膀胱癌等位基因缺失研究

2008年 2月 　　　　　 第 29卷 　第 1期 　　　　 首 都 医 科 大 学 学 报 Journal of Cap italMedical University 　　　Feb. 2008 Vol. 29　No. 1 ·临床研究 · 膀胱癌等位基因缺失研究 李 　光 1 　张海峰 2 　徐妙生 1 　王全红 3 (1. 首都医科大学附属北京天坛医院病理科 ; 2. 山西省太原市第二人民医院检验科 ; 3.山西省肿瘤医院病理科 ) 【摘要 】　目的 　了解膀胱癌克隆演变 ( clonal evolution)过程中的遗传学机制。 　分别利用 4个位于染色体 9p21区和 17p13 区上具有多态性的微卫星标记物 ,了 18位膀胱癌病人原发癌及相应转移灶中等位基因的缺失或保留方式。利用显微切割 技术在保存的石蜡包埋组织中获取基因组 DNA。结果 　在原发癌和转移灶中总的等位基因缺失频率均为 89% (16 /18) , 而在 原发癌中 D9S161的缺失频率为 86% , D9S171为 67% , IFNA 71% , TP53 80% ;在转移灶中各位点缺失频率分别为 100% (D9S161) , 67% (D9S171) , 71% ( IFNA) , 80% ( TP53)。18例病例中 , 16例 (89% )在原发癌及相应转移灶中所有位点均现为 相同的等位基因缺失或保留模式 ,而另外 2例 (11% )则显示不一致的等位基因缺失。这 2例在原发癌灶表现为等位基因保留而 在相应转移灶则为缺失。结论 　膀胱癌在原发癌及相应转移灶遗传组成上有相当一致性 ;当转移癌的原发癌不能确定来源时 , 这些位点的杂合性缺失 (LOH)可作为膀胱癌的标志物。 【关键词 】　膀胱癌 ; 转移 ; 显微切割 ; 肿瘤进展 【中图分类号 】　R 737. 14 A llelic L oss in Bladder Cancer L i Guang1 , Zhang Haifeng2 , Xu M iaosheng1 , W ang Quanhong3 (1. D epartm ent of Pa thology, B eijing Tiantan Hospita l, Capita l M edica l U niversity; 2. D epartm en t of C lin ical Laboratory, The Second People’s Hospita l of Ta iyuan; 3. D epartm en t of Pathology, Shanxi Cancer Hospita l) 【ABSTRACT】　O bjective　To better understand the genetic basis of bladder cancer p rogression. M ethods　The study exam ined the patterns of allelic loss with polymorphic m icrosatellite markers on chromosomes 9p21 (D9S161, D9S171, IFNA ) , regions of putative tumor supp ressor gene p16, and on chromosome 17p13 ( TP53) , the p53 locus, in matched p rimary and metastatic bladder cancers in 18 patients. A ll patients underwent cystectomy for bladder cancer and were found to have regional lymph node metastases at the time of surgery. Genom ic DNA was obtained from p rimary cancers and matched synchronous lymph node metastases using a m icrodissection method. Results　The overall frequencies of allelic loss were 78% in p rimary cancers and 89% in paired metastatic cancers. The frequencies of allelic loss in the p rimary cancerswere 86% with D9S161, 67% with D9S171, 71% with IFNA, and 80% with TP53. The frequencies of allelic loss in matched metastatic cancers were 100% with D9S161, 62% with D9S171, 71% with IFNA, and 80% with TP53. An identical pattern of allelic imbalance ( allelic loss or retention) at multip le DNA loci was observed in matched p rimary and metastatic carcinomas in 16 (88% ) cases. Two case showed allelic loss in the metastases, but not in the p rimary cancers. Conclusion　 The patterns of allelic loss at chromosomes 9p21 (p16) and 17p13 (p53) are generally maintained during cancer p rogression to metastasis, and identical allelic loss in p rimary cancers is conserved in paired metastatic carcinomas. These data suggest that these genetic changes may be useful in establishing a diagnosis and determ ining tumor origins in difficult cases. 【KEY WO RD S】　bladder tumor; metastases; m icrodissection; tumor p rogression 　　膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤 ,其发生率在男 性肿瘤中上升为第 4位 ,在女性肿瘤中居第 8位 ,多 数膀胱肿瘤是移行细胞癌 ,以浸润的方式生长 ,复发 率为 50% ～70% ,大部分肿瘤死因归结于转移灶的进 行性生长 [ 1, 2 ]。最近发展起来的组织显微切割技术使 得从石蜡包埋组织中选择性获取单一肿瘤群体用于 遗传学分析成为可能 [ 3, 4 ]。比较不同生物学特征的肿 瘤细胞亚群详细特征性和遗传改变可为了解肿瘤的 进展及克隆演变提供信息 [ 5, 6 ]。 有报道 [ 7, 8 ]原发性乳腺癌等位基因缺失模式在肿 瘤进展至转移过程中保持不变 ,且转移灶的等位基因 缺失和原发癌保持一致 ,提示大多数等位基因失衡 (A I)可能在转移前就已发生。但对于膀胱肿瘤的转 移是否存在等位基因缺失以及在原发癌中等位基因 的失衡是否与其相应的转移灶保持一致所知甚少 ,本 研究利用显微切割及 PCR扩增技术对原发膀胱癌及 其转移灶中的细胞进行了显微切割 ,分析了等位基因 的缺失模式。 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 首 都 医 科 大 学 学 报 第 29卷 1　资料和方法 1. 1　资料 18例膀胱癌病例均来自山西省肿瘤医院 2002年 1月至 2003年 12月经膀胱癌根治术和双侧淋巴结清 扫手术切除标本 ,所有患者手术时均发现有局部淋巴 结转移 ,患者年龄 51岁 ～86岁 (平均年龄 66岁 ) ,按 照 1998年 WHO膀胱肿瘤组织学分类第 2版标准对 膀胱癌进行分级和分期 [ 9 ] ,分级均为高级别的移行细 胞癌。 1. 2　激光显微切割和 DNA提取 对正常淋巴细胞和肿瘤细胞进行显微切割 ,具体 方法如文献 [ 3, 10 ]所述。激光显微切割仪 (Laser cap2 ture m icrodissection, LCM )为 Pixcell Ⅱ 100 (A rcturus Engineering公司 ,美国 ) ,切割下的细胞立即悬浮于 50 μL显微切割消化液中 ;消化液包含 0. 01 mol/L Tri2 HCl, 1 mmol/L MEDTA, 1% Tween220, 0. 05 g/L蛋白 酶 K; pH8. 0, 37 ℃孵化 48 h,混合液 95 ℃ 10 m in,灭 活蛋白酶 K 2μL作为 DNA用于 PCR反应。 1. 3　杂合性缺失 (LO H)分析 1) PCR扩增及凝胶电泳方法同前 [ 11, 12 ] :微卫星 引物包括 : 9p21的 D9S161, D9S171, IFNA; 17p13的 TP53。微卫星引物均购自美国 Research Genetic公 司。在 10μL PCR反应体系中加入基因组 DNA (肿 瘤或正常细胞 ) 2μL (约含 DNA 100ng) , 1μL 10 × PCR缓冲液 Ⅰ, 1. 0μL 1. 25 mmol/L dNTP,一对引物 各 0. 4 μL, gold Amp li Taq DNA 聚合酶 0. 1 μL, 1μL Ci[α32 2P ] dCTP,加水至 10μL,后 加入 10μL矿 物油覆盖反应液 , 95 ℃变性 10 m in,循环条件为 : 95 ℃ 1 m in, 55 ℃～60 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 后 72 ℃延伸 10 m in。 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳 : PCR产物用甲酰胺变性 示踪液稀释 2倍 , 95 ℃变性 10 m in,加样 4μL于 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶 , 1 600 V电泳 1. 5～2. 5 h,将凝 胶转至滤纸上 ,真空干燥 , Kodak B io Max MR胶片室 温 37 ℃ 24～48 h后观察结果。 3) LOH的判定 :杂和性缺失的判定标准 :相对于 正常淋巴细胞 DNA的一条带密度减少 90%以上时可 判为丢失。微卫星位点的纯合子病例 (即该位点正常 体细胞只显示一个基因条带 )判为无信息病例。有信 息的杂合子病例 (该位点正常显示 2个条带 )分为 2 种情况 ,一种为放射自显影显示 2个密度相似条带 , 未保留或未丢失 ,另一种则为一个条带丢失即等位基 因 LOH。 1. 4　统计学分析 所有统计学分析采用 SAS软件进行检验和 Mc2 Nemar检验。P < 0. 05为差异有统计学意义。 2　结果 18例膀胱癌均为移行细胞癌。在原发癌和转移 灶中总的等位基因缺失频率均为 89% (16 /18) (表 1, 图 1 )。在原发癌中 D9S161 的缺失频率为 86% , D9S171为 67% , IFNA为 71% , TP53为 80% ;在转移 灶中各位点缺失频率分别为 100% (D9S161 ) , 62% (D9S171) , 71% ( IFNA )和 80% ( TP53)。在原发癌 和转移灶中各位点等位基因缺失频率差异均无统计 学意义 ( P > 0. 05)。没有证据表明在分析的各位点 中存在同源基因缺失现象。相同的等位基因失衡模 式 (等位基因缺失或保留 )存在于 16例病人 ( 89% ) 的原发癌和相应转移灶中 ,提示二者有相同的克隆来 源。在余下的 2例 (11% )中 ,一个或多个位点存在不 一致的等位基因丢失模式。如第 1例中 D9S161在原 发癌中没有发生等位基因缺失 ,而在转移灶中发生了 缺失。 图 1　膀胱癌 LO H电泳条带型图 F ig. 1　A lle lic Lo ss p a tte rn o f p ro s ta te ca nce r A: case 5; B: case 9; N: normal; P: p rimary tumor; M: me2 tastases tumor. A rrow shows A llelic Loss. 3　讨论 肿瘤细胞染色体中某些杂合性位点的等位基因 丢失称为 LOH。一般认为 LOH是肿瘤抑制基因变异 的重要分子特征 ,也是某些正常细胞性质发生转化的 重要标志。不同病理类型的肿瘤 ,在其发生过程中变 28 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 1期 李 　光等 :膀胱癌等位基因缺失研究 表 1　膀胱原发癌与转移癌等位基因丢失模式的比较 Ta b. 1　Com p a riso n o f a lle lic lo s s p a tte rn in m a rche d p rim a ry a nd m e ta s ta tic b lade r ca nce r Case No Tumor Age / Sex Grade Stage D9S161 D9S171 IFNA TP53 1 P 52 /M H igh PT3 NL NL NL NL M 1 NL NL NL 2 P 51 /M H igh PT3 2 1 2 N I M 2 1 2 N I 3 P 72 /M H igh PT2b 1 NL NL 1 M 1 NL NL 1 4 P 65 /M H igh PT2b 1 1 1 2 M 1 1 1 2 5 P 86 /F H igh PT3 2 2 2 1 M 2 2 2 1 6 P 57 /M H igh PT3 N I 1 2 N I M N I 1 2 N I 7 P 77 /F H igh PT2b 2 2 N I N I M 2 2 N I N I 8 P 68 /M H igh PT3 N I NL N I N I M N I NL N I N I 9 P 57 /M H igh PT3 2 2 2 2 M 2 2 2 2 10 P 54 /M H igh PT3 2 2 2 2 M 2 2 2 2 11 P 66 /M H igh PT3 N I NL N I N I M N I NL N I N I 12 P 76 /F H igh PT2b 2 2 N I N I M 2 2 N I N I 13 P 54 /M H igh PT3 N I 1 2 N I M N I 1 2 N I 14 P 77 /M H igh PT3 2 2 2 1 M 2 2 2 1 15 P 66 /M H igh PT2b 1 1 1 2 M 1 1 1 2 16 P 71 /M H igh PT2b 1 NL NL 1 M 1 NL NL 1 17 P 52 /M H igh PT3 2 1 2 N I M 2 1 2 N I 18 P 53 /M H igh PT3 NL NL NL NL M 1 NL NL NL P: p rimary tumor; M: metastases tumor; N I: no informative; NL: no loss of alleles; 1: loss an upper allele; 2: loss a lower allele. 异的肿瘤抑制基因类型也不尽相同。有的是在肿瘤 早期启动阶段起作用 ,有的则是在进展期恶性演进阶 段才起作用 ,有的还与肿瘤转移及预后有关。 本研究在 18例原发性膀胱癌中发现有 16例在 原发癌及转移灶中存在相同的等位基因缺失或保留 模式 , 2例在转移灶中存在等位基因缺失而在其对应 原发癌中并不发生 ,表明在膀胱癌进展及随后的转移 过程中可能存在相同的等位基因失衡模式 ,研究结果 还表明在肿瘤进展及转移过程中可能会产生额外的 等位基因缺失 ,而在不同位点具有相同的等位基因缺 失 ,表明它们可能来源于同一克隆 ,这一观点已被广 泛接受 [ 6, 13 ]。本研究结果与他人对原发性乳腺癌及 其相应转移灶的研究结果类似 , Bonsing等 [ 7 ]发现在 原发癌中 ,每个等位基因位点失衡均存在于相应的淋 巴结转移灶中 ,提示进展的原发性乳腺癌来源于一个 单克隆细胞并且在所有原发癌和转移灶中建立了足 量的等位基因失衡。Chen等 [ 8 ]在原发性乳腺癌及相 应转移灶中也有相同的报道。而另一研究 [ 12 ]的结果 表明在前列腺原发癌及相应的转移灶中存在高比例 的不一致等位基因缺失模式 (42% ) ,包括在原发癌及 转移灶中分别存在等位基因缺失和保留以及二者丢 失不同的等位基因 ,可能是由于转移灶并非来自所取 38 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 首 都 医 科 大 学 学 报 第 29卷 的肿瘤细胞群体。另有研究 [ 4 - 6 ]表明 ,单独分离的肿 瘤具有不同的遗传组成 ,同个病例的多发性肿瘤可能 是独自产生的 ,但对膀胱癌多个散发灶的 LOH研究 表明它们的单克隆起源 [ 14 ]。等位基因缺失是肿瘤发 生过程中的重要事件 ,同时这些遗传变化将在以后的 分子演变过程中得以保留。M iyao等 [ 15 ]对 14例膀胱 癌及转移灶的研究发现 ,二者存在相同的遗传缺陷 , LOH频率 9p为 64% , 17p为 78% ,没有报道丢失保留 方式。因此猜测在膀胱癌进展的不同时期 ,可在染色 体 9p21区及 P53区检测到高度保守的等位基因缺失 模式 ,这将有助于了解膀胱癌转移进展的分子机制。 Hartmann等 [ 16 ]在对膀胱原发癌 ( carcinoma in si2 tu, C IS)和膀胱移行上皮中度非典型增生 (DⅡ)的研 究中发现 ,染色体 9p21区域及 17p13区均可检测到 LOH,其中在原发癌 9p21的 LOH为 86% ,染色体 17p TP53位点为 84% ;在膀胱移行上皮中度非典型性 (D Ⅱ)增生 9p21 区 LOH 为 75% , TP53 位点 LOH 为 53%。P53基因突变检出率 C IS为 72% , DⅡ为 67% , 提示有肿瘤抑制基因 P16和 P53的失活 ,表明在未形 成病理的移行细胞癌之前 ,部分病例已出现了基因水 平的改变 ,提示这 2个区域的 LOH及 P53基因突变 是膀胱癌变过程的早期事件。 总之 ,本研究结果提示在膀胱癌进展及随后的转 移过程中可能存在相同的等位基因失衡模式。转移 癌可在原发癌的基础上进一步遗传演变。因此当转 移癌的原发癌未定来源时 ,这些位点的 LOH可以作 为膀胱移行癌的标志物。 4　参考文献 [ 1 ]　Wodhouse E C, Chuaqui R F, L iotta. General mechanism s of metastasis[ J ]. Cancer, 1997, 80: 1529 - 1537. [ 2 ]　Frost P, Levin B. 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