免疫组织化学技术

免疫组织化学技术（石蜡切片） 免疫组织化学技术（石蜡切片） 免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(酶、荧光素、金属离子、同位素)显色来确定组织、细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry，ICC)。     一、标本制备   石蜡切片：组织取材、固定、包埋，切片（一般的组织化学染色切片厚度要求5～7 µm，常规病理切片2～3 µm）     二、实验试剂   PBS、柠檬酸三钠·2H2O、30%H2O2、柠檬酸、山羊血清、第一抗体、第二抗体     三、操作步骤：   1 石蜡切片60℃预热10～20分钟。   2 常规脱蜡水合：二甲苯5分钟，2次→无水乙醇5分钟，2次→95％乙醇5分钟，2次→75％乙醇5分钟1次→ddH2O 5分钟1次。   3 PBS洗 3次，5分钟/次。   4 抗原修复：用0.1M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）于微波炉(750W煮沸3分钟，90W11.5分钟)修复后，组织切片自然晾至室温。   5 封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2室温湿盒孵育10分钟。   6 PBS洗 3次，5分钟/次。   7 正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟。   8 一抗孵育：将组织切片于稀释的一抗溶液中4℃湿盒孵育过夜。   9 室温复温15分钟。   10 PBS洗 3次，5分钟/次。   11 二抗室温湿盒孵育30～60分钟。   12 PBS洗 3次，5分钟/次。   13 DAB显色，室温1～10分钟，显微镜下掌控。   14 ddH2O洗 3次，5分钟/次。   15 苏木素复染1～10分钟，1％盐酸酒精分化，显微镜下掌控。   16 脱水：95％乙醇2次，10分钟/次→无水乙醇2次，10分钟/次。   透明：二甲苯2次，10分钟/次。   中性树胶封片。 苏木精-伊红染色（HE染色） HE染色是一种以形态为基础，结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术，用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构。 基本原理：去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。 一般染色组织切片厚度为3µm左右，中枢神经系统6～8µm，肾小球基底膜染色观察时要求1.5～2µm标准厚度。 一、石蜡切片 1  60℃预热10～20分钟。 2  常规脱蜡水合：二甲苯5分钟，2次→无水乙醇5分钟，2次→95％乙醇5分钟，2次→75％乙醇5分钟1次→ddH2O 5分钟1次。 3  苏木素复染1-10分钟，显微镜下掌控。 4  ddH2O洗。 5  1％盐酸酒精分化。 6  ddH2O返蓝。 7  1％伊红溶液染色，显微镜下掌控。 8  ddH2O洗。 9  脱水，透明，中性树胶封片。 二、细胞爬片 1  将细胞种于干净盖玻片上。 2  PBS洗细胞3次，5分钟/次。 3  4%甲醛固定30分钟。 4  PBS洗 3次，5分钟/次。 5  苏木素染色1～5分钟，显微镜下掌控。 6  水洗返蓝。 7  1％盐酸酒精分化（视情况决定是否进行此步操作）。 8  1％伊红溶液染色20分钟，显微镜下掌控。 9  脱水，透明，封片。 染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色。细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被伊红Y染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1M） pH 0.1M柠檬酸 0.1M柠檬酸钠 pH 0.1M柠檬酸 0.1M柠檬酸钠（ml） 3.0 18.6 1.4 5.0 8.2 11.8 3.2 17.2 2.8 5.2 7.3 12.7 3.4 16.0 4.0 5.4 6.4 13.6 3.6 14.9 5.1 5.6 5.5 14.5 3.8 14.0 6.0 5.8 4.7 15.3 4.0 13.1 6.9 6.0 3.8 16.2 4.2 12.3 7.7 6.2 2.8 17.2 4.4 11.4 8.6 6.4 2.0 18.0 4.6 10.3 9.7 6.6 1.4 18.6 4.8 9.2 10.8 C6H8O7·H2O分子量＝210.14 0.1M溶液含21.01g/L Na3C6H5O7·2H2O分子量＝294.12 0.1M溶液含29.41g/L