA）时可以再度激活，现出肥大的 软骨细胞表型，引起潮线前移、钙化层重塑和通透性改 变，通过生物力学和生物化学两条途径引发软骨损伤、 退变，在 OA 发病过程中起重要作用。现对近年来有 关软骨钙化层的研究进展进行总结分析，为 OA 防治 和组织工程重建钙化层提供理论依据。 基金项目：国家自然科学基金面上项目（30870639） 作者单位：第三军医大学西南医院关节外科中心（重庆，400038） 通讯作者：杨柳，教授，博士生导师，研究方向：组织工程和关节外 科，E-mail: jointsurgery@163.com 网络出版时间：2011-10-12  14:10:21；网络出版地址：http://www. cnki.net/kcms/detail/51.1372.R.20111012.1410.201111.108_026.html 1  钙化层的解剖结构 正常成人关节软骨按照胶原纤维排列方向由浅到 深可分为 4 层，分别为浅表层、过渡层、辐射层和钙化 层，前 3 层又统称为非钙化软骨层或透明软骨层。钙 化层有上下两个界面，向上通过波浪状潮线结构与辐 射层连接，有Ⅱ型胶原穿越潮线结构进入钙化层；向下 通过梳齿状黏合线连接软骨下骨，无胶原纤维穿过黏 合线，钙化层和软骨下骨的紧密连接是依靠两个界面 交错锚合，锚合程度受血管侵入和骨重塑速度调控 [1]。 成熟非钙化软骨内缺乏血管、神经，其营养供应主 要依靠关节液。近年来研究发现 [2]，有小血管和神经 穿越皮质终板进入钙化层，有的甚至上达潮线和非钙 化软骨深层，这些血管通道将骨髓腔和钙化层连接起 来，为钙化层软骨细胞和非钙化软骨深层软骨细胞提 供营养。OA 病程中还有新生血管和神经组织侵入钙 化层，可能与软骨退变和疼痛症状加重有关 [3]。 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, November 2011, Vol. 25, No.11·1340· 2   钙化层的材料特性 成人关节软骨钙化层的有机成分主要为Ⅱ型胶 原，占组织干重的 20.16% ± 0.96%；无机成分主要是 羟基磷灰石，占无机成分的 65.09% ± 2.31%[4]。钙化 层的成分决定了其材料特性，其弹性模量约为（0.32 ±  0.25） GPa，介于非钙化软骨和软骨下骨之间，约为非 钙化软骨的 100倍，软骨下骨的 1/10[5]。 发生 OA 时软骨下骨重塑引起单位体积骨组织量 增加，其表观骨密度也升高；但由于重塑时骨转换率明 显加快，新生Ⅰ型胶原结构缺陷，不能被充分矿化，导 致软骨下骨孔隙率增加、硬度减小 [6]。和软骨下骨不 同，Ferguson 等 [7] 应用背向散射电子成像和纳米压痕 技术定量研究 OA 髋关节标本，发现随着潮线前移，钙 化层矿化程度逐渐升高，其硬度也明显增加，破坏了钙 化层缓解骨 -软骨界面应力梯度的作用，加快了覆盖其 上的非钙化软骨损伤、退变，使得钙化层和非钙化软骨 连接界面——潮线结构成为最容易受到应力损伤的部 位，因此软骨剥脱多发生在潮线处。 3  钙化层的功能  3.1  钙化层的生物力学功能 钙化层连接非钙化软骨和软骨下骨，通过垂直关 节面的胶原纤维传导和分散应力，通过潮线和黏合线 界面增大接触面积，将非钙化软骨牢牢固定在软骨下 骨上 [8]。根据 Wolff 定律，在关节负荷传导中起重要 作用的钙化层必须保持一定厚度以适应生理功能的需 要。四肢正常关节软骨钙化层厚度与关节软骨总厚度 的比值约为 1 ∶ 10，并且不随年龄增长和关节内部区 域不同而发生改变，这是由于软骨内化骨和钙化层重 塑之间的平衡使钙化层厚度保持相对恒定，具有重要 的生理意义 [9]。Koszyca 等 [10] 通过对 33 个正常膝关 节不同部位关节软骨进行测量后提出，随年龄增长出 现的潮线前移不会明显增加钙化层厚度，钙化层通过 自身重塑保持了发挥最佳功能的理想厚度，厚度太小 不能将非钙化软骨和软骨下骨牢靠固定，厚度过大不 利于软骨下骨营养成分进入软骨，同时会减小软骨的 黏弹性，损害其传导和分散应力的功能。 钙化层硬度介于非钙化软骨和软骨下骨之间，这可 以有效缓解应力在不同界面传导过程中产生的应力集 中，起到保护软骨的作用。应力从关节软骨向干骺端传 导过程中会形成较大的剪切力，钙化层通过潮线和黏合 线的起伏波动，将剪切力转化为压力和张力后传导至软 骨下骨，如果没有钙化层存在，应力传导过程中产生的 巨大剪切力会轻易将软骨从软骨下骨上撕脱 [11]。 Bobinac 等 [12] 应用骨组织形态计量学研究 OA 膝关节标本软骨下骨结构参数，发现和正常对照组 相比，OA 组由于不同区域钙化层和软骨下骨的重塑 速度不均一，导致胫骨平台不同区域骨密度出现明显 差别，这使非钙化软骨因承受异常剪切力而加速损伤。 白希壮等 [13] 通过构建豚鼠 OA 模型观察到钙化层厚 度与非钙化软骨退变程度成正相关，说明钙化层厚度 改变在 OA发病过程中可能起重要作用。 3.2  钙化层是联系骨 -软骨功能单位的枢纽 既往认为，软骨成熟后因潮线出现和钙化层中羟 基磷灰石致密分布，骨髓来源的营养物质和 O2 不能通 过钙化层，使非钙化软骨处于缺氧的微环境中，有利于 软骨生长发育。然而，近期有研究表明钙化层并非完 全不能通透的屏障。Guévremont 等 [14] 在 OA 患者股 骨髁和胫骨平台非钙化软骨深层发现了肝细胞生长因 子（hepatocyte growth factor，HGF），由于软骨细胞不能 分泌 HGF，而硬化的软骨下骨成骨细胞可以合成大量 HGF，提示成骨细胞来源的 HGF 可能以旁分泌的方式 通过钙化层进入非钙化软骨深层，该研究首次说明了 钙化层对 HGF等小分子具有通透性。 Arkill 等 [15] 用定量荧光显微镜观察成年马掌指关 节软骨钙化层对小分子示踪剂荧光素 Na（相对分子 质量为 376 × 103）和玫瑰红 B（相对分子质量为 479 ×  103）的通透性，发现这两种示踪剂都可以从上下两侧 自由通过钙化层，提示相对分子质量和示踪剂相近的 营养物质和信号分子，如前列腺素 E2、NO 和葡萄糖 分子等，可以在非钙化软骨和软骨下骨之间正常交通。 Pan 等 [16] 用透射电镜观察成熟 C57BL/6J 大鼠股骨远 端软骨钙化层结构，发现钙化层中存在非矿化区域，其 中主要含有蛋白多糖等有机物质，约占钙化层总面积 的 22%，可为小分子物质在骨 - 软骨之间的转运提供 潜在通道。 以上研究表明钙化层具有半透膜的性质。在正常 状态下，O2 不能任意通过钙化层，维持了非钙化软骨 缺氧的特殊微环境；钙化层中非矿化区域可能是小分 子营养物质和信号分子在骨 -软骨之间转运的通道，软 骨细胞和骨细胞、体细胞之间的信号串话机制是客观 存在的，骨和软骨通过钙化层介导构成一个彼此独立 又相互影响的复杂整体和功能单位 [17]。 4  钙化层在 OA 发病机制中的作用 4.1  钙化层微裂隙形成和血管化 钙化层硬度远远高于非钙化软骨，应力传导过程 中在潮线处形成较大的接触压力，使钙化层在反复应 力作用下因疲劳而出现微裂隙，微裂隙的产生类似于 中国修复重建外科杂志2011年11月第25卷第11期 ·1341· 软骨下骨因应力疲劳发生的微骨折，并且负重区微裂 隙数量远高于非负重区 [18]。微裂隙的产生破坏了骨细 胞之间的小管连接，导致骨细胞凋亡启动重塑过程，因 此在微裂隙附近经常可见破骨细胞和成骨细胞聚集， 破骨细胞和成骨细胞相互协同产生新的骨组织，修复 微裂隙 [19]。 钙化层重塑是 OA 早期特征性病理改变，此时钙 化层软骨细胞激活表现出生长板细胞特性，继而表达 肥大的软骨细胞表型，分泌Ⅹ型胶原，引起软骨基质矿 化、潮线前移或出现多条潮线 [20]。同时，来自骨髓腔的 新生血管侵入钙化层，使钙化层被骨组织慢慢取代，部 分末端未封闭的血管还可以侵入非钙化软骨，使软骨 下骨成骨细胞合成的 TGF-β和基质金属蛋白酶等参与 调节软骨细胞代谢，促进软骨基质破坏、崩解 [21]。 4.2  OA时钙化层介导软骨和软骨下骨相互作用 越来越多的研究发现，OA 早期软骨下骨重塑先 于软骨退变。Libicher 等 [22] 应用 MRI 观察犬前交叉 韧带切断 OA 模型，术后 6 周发现胫骨平台软骨下骨 发生骨髓水肿，术后 12 周才出现软骨退变迹象，而半 月板退变和骨赘形成分别发生于术后 24 周和 48 周。 Muraoka 等 [23] 观察 Hartley 豚鼠自发 OA 模型软骨下 骨重塑现象，发现 2 月龄时出现软骨下骨厚度和骨密 度明显减小，即发生一过性骨质疏松，随后软骨下骨硬 化；3 月龄时才出现软骨表层软骨细胞数量减少、表型 改变。 OA 时软骨下骨重塑早于软骨退变，与硬化的软 骨下骨成骨细胞可影响软骨细胞代谢有关。Sanchez 等 [24-25] 将软骨细胞和软骨下骨成骨细胞共同培养，发 现硬化的软骨下骨成骨细胞可以诱导软骨细胞表型向 肥大软骨细胞分化，刺激软骨细胞产生基质金属蛋白 酶 3，阻碍蛋白聚糖 mRNA 表达，从而抑制蛋白聚糖 合成，而正常软骨下骨成骨细胞没有此效应。反之， Prasadam 等 [26] 在体外研究发现，正常关节软骨细胞能 够抑制软骨下骨成骨细胞异常分化，而 OA 软骨细胞 可诱导成骨细胞功能缺陷、异常增殖，导致软骨下骨重 塑、硬化。Hwang 等 [27] 用灌注实验测量正常人和 OA 膝关节内侧股骨髁标本的水通透性，发现随着 OA 严 重程度增加，骨 - 软骨界面通透性逐渐升高，这和 OA 早期钙化层不均一矿化程度增加 [28]、微裂隙形成有关， 也和 OA 中、晚期新生血管侵入钙化层有关。钙化层 水通透性升高使组织液可以在骨和软骨之间自由流 动，这既可作为刺激软骨细胞的机械信号，还可以加强 细胞因子、生长因子在骨和软骨之间的交通。 总之，钙化层在 OA 病程中介导了软骨和软骨下 骨相互作用。硬化的软骨下骨成骨细胞合成的生长因 子（IGF-1、TGF-β）、细胞因子（IL-1、TNF-α）、花生四 烯酸类物质（前列腺素 E2、白细胞三烯 B4）和基质金 属蛋白酶等，通过钙化层微裂隙和新生血管侵入非钙 化软骨，直接或间接作用于软骨细胞，调节软骨细胞代 谢，导致软骨细胞表型改变和功能异常，最终出现软骨 退变、基质崩解 [29]；而肥大的软骨细胞也通过钙化层 进一步诱导成骨细胞异常分化，形成恶性循环，加快了 OA的进程。 5  钙化层重建是界面组织工程研究的热点 近年来，界面组织工程正蓬勃发展，其主要内容涵 盖韧带 - 骨、肌腱 - 骨和软骨 - 骨 3 种不同软硬组织连 接界面的修复，而研究核心和难点均包括了钙化层结 构的重建 [30]。Allan等 [31] 构建的具有钙化层界面的骨 - 软骨复合支架比单纯骨 - 软骨双相支架具有更好的分 散应力和抗剪切力作用。Cheng 等 [32] 首次利用 MSCs 和胶原微球技术在体外合成高度仿生的钙化层结构， 其中具备功能性的肥大软骨细胞、Ⅱ型和Ⅹ型胶原、 相同程度的钙盐沉积以及垂直走向的胶原纤维。上述 研究说明钙化层重建已经从单纯的物理结构重建逐步 深入到生理和生物化学功能的重建，具有广阔的研究 前 景。 6  展望 钙化层通过其生物力学和生物化学功能将软骨和 软骨下骨连接成一个相互依赖、相互作用的功能单位， 深入研究钙化层的结构和功能具有重要现实意义。在 OA 治疗方面，调节软骨下骨重塑药物（如降钙素 [33]） 是如何作用于钙化层和软骨下骨，从而起到保护软骨 的作用机制尚需进一步研究；在组织工程方面，如何构 建既具备机械生物力学效应，又能执行特殊生理、生化 功能的精细钙化层界面结构，是广大科研工作者面临 的一道难题。相信随着对钙化层研究的不断深入，在 OA 预防治疗和组织工程骨 - 软骨复合体构建方面将 会取得长足进步。 7  参考文献  1 Wang F, Ying Z, Duan X, et al. 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