中国医科大学
硕士学位论文
5-脂氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究
姓名:马壮
申请学位级别:硕士
专业:急诊医学
指导教师:金抗
20090401
·中文论著摘要·
5一脂氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究
目 的
百草枯(paraquat,PQ)1962作为除草剂上市后,在130多个国家广泛使用,
1966年首次报道百草枯中毒致死病例【l】。PQ中毒可引起多脏器损害,肺是其作用
的主要靶器官,
现为急性肺泡炎和迅速进展的肺间质纤维化,是PQ中毒死亡的
主要原因。因此百草枯中毒的治疗主要集中在减轻肺损伤。百草枯的中毒机制尚
未完全阐明,大量研究证实,以多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,
PMN)为主的炎性细胞与多种细胞因子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性细
胞因子网络失控已逐渐成为国内外研究者关注的焦点,而如何调控炎性细胞因子
的过度释放,使细胞因子网络恢复平衡状态也已成为研究热点。白三烯
(1eukotrienes,LTs)是重要的炎症介质。肺脏是花生四烯酸的主要合成场所,LTs是
经由5-@氧化酶(5.1ipoxygenase,5-LO)途径的主要花生四烯酸产物,它由肺泡
巨噬细胞和中性粒细胞合成释放。LTs通过刺激骨髓多功能造血干细胞以及这些细
胞在血液中的游走而影响白细胞。白三烯还能增加粘附分子的表达(故而增强白
细胞对微血管的粘附能力),促进细胞运动,使其向靶器官组织游移。一旦白细胞
到达炎症组织局部,白三烯可增强其生存力和活性。白三烯主要介导中性粒细胞、
单核巨噬细胞、肥大细胞的募集【2】。白三烯在肺脏炎症反应中对白细胞的趋化作
用,可能激发肺脏炎症反应的瀑布效应【3】。在Baud等的研究中5-LO的下游产物LT
对纤维细胞的迁移,增殖以及基质蛋白的增生有直接的作用【4】。外源性给予LTD4
可以引起鼠类及人类的纤维细胞增殖并且这种增殖呈剂量依赖性【5】。研究表明,
LTs作为一种重要的前炎症介质,在许多炎性疾病发病机制中的重要作用已被逐渐
认识,但其在PQ中毒发病过程中的作用尚不清楚。本研究的目的旨在从炎性细胞
的角度探讨5-@氧化酶与PQ中毒肺损伤的相关性。
材料与方法
1、动物分组
健康雌性Wistar大自鼠40只,完全随机分成对照组和染毒组,染毒组以百
草枯50mg/kg体重灌胃染毒,对照组给以等量的生理盐水。分别于1d,3d,7d,
14d处死lO只,进行支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定,应用RT-PCR反应、
免疫组织化学方法,观察5一L0在mRNA和蛋白水平的变化。
2、支气管肺泡灌洗液的测定
采用在体全肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液,共收集到支气管肺泡灌洗液约
5ml。1500rpm,4℃,离一险lOmin,将离心沉淀的细胞团用0.3ml生理盐水悬
浮,制成细胞悬液。用全自动血细胞计数仪(AC900型)测定支气管肺泡灌洗液白
细胞总数【6】。
3、RNA提取及RT—PCR
用TRIZOL提取总RNA,反转录成cDNA.5-LO基因上游引物
5’.CTCCCAGTGACCACAGAA.3’,下游引物5’.ATACCGAACACCTCAGACA
一3’,扩增片段长496bp,B—actin作为内对照(扩增片段247bp)。循环条件:95
℃,变性5min,94℃30s一54℃lmin-72℃30s,35个循环,72℃延伸5min。15%琼脂
糖凝胶电泳
。
4、免疫组织化学
肺组织石蜡切片免疫组织化学方法检测5-LO蛋白表达,用链霉菌抗生物素蛋
白一过氧化酶染色法,按试剂盒说明书操作。
结果
1、病理变化
HE染色切片观察,染毒后ld肺泡结构清晰可见,肺泡腔内可见少量炎性细
胞的渗出;染毒后3d肺泡结构可辨认,肺泡腔内可见大量炎性细胞的渗出;染毒
后7d肺泡结构尚可辨认,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,同时肺泡腔内渗出液开
始机化;染毒后14d肺泡结构不清晰,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,但较前有
2
所减少,可见纤维化样改变。
2、BALF中WBC总数的变化
染毒组大鼠BALF中WBC总数比对照组均有统计学意义俨
规定,即:研究生在
攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离
校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学,且导师
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印或其他手段保存论文。
论文作者签名: 墨互圭
指导教师签名:么鱼左世
日
·论文·
5-@氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究
刖 吾
百草枯(paraquat,PQ,1,l’一二甲基一4,4’一联吡啶二氯化物)1962
作为除草剂上市后,在130多个国家广泛使用,1966年首次报道百草枯中毒致死
病例【11。PQ中毒可引起多脏器损害,肺是其作用的主要靶器官,表现为急性肺泡
炎和迅速进展的肺间质纤维化,是PQ中毒死亡的主要原因。因此百草枯中毒的治
疗主要集中在减轻肺损伤。百草枯的中毒机制尚未完全阐明,大量研究证实,以
多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,PMN)为主的炎性细胞与多种细
胞因子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性细胞因子网络失控已逐渐成为国
内外研究者关注的焦点,而如何调控炎性细胞因子的过度释放,使细胞因子网络
恢复平衡状态也已成为研究热点。白三烯(1eukotrienes,LTs)是重要的炎症介质。
肺脏是花生四烯酸的主要合成场所,LTs是经由5一L0途径的主要花生四烯酸产物,
它由肺泡巨噬细胞和中性粒细胞合成释放。LTs通过刺激骨髓多功能造血干细胞
以及这些细胞在血液中的游走而影响白细胞。白三烯还能增加粘附分子的表达(故
而增强白细胞对微血管的粘附能力),促进细胞运动,使其向靶器官组织游移。一
旦白细胞到达炎症组织局部,白三烯可增强其生存力和活性。白三烯主要介导中
性粒细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞的募集【2】。白三烯在肺脏炎症反应中对白细
胞的趋化作用,可能激发肺脏炎症反应的瀑布效应【31。在Baud等的研究中5一Lo
的下游产物LT对纤维细胞的迁移,增殖以及基质蛋白的增生有直接的作用【4】。外
源性给予LTD4可以引起鼠类及人类的纤维细胞增殖并且这种增殖呈剂量依赖性
【5】。研究表明,LTs作为一种重要的前炎症介质,在许多炎性疾病发病机制中的
重要作用已被逐渐认识,但其在急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)发病过程中
的作用尚不清楚。本研究的目的旨在从炎性细胞的角度探讨5-@氧化酶与百草枯
肺损伤的相关性。
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一、实验材料
实验方法
1、材料
健康雌性Wistar大白鼠40只,体重(180±20)g,由中国医科大学动物中
心提供。
2、主要仪器
(1)HeidolphDIfiX600匀浆器(德国)
(2)PCR扩增仪(480,2400,9600型PE公司)
(3)HERMLEZ323K台式低温超速离心机(美国)
(4)台式高速离心机(TGL-16G上海生物仪器厂)
(5)凝胶自动成像仪GDS8000(UVP美国8io—Rad公司)
(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(BIo_RAD)
(7)电泳仪(BIO-RAD.Model250/2.5,Sweden)
(8)电泳槽(BIo-RAD.MINIPROTEANIITM,Sweden)
(9)水浴锅(LKB,WestGermany)
(10)水平摇床
(11)转膜电泳槽
(12)动物天平
(13)石蜡包埋机
(14)石蜡切片机
3、相关分子生物学实验材料
(1) 20%百草枯溶液购自英国捷利康有限公司
(2)TaqDNA聚合酶、dNTP(Takara公司)
(3) 细胞变性裂解液(碧云天生物技术研究所)
(4) 免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)
(5) 琼脂糖(Takara公司)
lO
(6) 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(MERCK公司)
(7)PCR引物(上海生工生物工程有限公司)
(8) RT-PCR反应试剂盒(Takara公司)
(9) SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所)
(10)5一Lo多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)
(11)其它常用试剂:1MTris.HCL,1.5MTris.HCL,PH8.0,TE缓冲液,Tris-
甘氨酸电泳缓冲液(参照分子克隆实验指南配制)
二、实验方法
健康雌性Wistar大白鼠40只,体重(180_+20)g。完全随机分成对照组和
染毒组,染毒组以百草枯50mg/kg体重灌胃染毒,对照组给以等量的生理盐水。
分别于ld,3d,7d,14d处死10只,进行支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定,
应用RT-PCR反应、免疫组织化学方法,观察5一Lo在mRNA和蛋白水平的变化。
1、支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定
采用在体全肺肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液,将7号塑料输液管的针头端
剪掉,留出约3cm长的一段输液管,将该段输液管的一端套在5ml注射器上,暴
露气管,在气管上剪一小切口,将输液管插入气管腔内,并用止血钳固定。将2ml、
37℃无菌生理盐水缓慢注入肺内,间隔30s后,将其抽回,如此进行3次,共收
集到支气管肺泡灌洗液约5ml。1500rpm,4℃,离,5,10min,将离心沉淀的细胞团
用0.3ml生理盐水悬浮,制成细胞悬液。用全自动血细胞计数仪(AC900型)测定
支气管肺泡灌洗液白细胞总到61。
2、RNA提取及RT—PCR
2.1、肺组织总RNA提取
取肺组织,用高压灭菌后的锡箔纸包裹后于液氮中冻lOmin,击碎后移入2ml
无菌Eppendorf管中。加入lmlTRIZOL试剂,组织匀浆后室温静止5min。加0.2ml
氯仿涡旋振荡15s,室温放置2--一一3min。4。C、12000rpm离心20min,将上清移
入另一新管,加入0.5ml异丙醇混匀,室温放置lOmin。4"C、12000rpm离心
lOmin,弃上清,留置RNA沉淀,加75%乙醇(DEPC水配制)lml,涡旋漂洗一次,
4"C、7500rpm离心5min。弃上清,RNA沉淀放置室温,空气干燥15min。最后
RNA沉淀溶于相等量的0.01%Depc-treatedwater,取少量RNA用于含量及纯度
测定,其余分装后置-80"C保存备用。
2.2、RT—PCR
(1)eDNA第一链合成
用反转录试剂盒将总RNA逆转录成eDNA第一链,反应体积20pl,反应体
系如下:
MgCl:(25ⅡlM)4.0Il1
10XBuffer 2.0U1
dNTP(10mM) 2.0pl
RNasinRibonucleaseinhibitor(1u/la1) O.5ll1
hMVReverseTranscriptase 0.6pl
Oligod(T)。5Primer 1.0pl
总RNA 1.Ou1
ddH:0 8.9Ul
总体积 20.0pl
99℃5min变性,42℃1h,一20℃保存。
(2)引物设计
用Primer5设计5-LO基因和夕-actin基因引物。引物由上海生物生工有限
公司合成(表4)。
表4,扩增魁馑因和夕-actinmRNA的引物序列
12
反应体系:
eDNA
10×Buffer
MgCl2(25mM)
dNTP(2mM)
目的基因上游引物(20州)
目的基因下游引物(20PIH)
∥-actin上游引物(20州)
夕-actin下游引物(20删)
7aq酶(5u/“1)
ddH:0
总体积 25.0Il1
反应条件:
94℃5min
l
94℃35s
/ \ 35cycles
52℃40s一72℃1min
l
72℃5min
l
4℃保存
(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,用安莱图像分析仪扫描和Chemilmager5500
软件分析半定量。
3、免疫组织化学
3.1标本制备,术前大鼠腹腔注10%水合氯醛30mg/kg体重,待大鼠麻醉后
固定四肢,仰卧位固定于操作台上。打开胸腔,迅速取出肺组织,一半迅速放入4
%多聚甲醛中固定,常规制备石蜡切片,用于免疫组织化学和免疫荧光染色;一
l
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l
1
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乙
m
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仉
仉
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K
半于一800C保存备用。免疫组织化学方法检测5一L0蛋白表达,用链霉菌抗生物素
蛋白一过氧化酶染色法,按试剂盒说明书操作。
3.2石蜡切片二甲苯脱蜡2次,30min/次,继而应用100%、90%、70%乙醇依
次5min,PBS洗3次,5min/次,进行切片的水化。
3.3加过氧化物酶阻断液A灭活内源性过氧化物酶,室温下孵育10min,PBS
洗3次。
3.4抗原修复,切片放入柠檬酸盐缓冲液煮沸8min(小火),冷却后取出;PBS
洗3次,5min/次。
3.5加非免疫性动物血清封闭液B,室温下孵育10min,甩去血清。
3.6加第一抗体40C过夜,PBS洗3次。
3.7加生物素标记的二抗C,室温下孵育10min,PBS洗3次。
3.8加链亲和素.过氧化物酶溶液D,室温下孵育10min,PBS洗3次。
3.9加DAB显色,待显色后自来水冲洗,苏木素复染,脱水,中性树胶封固。
3.10免疫组化染色分析:以不加一抗的正常切片为阴性对照。
三、统计学分析
应用SPSSl3.0ForWindows软件处理数据。生化指标以均数±
差(J±S)
表示,采用独立样本t检验(independent-samplest test)。相关性分析采用双变量
Pearson相关分析。P
证明 超氧负离子
在PQ中毒中具有重要的作用。另外,暴露于高氧状态下,可以加重PQ中毒也进
一步证明分子氧在介导中毒方面的作用。
2.1.2细胞内NADPH氧化NADPH是细胞内使百草枯还原的主要还原剂,
NADPH的消耗导致依赖NADPH的生化过程中断。有证据表明服用百草枯降低大鼠肺
内NADPH含量,肺内戊糖旁路酶类迅速增高,提示NADPH需求升高。
2.1.3脂质过氧化反应使细胞多不饱和脂肪酸氧化变性。脂质过氧化物,
即多不饱和脂肪酸的氧化变性产物是PQ中毒的可能机制,有关研究显示中毒动物
体内脂质过氧化物明显升高;组织或细胞内谷胱甘肽含量较低时,更易PQ中毒,
因为还原型谷胱甘肽(GSH)可能在拮抗百草枯的氧化作用发挥重要作用。
2.2炎性细胞
已证实PQ肺损伤所致的炎性反应特征表现为肺内皮和上皮细胞膜受损,血
管通透性增加,膜脂质氧化物和多形核白细胞浸润(PMN),并随服毒量增大,
PMN浸润加型41。Roc圮,o等【51研究表明将30mg/l【g百草枯注入大鼠腹腔244'时后
出现严重急性肺损伤(ALI),间质水肿,肺泡内出血,分叶核白细胞和单核细胞
炎症,透明膜形成,肺内皮细胞和上皮细胞通透性增加;蛋白丰富的水肿液聚集
在间质和肺泡间隔,从而导致动脉缺氧,肺顺应性降低,呼吸功增加。近年来,
对ALI/ARDS的认识逐步发展致对炎症发生、调控的认识。大量研究证实,以多形
核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,PMN)为主的炎性细胞与多种细胞因
子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性