硝酸还原酶活性的测定

硝酸还原酶活性的测定 实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵(或注射器)、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)、0.2mol/L KNO);磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO 32标准溶液: a—萘胺试剂配制:0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制:取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO标准溶液:1克NaNO用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水22 定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO5ug，用时稀释之。 2 磷酸缓冲液: 贮备液A:0.2mol/L NaHPO溶液(27.8g NaHPO?HO配成1000ml)。 24242 贮备液B:0.2 mol/L NaHPO溶液(53.65g NaHPO?7HO或NaHPO?12HO 配成1000ml) 24242242 取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于——NO还原于NO 32—+—+NO+NADHNO+NAD+HO 3 22--产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO的含量22的高低，即表明酶活性的大小。 -NO含量的测定用磺胺(对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide)比色法，这种方法非常灵2 敏，能测定每m10.5ug的NaNO。 2 四、方法步骤 1(将新鲜叶片(蓖麻、烟草、木茨叶等)水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，(或每份取50个叶圆片)，分别置于含有下列溶液的三角瓶中，(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真3 空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，(如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中)，将三角 -瓶置于30?温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘 -油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO的产生。 2-2(NO含量的测定 2 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一 萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定，比色时用520nm波长， --记下光密度，从标准曲线上查得NO含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO22表示之。 3(绘制标准曲线 -测定NO的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1ug/ml的NaNO含量，可于0,5ug/ml22 浓度范围内绘制标准曲线。 吸取不同浓度的溶液(例如5、4、3、2、1、0.5ug/ml)1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及一萘胺试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟(或于一定温度的水浴中保温30分钟)立 -即于分光光色计下进行比色，(波长520nm)，读取光密度，然后，以光密度为纵坐标，NO2浓度为横坐标，于毫米方格纸上绘制光密度——浓度曲线。 五、实验报告 计算所测材料硝酸还原酶的活性。 六、思考 1、试比较不同植物的硝酸还原酶活性。 2、试比较取样前植物处于光照或黑暗条件下酶活性有什么不同。 附表: xmlA+ymlB.稀释至200ml PH x Y pH x Y 5.7 93.5 6.5 6.9 45.0 55.0 5.8 92.0 8.0 7.0 39.0 61.0 5.9 90.0 10.0 7.1 33.0 67.0 6.0 87.7 12.3 7.2 28.0 72.0 6.1 85.0 15.0 7.3 23.0 77.0 6.2 81.5 18.5 7.4 19.0 81.0 6.3 77.5 22.5 7.5 16.0 84.0 6.4 73.5 26.5 7.6 13.0 87.0 6.5 68.5 31.5 7.7 10.5 89.5 6.6 62.5 37.5 7.8 8.5 91.5 6.7 56.5 43.5 7.9 7.0 93.0 6.8 51.0 49.0 8.0 5.3 94.7