桑国俊 卵母细胞体外培养技术研究

nullnull桑国俊 甘肃省畜牧兽医研究所 null一 发展背景 二 试验内容 三 结果与分析 四 总结一 发展背景一 发展背景null 随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展，胚胎需求量日益增加，单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限，不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系，挖掘优良母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义null牛胚胎体外生产技术的累积效率低、技术复杂、实验条件高，受培养基、卵泡液、共培养细胞等因素影响大，还缺乏统一的理论依据和程序化的，仍处于探索阶段。因此，还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系二 试验内容二 试验内容null试验内容…技术路线种公牛鲜精冻精洗涤、离心精子获能母牛超排卵巢采卵IVMIVFIVC桑、囊胚COCsnull试验内容…试验设计 1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响 1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响 2 卵母细胞体外受精 2.1 不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.2 不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响 null3 胚胎体外培养 3.1 共培养体系对胚胎发育的影响 3.2 培养液体积对胚胎发育的影响 4 冷冻保存COCs的培养 4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响 4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响 SPSS统计分析三 结果与分析三 结果与分析null1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响 选择A、B级COCs进行成熟培养C 级COCsnull1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响 卵母细胞的成熟率与卵泡直径关系密切，在卵母细胞体外培养过程中，宜选择卵巢发育正常的卵泡采集，而不宜选择发育过大或过小的边际卵泡null2 卵母细胞体外受精 2.1不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响 ①二次离心沉淀液：精子活力0.44；获能效果10min最高为0.41，15min为0.32，超活化以15min时最好；受精率为40.19% ②二次离心上清液：精子活力0.56；获能效果10min最高0.59，15min时较低为0.585，超活化也以15min时最好；受精率为43.21%null从试验结果看，宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法，避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路，而直接对上清液进行离心处理，获得了理想的精子洗涤和获能效果精子获能 活 力 超活化效果null2.2 不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响 室温上浮法： 20～24℃室温。上浮60min，45min活力最高0.68，对其获能15min后进行体外受精，平均受精率41.40%null恒温上浮法：CO2培养箱（38.5℃）上浮60min，30min活力最高0.697，对其获能15min体外受精，受精率41.51%null二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著（p＞0.05），恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化而变化，始终处于不稳定状态，精子活力升降比较零乱，而恒温上浮的条件稳定，精子活力升降序列比较整齐，在本试验中的优势虽不明显，如从可控角度考虑，还以恒温上浮法为宜 培养液.xls受精率获能方法 与卵母细胞受精率null2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响 本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.0～1.5×106个/mlnull3 胚胎体外培养 3.1 卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响null卵母细胞体外胚的发育受到多种因素的影响，培养过程中要摸拟卵母细胞或胚胎在子宫中的条件，给细胞发育创造良好的环境。卵母细胞体外受精过程中明显存在发育阻滞，克服发育阻滞的主要手段是用共培养系统提高卵裂率和桑、囊胚发育率。本试验通过添加共培养物质，较好地克服了体外胚的发育阻滞null3.2 培养液体积对胚胎发育的影响null大体积培养液培养的体外胚、 桑、囊胚率均较高于微滴培养 胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的变化而改变；培养液体积过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效地促进胚胎正常发育null4 冷冻保存COCs的解冻培养 4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响 COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养 冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存（p＞0.05） ，但EG的效果比较好null成熟率桑椹胚率囊胚率null4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响 以麦管和OPS管作为冷冻载体，二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养 OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法（p＞0.05），而麦管法宜于操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法null成熟率桑椹胚率囊胚率null4.3 COCs冷冻方法的比较 COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致，整体效果的优势序列为EG法＞GL法＞OPS管法＞麦管法 玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法四 总结四 总结null1 COCs级别 选择A、B级COCs进行卵母细胞成熟培养 2 卵泡大小 选择直径2～8mm卵泡的COCs进行卵母细胞成熟培养 3 离心法精子获能 对第一次离心上清液继续进行低速离心处理，可获得更好的精子洗涤和获能效果。低速离心 4 上浮法精子获能 选用恒温上浮法进行精子洗涤和获能 5 获能精子浓度 用于体外受精的适宜精子浓度为1.0～1.5×106个/ml 6 共培养系统 卵丘细胞+bFF 共培养系统能显著促进体外胚的发育null7 培养液体积 大体积培养液培养的桑、囊胚率均较高于微滴培养，大体积培养液更有利于胚胎发育 8 冷冻COCs解冻培养 ① 冷冻保护剂EG和GL对COCs有良好的冷冻保存作用， EG效果比GL更好 ② OPS管玻璃化冷冻效果优于麦管法，麦管法宜于操作和储存，建议在实际操作中选用麦管法 ③ 程序化一步法冷冻COCs的效果优于玻璃化冷冻法 null1 卵母细胞及体外胚培养：选择2～8mm卵泡的A、B级COCs，清选后移入500μl成熟培养液中培养24h；拣取成熟良好卵母细胞，用上清液二次离心法或恒温上浮法清选和获能的精液体外授精8h，在加入卵丘细胞和bFF的IVC液中继续培养120～140h，拣取桑椹胚和囊胚 2 卵母细胞的冷冻保存：选择2～8mm卵泡A、B级COCs，用以EG为冷冻保护剂的麦管程序化一步法进行冷冻保存 3 冷冻卵母细胞的解冻培养 ：冷冻卵母细胞解冻后，拣取卵丘细胞完整的COCs按照正常卵母细胞进行培养根据以上试验结果，卵母细胞培养、体外胚培养、卵母细胞冻存和解冻培养的操作程序概括为：主要创新点主要创新点1 系统研究了牛卵母细胞体外培养技术，突破发育阻滞，将卵母细胞体外培养到桑、囊胚 2 对卵母细胞进行冷冻保存，探索了COCs的冷冻方法，并对冷冻效果进行了评定 3 建立了新的精子洗涤和获能方法null