50岁以上无症状人群大肠癌的筛查及miR21、miR143与大肠癌相关性研究

50岁以上无症状人群大肠癌的筛查及miR21、miR143与大肠癌相关性研究 50岁以上无症状人群大肠癌的筛查及miR21、miR143 与大肠癌相关性研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。本学 位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要 内容相关的论文,第一署名为单位河北医科大学,试验、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则 研究生签名: 律 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中 特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 碱雌轹,之叫 币\ 乏尹 聊? 励目 录 中文摘要? 英文摘要英文缩写研究论文岁以上无症状人群大肠癌的筛查及、与 大肠癌相关性研究 引言第一部分岁以上无症状人群大肠癌的筛查 前言日舌材料与方法结果附表讨论小结?一. 参考文献 第二部分 、与大肠癌相关性研究 前言刖舌材料与方法结果附图讨论小结参考文献 结论?一??. 综述一与结直肠癌的关系? 综述二粪便隐血试验筛查大肠癌 致谢? 个人简历??中文摘要 岁以上无症状人群大肠癌的筛查及 .、.与大肠癌相关性研究 摘 要 大肠癌发病率高、危害程度高。一般认为,高脂肪、高蛋白和低纤维 饮食易引起大肠癌。大肠癌好发于岁以上人群,男性多见。临床常见 血便或粘液血便,大便性状或习惯发生改变,腹痛,腹部包块等。 流行病学资料显示,大肠癌的发病率、死亡率逐年上升。目前,大肠 癌已成为中国三大癌症之一,其发病率正在以.%的速度递增,明显快 于国际其他国家速度。大肠癌的发生发展有一个漫长的过程,正常大肠上 皮细胞从异型增生到腺瘤样变再到癌变,大约要年时间。正是由于病 变过程的缓慢性,为临床干预提供了极好的条件。 目前,我国制定了大肠癌筛查、防治共识意见,为临床筛查提供了医 学依据。意见认为,结合我国实际情况,针对大规模人群筛查的措施有两 种,即粪便隐血试验法法和内镜筛查。大肠癌筛查正在全国各 地陆续展开。 目的: 对岁以上无症状人群,采用问卷调查法和血红蛋白/转铁蛋白联 合免疫法便隐血试验胶体金双联检测试纸法检测粪便隐血,进行大肠 癌早期筛查。对筛查出的腺瘤性息肉、癌前病变和早期癌进行内镜下切除 或手术治疗,从而有效降低大肠癌的发病率、死亡率和病死率。 对发现的腺瘤、癌变病人,在征得患者本人或其家属知情同意后, 留取病变标本。采用.技术,检测、 在正常大肠组织、腺瘤组织及癌变组织中的表 达,以期为大肠癌早期诊断找到特异度较高的生物学标记物。 本研究包括两部分内容。 第一部分岁以上无症状人群大肠癌的筛查 对象年月至年月在河北医科大学第二医院体检中中文摘要 心接受体检的岁以上无症状人群。排除已经明确的消化道肿瘤患者, 特别是直肠癌、结肠癌患者。 方法在受检者签署知情同意书及问卷调查表后,按要求正确留取 一份粪便标本,交予工作人员。工作人员在规定时间内完成粪便隐血试验。 粪便隐血检查采用胶体金双联检测试纸法,阳性者告知受检者或家 属。 结果共筛查人,高危人群人,检出率为.%;双联免 疫法阳性者人,检出率为.%。接受电子结肠镜检查者共 人,检查大肠癌例,大肠癌检出率/万;检出大肠息肉 例,检出率.%;大肠息肉进行内镜下治疗例,治疗率.%; 检出溃疡性结肠炎例,检出率.%。 结论共筛查人,高危人群人,检出率为.%;双联免 疫法阳性者人,检出率为.%。接受电子结肠镜检查者共 人,检查大肠癌例,大肠癌检出率 /万;检出大肠息肉 例,检出率.%;大肠息肉进行内镜下治疗例,治疗率.%; 检出溃疡性结肠炎例,检出率.%。 第二部分、与大肠癌相关性研究 对象通过筛查发现,粪便隐血试验阳性受检者或问卷调查高危人 群者,积极引导其行内镜检查。 方法 内镜下,对于发现的息肉等小病变,积极嵌除,随诊观察; 对于发现的恶性病变,积极处理。嵌取正常大肠组织、腺瘤组织、癌变组 织各份,快速冰冻处理。采用技术,检测、 在三中不同组织中的表达情况。 结果检测在大肠正常组织、腺瘤组织及癌组织中,随恶性 程度增加,表达上调,表达具有差异性,.;检测诹在大肠 正常组织、腺瘤组织及癌组织中,随恶性程度增加,表达具有差异性,表 达下调尸.。 结论随恶性程度升高,表达逐渐上调,表达逐渐 下调,其可能参与了结直肠癌的发生发展,有望成为大肠癌患者作为早期中 文摘要英文摘要一 、 曲,, . .舶 , ,, . , , , . ,,, . .,, ,, ., . ., .,, . : , . , 英文摘要,. , , , , . ? , , , , . .????』 ? 一量,. , . . , , . ., .%. , , ,/ , ,; , .%; .%; , , .%..%. ,, , / ; , .%; , 英文摘要 , .%; .%. 、, ‘ 。.,, , 一 . , , ,,., , , ,,.; ,, , ,.. ,.,. .,.: ; ; ; ; ;英文缩写 英文缩写 英文名称 英文缩写 中文全称 大肠癌粪便隐血试验 愈创木脂化学法 ??免疫法 耶?肿瘤标记物微小核糖核酸 血红蛋白 耵. 转铁蛋白平均风险 ?瓜中危高危 ?炎症性肠病 癌胚抗原实时逆转录聚合酶链反应 研究论文 岁以上无症状人群大肠癌的筛查及 、 与大肠癌相关性研究 引 言 大肠癌指结肠癌和直肠癌。大肠癌是一种恶性比较高的肿瘤, 严重影响到人们生活质量。这种疾病不止在西方国家多见,随着东方人生 活方式的西化,在亚洲国家也日益多见。美国年度肿瘤统计中提到, 针对大肠癌,将会在年制定新的防治指南【】。在中国、日本等亚洲 国家,也展开了大规模人群筛查。 大肠癌早期筛查有多种方式,有基于粪便、血液【】为筛查材料的方式, 还有就是行电子内镜、检查等筛查手段。每种方法各有优缺点,敏感 度和特异度各家报道不同。由于每种方法使用成本各异,其用途也不同。 有的方法用于大规模人群筛查,如法;而有的方法用于初诊后的进 一步确诊。 在目前情况下,针对大规模人群,被临床证实为最实用的方法是粪便 潜血试验法法【】。这种方法经济、高效、方便、易操作,被临 床医生及广大患者所接受。 最近,及其甲基化研究是研究热点,也被应 用到大肠癌筛查和诊断、治疗上。及其甲基化研究属于表观遗传 学范畴。主要是通过与靶碱基互补配对,引起对的 降解或翻译抑制,从而在转录后水平调控基因的表达【】。其甲基化是:约 %的基因启动子区含有岛,高甲基化修饰可以直接抑制 的表达,或者通过对转录因子甲基化修饰间接调控其相关的 ,在肿瘤发生中具有重要调控作用。有研究【】提取结直肠癌患者粪 便中,通过扩增及,检贝基因甲基化水平。认为,结直 肠癌组织基因甲基化异常发生率高;这种甲基化异常可作为早期 诊断的肿瘤标志物。 年,我国制订了《中国结直肠肿瘤筛查、早诊早治和综合预防共 识意见》。根据《意见》,本研究针对岁以上无症状人群,采用问卷调 查法和血红蛋/转铁蛋白联合免疫法粪便隐血试验,进行大肠癌早期筛研究 论文 查。一旦发现大肠癌高危人群或粪便隐血试验阳性人群,积极劝导其行结 肠镜检查。发现病变,对症处理,达到早期发现、早期治疗的目的。 在患者知情同意下,本研究嵌取正常大肠组织、腺瘤组织及癌变组织 各份,应用?技术,检钡、在三种不同组织中的 表达情况,以为临床上早期诊断大肠癌及大肠癌的治疗寻找新的途径。研究 论文 第一部分 岁以上无症状人群大肠癌的筛查 大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,为提高 大肠癌的早期诊断率,降低其死亡率,因此开展大肠癌的普查意义重大, 大肠癌的筛查方法多种多样,本次筛查我们采用大肠癌高危因素问卷调查 法和血红蛋/转铁蛋白联合免疫法粪便隐血试验。 材料与方法 研究对象 .以年月至年月在河北医科大学第二医院体检中心接受 体检的岁以上无症状人群为研究对形象。入组者均无明显上消化道症 状及明确的消化道疾病;无严重肺、心、肝、肾及神经、精神疾病;无长 期服用质子泵抑制剂等药物,排除明确的消化道肿瘤等疾病。该项研究通 过河北医科大学第二医院伦理委员会伦理审查批准。所有受检者均签署知 情同意书。 .标本采集所有受检者留取新鲜粪便标本.克,该标本中不得含有 尿液。粪便标本在采集后小时内送到实验室统一检测。 .主要试剂 隐血免疫双连检测试剂盒胶体金法 万华普曼生物工程有限公司 一站式定量采便器 万华普曼生物工程有限公司 .具体方法有以下三部分组成。首先受检者签署知情同意书及问卷调查 表,了解本实验的步骤、目的及意义;其次,受检者留取一份粪便标本, 并交予工作人员统一检测;最后,粪便隐血试验阳性患者有专业人员完成 结肠镜检查。 ..对年月至年月在河北医科大学第二医院体检中心接 受体检的岁以上无症状人群进行问卷调查。问卷调查表如附表所示。研究论 文 填完表格后正确留取粪便。 其高危因素问卷调查表阳性即符合高危人群判断为符合以下 任何一项或以上者: ...一级亲属父母、子女或亲兄弟姐妹患有大肠癌史; ...本人有癌症史或肠息肉史; ...同时具有以下两项及两项以上者:慢性便秘、慢性腹泻、粘液血 便、不愉快的回忆史如离婚、近亲属死亡等、慢性阑尾炎史、慢性胆 囊炎或胆结石史。 备注:慢性腹泻指近年来腹泻累计持续超过个月,每次发作持续时间 在周以上。 慢性便秘指近年来便秘每年在个月以上。 不愉快回忆史须发生在近年内,并在事件发生后对调查对象造成 较大精神创伤、痛苦。 ..在规定时间内等条件下对粪便标本进行隐血实验。采用北京市万华 普曼生物工程有限公司生产的一站式定量采便器和隐血免疫双连检测试 剂盒胶体金法,按照说明书进行操作。 具体操作步骤如下所示: ...采便 用采便棒个点采取粪便以全部覆盖采便器远端螺旋状沟槽为宜; ...混合 将采便棒放回采便器内,拧紧顶端盖,与溶液充分混匀; ...加样 将采便器顶端盖拧下,将滴粪便悬液滴入双孔板型检测板的加样 孔中; ...结果 分钟内直接在观察孔中读取结果,分钟后显示结果无效; ... 如实记录结果,并将结果告诉受检者或其家属。 ..结果解释 双板孔型检测板上有两条反应线,即反应线、。当反应线呈现紫 红色时,则定义为有效,反之无效。具体如下:研究论文 阳性:控制线与反应线同时出现一条色带,表明标本有 隐性出血。 阴性:只在控制线出现一条色带,反应线无色带出现, 表明标本无隐性出血。 无效:控制线和反应线均无色带出现,或只在反应线 出现一条色带,表明试验无效,应用新条重新测试。 .统计分析 统计岁以上无症状人群粪便隐血试验阳性率,其数值用百分比表 示。统计粪便隐血试验阳性患者病因分类及比例,数值用百分比表示。 统计分析采用.统计软件,运用检验对结果进行分析, .认为差异有显著性意义。 结 果 高危因素问卷调查法和血红蛋/转铁蛋白联合免疫法便隐血试验在大 肠癌筛查中的应用 共筛查人,高危人群人,检出率为.%,其联合免疫法 阳性者人,阳性率.%;联合免疫法筛查人,其阳性 者人,检出率为.%。 不同人群大肠癌及癌前病变检出比较 高危人群实际接受结肠镜检查人,检出大肠癌例,大肠癌检出 率为./万;检出大肠息肉例,检出率.%;大肠息肉进行 内镜下治疗例,治疗率.%;检出溃疡性结肠炎例,检出率.%; 联合免疫法阳性人群接受电子结肠镜检查者共人,检查大肠癌例, /万;检出大肠息肉例,检出率.%;大肠 大肠癌检出率 息肉进行内镜下治疗例,治疗率.%;检出溃疡性结肠炎例, 检出率.%。 共有女性受检者人、男性受检者人,人数基本相当。具 体如 、所示。 联合免疫法阳性人群共有人完成结肠镜检查,并嵌取病理标本, 由资深资格的病理医师完成病理。显示结果如 所示。研究论文 病变解剖部位分布 观察 ,不难发现肠道息肉、腺瘤及癌变占.%。通过镜下观 察及病理报告,息肉的发生率最高,腺瘤及结直肠癌的发生率较低。如 所示。 统计 结肠息肉发病率高于直肠息肉发病率,两者具有统计学意义, .。研究论文 附 表岁以上无症状大肠癌的筛查与早期防治 岁以上患者或家属问卷调查 序号 姓名?一性别?一年龄???一 欢迎您来到河北医科大学第二医院就诊。为了方便您的就诊,请您在 就诊之前回答一下问题,在选择的答案后打勾即可。 请将本问卷在就诊时交给消化科医生,您的回答将有助于医生对您病情的 了解与判断。 、您的父母、子女或亲兄弟姐妹中是否有结直肠癌病史是口否口 、您本人是否有肠息肉病史 是口否口 、您本人是否有肿瘤或癌症病史 是口否口 、您是否有过大便潜血阳性又叫便检查阳性 是口否口 是口否口 、您是否有过慢性便秘 、您是否有过慢性腹泻 是口否口 是口否口 、您大便带过粘液或血吗 、您有过慢性阑尾炎吗 是口否口 、您有过胆囊炎或胆结石吗 是口否口 、您的生活中有过不愉快的回忆吗 是口否口 、您的体重?一公斤,您的身高?厘米,您曾做过??.手术。 、您每天吸烟?一支,您每天喝酒?一克。 、大肠镜检查结果:??一一 、大肠镜检查病理报告:??。 以下项目有医生填写: 问卷总评分:一 评分分三类:.分高级别腺瘤危险处于平均水平,、 ?分中危,凇、 .分高危,腿。研究论文 ?????? ............... ??? 研究论文 研究论文 讨 论 大肠癌是人类社会中发病率和致残致死率比较高的恶性肿瘤之一,其 严重损害人类健康。文献报道,年美国新发肿瘤中,大肠癌新发 例,居消化道肿瘤第一位,全身各系统肿瘤第四位。在亚洲【,由 于缺乏相应的筛查指南,大肠癌的发病率在直线上升。目前,亚洲各国家 发病率不尽相同。如日本,大肠癌的发病率于美国相近;而东南亚国家发 病率相对较低。 本研究首次针对岁以上无症状人群进行大肠癌筛查,采用的技术 方法是粪便隐血试验胶体金法。粪便隐血试验用于筛查大肠癌,临床 上有大量报道。其筛查的有效率、价格优势也是公认的。在本次筛查中, 入围人,隐血试验阳性约.%。对阳性人群进一步行电子结肠镜 检查及治疗,共发现结直肠息肉人,结直肠腺瘤人,结直肠癌 人。本筛查与其他相关筛查结果一致。在本筛查中,我们关注了大肠癌发 生的危险因素,如:抽烟、饮酒、慢性阑尾炎、慢性胆囊炎、胆囊切除术 等。 基于大肠癌的筛查是针对大范围人群的,其筛查应具有经济、方便、 易操作等特点,因此不管是美国,还是中国大肠癌筛查指南【、】,都提到 将粪便隐血试验、结肠镜检查等作为首选手段。由于费用和难操作等缺点, 建议暂不将粪便检测、模拟肠镜用于人群筛查【】。但有一点必须 明确,粪便隐血试验只能作为筛查用,不具有确诊价值;结肠镜下取病理 才能做出最后诊断。 除了法,还有一些其他方法用于大肠癌的早期筛查。粪便 检测是粪便脱落细胞筛查的一种。关于粪便脱落细胞筛查大肠癌,主要有 两种检测手段。一种是检测分子;另一种是检测非分子,如单 克隆抗体、端粒酶等。文献中提到检测粪便细胞中、等基因,或 用单克隆抗体检测癌相关抗原等方法筛查大肠癌【。或采用检测、 等基因的方法【,都具有一定的实用性。 虽然粪便检测暂不用于普通人群的筛查,不过,由于其取材方 便、经济、无创,且是在基因水平对疾病做出的诊断,随着检测技术的不 断提高,其越来越受到重视。如所提到的,主要检测的有?、研究论文 .、、、等【。其中前两种是与大肠癌有关的癌基因, 后三种是抑癌基因。可以明确的是,、基因用于筛查大肠癌的特 异性并不高,是因为它们在其他肿瘤中同样表达。现在已知,基因 是与家族性腺瘤息肉病密切相关的基因,并且在大多数大肠癌患者中均可 以检测到这种基因。基因也在大肠癌发生发展过程中作用明显。其 它的还有长片段、甲基化。 关于免疫法粪便隐血试验筛查大肠癌,襄风华等报道【,在对入选的 例患者中,分结肠镜正常组 例,炎症性肠病组例,大肠息 肉组侈其中腺瘤型息肉例,高危腺瘤例和大肠癌组例,当便隐 血试验阳性阈值为/时,各组特异度为.%,各组敏感度分 别为.%组、.%大肠癌组、.%腺瘤型息肉组、 .%高危腺瘤组和.%大肠息肉组,与阳性阈值为 / 和 /时相比较均无显著差异伊.。认为,该方法具有较高 的灵敏性和特异性【。赵燕颖等报道【,通过对低度危险组、可疑组、 高度危险组的例患者进行免疫法粪便隐血试验,其阳性率依次升高, 差异具有统计学意义,.。认为,该方法可以作为早期筛查大肠癌 的主要方法。日本学者报道【,免疫法粪便隐血试验可以提高大肠癌的筛 查率。关于转铁蛋白法筛查大肠癌。有研究报道【,通过队列分析方法, 认为转铁蛋白法是用于筛查大肠癌及癌前病变的良好方法。杨瑞霞等【 对例确诊为消化道出血患者的粪便标本采用单克隆血红蛋白法和单克 隆转铁蛋白法进行隐血试验,发现,前者阳性率为.%,后者为.%, 两者在诊断上、下消化道出血方面意义不同。认为,两种方法联合更利于 消化道出血的诊断。关于粪便转铁蛋白和免疫隐血试验联合应用筛查大肠 癌,北京军区总医院报道【,两者联合检测能提高结直肠癌和进展期腺瘤 的检出率。他们对例受试者接受上述两种方法检查,其中 例 .%至少相结果为阳性。阳性患者中,共有例接受结肠镜检查, 发现例结直肠癌和例进展期腺瘤。两种方法联合比应用一种方法明显 提高了结直肠癌和进展期腺瘤的检出率,具有统计学意义。 基于材料为粪便的筛查手段,临床上发现通过检测丙酮酸激酶同工酶 类型来筛查大肠癌,具有很高的灵敏度和特异性【。数据显示,该方 法的灵敏度从的%到的%,从的%到的研究论文 %,远远高于的%.%;特异度也较隐血试验高,这种方法 在筛查腺瘤方面同样具有非凡的价值。 除上述介绍的几种筛查方法,另外还有一些方法也被应用于临床中。 如,检测血清中生物标记物,像细胞学化验、和标记、可溶 性蛋白质分子等。 等报道,通过检测血清中的可溶性免疫分子 指标筛查大肠癌【。年,杂志刊登一篇文献【?,通过让经 过特殊训练过的犬闻气味来诊断早期大肠癌,文章说,这种方法使诊断的 灵敏度和特异度分别提高到%、%。 另外,早已在临床上广泛应用的方法就是肿瘤抗原标记物的检测,如 、、.等。早在年,就有文献报道可作为大 肠癌预后指标【。但是,这些传统肿瘤抗原标记物的灵敏度和特异度有待 提高。台湾省. 医生追踪报道【】,一位岁女性患者因患有 伴有淋巴结转移的升结肠腺癌,在行部分结肠切除术并化疗后,年时间 内,其变化从手术初的. /到最高时的. /,但患者 身体健康,没有癌症复发或患有其他疾病的征兆。因此,这位医生认为, 的升高与结肠癌的转移并不密切相关。 尽管临床上有这么多方法可供选择,不过,通过比较,法取材 方便、价格低廉、易于操作等优势,仍是目前最有价值的方法。 大肠癌的早期筛查是早期发现、早期治疗的前提。了解大肠癌的致病 因素,可以针对性地预防大肠癌的发生。目前认为,大肠癌与遗传因素、 环境因素等相关。可能与饮食结构改变、人自身因素变化同样有关。大规 模流行病学研究资料显示,男性大肠癌发病率高于女性,提示生活习惯, 如抽烟等可以引起疾病。【】有研究证实,减少酒精消耗量可能会降低大肠 癌的发生率。 除了已经明确的遗传因素,目前研究发现慢性胆囊炎、胆囊结石等疾 掣】对.年期间 病与大肠癌的发生有关。澳大利亚人 发表在,,数据库上的文献进行分析,最 终共有篇文献纳入研究范围,,人中有,诊断为结肠腺瘤, 。人患有胆结石或行胆囊切除术。发现腺瘤与结石的值., %可信区间为...;腺瘤与胆囊切除术的值.,%可信区间 为...。从而得出结论,胆囊结石可以增加结肠腺瘤的危险性。文研究论文 献提示【、】,在行胆囊切除术后,同样容易引发大肠癌。韩艳庆等在对 .年期间国内发表的篇文章进行荟萃分析后发现【,胆囊切除 术、胆囊结石可以增加大肠癌发生的危险性,并且胆囊结石与大肠癌的发 生关系更为密切。 饮食改变也是导致大肠癌的致病因素之一,食物中来源的 与结直肠癌的关系是研究热点。 的缺乏可以导致结直肠癌等疾 等川通过对美国、日本、欧洲等国家和地区 病的发生【、。 的多中心研究资料进行分析,外周血液中的浓度水平与结肠 癌密切相关,与直肠癌强相关。另有学者进一步探讨了和 ? 共同影响大肠癌及其作用机制。美欧学者 等【】采用 微阵列分析和实时荧光定量.技术,研究人类结肠癌细胞株 ., ,,,一,,和 . 及 诱导后的表达情况。他们认为,被 诱导后的对结肠癌的发展起到抑制作用。 本研究存在以下缺陷:?本研究仅针对慢性阑尾炎等大肠癌高危因素 展开调查,不能对其他因素进行研究;?由于调查人群数量大,资料统计 不完整,存在偏倚。上述缺陷有待多家医疗中心共同完成、提高受检人员 依从性来弥补。本研究对岁以上无症状人群的大肠癌筛查,初步明确大 肠病变情况及危险因素,对于宣传医学知识、提高人群医疗意识有很大帮 助。 小 结 岁以上无症状健康体检人群中大肠癌高危人群占.‰其联合免 疫法便隐血试验阳性者占.%。 高危人群联合免疫法便隐血试验的阳性率明显高于无症状非高危人 群。 参考文献 ., , .. 研究论文 . , . .;:? 龙 驰,胡义德,曹正怀.血清多肿瘤标志物蛋白芯片检测结果在结直 肠癌诊断中的价值.第三军医大学学报.;:., , , . . :. /一 ., , : , .. ;: 赵慧霞,李秋文,董伟伟,等.粪便基因甲基化检测在结直肠癌 早期诊断中的应用研究/.中华临床医师杂志:电子版.; :? ; ; , ..;:., .. .;一 中华医学会消化病学分会《中国结直肠肿瘤筛查、早诊早治和综合预 防共识意见一》.中华消化杂志.;:.., . .;: ; ? 孟明明,李世荣.粪便脱落细胞及其标志物检测筛查大肠癌的研究现 状.胃肠病学和肝病学杂志.;:. 陈燕,李兆申,蔡全才等.粪便脱落细胞检测应用于大肠癌筛查的研 ? 究进展.第二军医大学学报.;: . , , , . ,,:? 裴风华,张会涛,杜雅菊等.免疫法便隐血试验对大肠良恶性疾病的诊断 价值研究胃肠病学和肝病学杂志.;:. 赵燕颖,秦国涛,颜波群等.免疫法便隐血试验和血癌胚抗原对大肠癌早 研究论文 . 期诊断的意义中国临床研究. ;: ; : .. , , : ; :? 杨瑞霞,凌芸,马蔡昀等.粪转铁蛋白检测的临床应用.南京医科大学 学报自然科学版.;:. 金鹏,武子涛,李爱琴等.粪便转铁蛋白和免疫隐血试验在结直肠癌中 筛查效能的比较.胃肠病学和肝病学杂志.;:. . , ,:: . . . ; :? . . , . . ;:? . , , , ..; 、析 :. ,..,,.,,.., . .....;: ? . . ;: . , ,,. .;:? ., : .;:? . . , ::? ; .研究论文 . , . .;:? 韩艳庆,刘媛,戚峰.胆囊结石或胆囊切除术与大肠癌关系的分析.中 国中西医结合外科杂.;:.,.,.,. .? , . . .... : ; . ,., ,.,,.. ,.., ? .. , ,,,., ., , , . : ’ . .;:? . ? , , . , . .;:?研究论文 第二部分 、与大肠癌相关性研究 前言 大肠癌是一种复杂的基因相关疾病,其发生发展伴随基因学变化。 在大肠癌的发生发展中起着癌基因或抑癌基因的作用。本研究选 择、,检测其在大肠癌不同发展阶段的表达变化,抑明确 其在大肠癌发生发展中的作用。 材料与方法 组织来源 在筛查后行电子结肠镜检查患者中,嵌取腺瘤组织及癌变组织各 .岁。距离癌 例,均经病理证实。其中男例,女例,平均.土 变组织、腺瘤组织以上肠粘膜作为正常组织。全部病例均为接受化 疗及放疗。标本采集后迅速放至液氮中冷冻,.?保存。 .引物与合成 由数据库查找基因序列,使用软件.进行引物 及探针的设计。上游引物’..’,下游引 物’.姐陌.’,扩增片段长 ;上游引 物’。.’,下’一.’, 扩增片段长 上游引物’一一’, ; 下游引物’..’,扩增片段长 。 . 检测标本中、表达 ..试剂及仪器 试剂 美国公司 焦磷酸二乙酯 上海生物工程公司 异丙醇 东风化工厂 无水乙醇 东风化工厂研究论文 天津博迪化工有限公司 天津博迪化工有限公司 瑚. 天津博迪化工有限公司 天津博迪化工有限公司 天津博迪化工有限公司 公司公司 公司 ?? 公司 公司 胶回收试剂盒 杭州公司 超低温冰箱 德国贺利氏公司 高速低温离心机 德国公司 低速台式离心机 德国公司 紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司 汗凝胶成像系统 美国公司 微量移液器 德国公司 电子天平 德国公司 水平电泳仪 北京市六一仪器厂 .. 提取 将称重冷冻的组织约.放入预冷好的研钵中,用研杵研磨组织, 期间不断加液氮,直至组织被研磨成粉状。 ,并完全覆盖 向每.研磨成粉状的的有样品中加入 样品。 室温静止?。 、待样品完全融化后,用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转 移至个.约/管,室温静置后,。,离心 后,把上清转于至新的.离心管中。 每液体中加入/体积的氯仿,用手上下颠倒混匀,直至溶液呈 乳白色,无分相现象。 室温静止,。,离心,离心过程中准备新的.研究论文 离心管。 从离心机上小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,上层是透明的水 层,溶解在此层中,半固体状的中间层,此层中包含,另外, 粉红色的有机溶剂下层,蛋白质,多糖等物质溶解在此层中。 把上层溶液小心移到新的离心管中,大约每个离心管中能取出, 谨慎操作,勿吸到中间层。 加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管,充分混匀。 室温静置,,?离心.。 可在离心后的离心管底部观察到少量的白色沉淀。 小心弃上清。 向含有沉淀的离心管中缓慢加入,.。预冷的%的乙醇,轻轻 上下颠倒,清洗沉淀。 ?离心.。 用移液枪除去上清。 将离心管用桌上小离心机再次离心,用移液枪仔细将残存的离心管底 部的少量液体出去。 打开离心管盖,室温放置干燥。溶解沉淀,保存在.。冰箱中。 用 .. 浓度测定与稀释 浓度测定 紫外分光光度计测定所有样本的、、波长值, 计算出样本浓度及量。 标准曲线的稀释 在. 中用稀释标准品。一个阴性对照 只添加 和标准曲线制作所需要的个标准样品的稀释。 具体步骤如下: 准备个.离心管,在管盖上分别标记上编号、、、、、。 。 每个离心管中加入 在标记的离心管中加入起始溶液,吸打几次冲洗的枪头。 震荡混合稀释的溶液,离心收集液。 样品的稀释研究论文 在.离心管中将 稀释成统一浓度。 .. 反应 用上述稀释完的继续下面反应。 ... 加尾反应和反转录反应。 按下列组份配制反应液.% . 至 反应条件如下 ??向得到的反应液中添加 补足至。取稀 释液加入到下一步的反应体系中,进行定量检测。 ... 反应。 按下列组份配制反应液反应液配制在冰上进行。 进行反应。 采用下列图表显示的两步法反应程序。如.所示 .统计学分析 试验所得数据以;土表示,配对设计两两比较采用检验,以. 为差异具有统计学意义,所有数据采用 .统计软件完成。 结 果 提取 电泳结果和值结果显示从组织样品中提取出的 纯度较 好,且/大部分都在...之间。、条带清晰,说明总 的纯度和完整度复合标准。如.所示 .标准曲线 管家基因、、的标准曲线如.、、所示。研究论文 .实时荧光定量扩增曲线 在工作原理中,以值表示目的基因出现指数增长的最低 循环数。其与反应体系中目的基因的实际拷贝数直接相关并呈反比。在本 次试验中,三种基因的扩增曲线为一组典型的倒型曲线,说明扩增效率 高。如.、、所示 .实时荧光定量熔解曲线 理想的熔解曲线应为单峰型,如果反应中含有非特异性扩增产物, 那么熔解曲线出现双峰或多峰现象。在本次试验中,均为单峰曲线,并 且,在不同样本中,其同一基因的熔解温度大致相同,说明扩增的特异 性较好。如.、、所示 . 、在不同组织的相对表达量 检测显示在腺瘤组织较正常组织中表达上调.倍 .. ..,差异具有统计学意义.; .., 在癌组织较正常组织中表达上调.倍.. 差异具有统计学意义.;在腺瘤组织与癌组织表达有差异,具 有统计学意义.。如.所示 检测显示在腺瘤组织较正常组织中表达下调.倍 .. .土.,差异具有统计学意义.; 在癌组织较正常组织中表达下调.倍.. ..,差异具有统计学意义.。在腺瘤组织与癌组织 表达有差异,具有统计学意义.。如.所示研究论文 附 图 “ 户?‘? ??’‘ ‰’?‘? :预变性 ??神: ’ , 葺 ? 。 : ?秒 . ?? ‘ :反应 / : , \ ?秒 。。黼 蝴 ’ ????“蝴 蚺尊 韩薯 张 辩? 撼? 豁? ?秒 螗? ?嚣 蚺嚣 舶告 ??‘,两?”蚺 赫秘 醇? 岱豫黼霸????:、 毯融 潮磷黼鳞鞠瞄湫 ? 蠡蠢 扫?埘 静“ ?‘ 媾獬 、’ : 辆?翱??五 矗彝 ; ?矗 “ . ; 知?槲节缸哺 垂 鑫 研究论文 研究论文研究论文研究论文 胁锄 ?户.研究论文?/. 研究论文 讨 论 自从第一个即一被发现以来,人们通过研究逐渐发现 其与人类全身肿瘤亦密切相关。近年来,在大肠癌的生物学行为 中,所起到的作用也逐渐被认识。有学者就其两者关系进行综述。该文献 报道,在大肠癌的病理学和临床上的发生发展、演变等过程中, 始终发挥着关键的作用;文献中还就其作用机制进行了探讨【。 在本研究中,选择大肠组织由正常进展到癌变的不同时期病理标本, 即选择正常组织、腺瘤组织、大肠癌组织标本,均经病理证实。对上述三 种病理组织标本,应用技术,分别检测其中、 的表达情况,初步探讨上述两种微小是否可作为早期筛查大肠癌的 生物学标记物。 本研究结果显示在腺瘤、癌变组织中较正常组织表达上调, 且与恶性程度呈正相关;在腺瘤、癌变组织中较正常组织表达下 调,且与恶性程度呈负相关。 与人类肿瘤的研究涉及到全身各系统及器官,特别在消化系 统方面。与大肠癌的关系,促进大肠癌的进展。 等报道,应用 技术,对例大肠癌病理标本及对应正常大肠组织研究,结果显 示, 在癌组织中高表达,分级越高及细胞分化程度越低,表达量越 大,其敏感度为.%,特异度为.%。 等【】研究发现, 提取位健康志愿者和例日性经内镜证实为癌变人群粪便, 经.等技术,检表达变化。结果显示,表达量在 癌变组织与正常组织中有显著差异.。结论为,粪便中 可作为大肠肿瘤筛查的新型生物学标记物。 为了进一步说明在不同病理状态下的表达情况,有学者引入肿 瘤抑制蛋。 等蝴等技术,在人类大肠癌 细胞株、 、、、、、、 及,分别检测、蛋白、 的表达。结果显 示,通过某一特定机制抑带 的表达; 促进大肠肿瘤 的侵袭、血管内渗和转移。日本学者也证实了上述结论。日本学者【】应用 锁核酸探针和原位杂交技术,在例大肠肿瘤组织和例内镜下切除的大研究论 文 肠息肉组织中,检贝的表达情况。结果显示,在具有癌变可能的腺 瘤组织中检测到的表达,且随着腺瘤恶性程度的增加,其表达量呈 上升趋势。应用肿瘤抑制蛋白,进一步证实的上述表达。 因此,他们认为,可能会被作为大肠癌诊断的生物学标记物。 在大肠癌发生发展的过程中,通过不同的机制进行调节。 作用于发挥调节机制, 等报道【】,应用. 、 及微阵列分析等技术,在人类大肠癌细胞株和 中,通过作用于大肠癌细胞分裂.、.期,观察 蛋白质生成量及表达。显示促进细胞分裂,进而促进大肠癌 进展。另有研究报道,与通过调节蛋白,进而调 节肿瘤的进展。 除了在结直肠癌中异常表达,在其他消化器官器官及其他各系 统中也出现异常表达。如胃癌【、、肝癌【】、胰腺癌【】、头颈部上皮细胞 肿瘤【。 同一样,与人类全身肿瘤也密切相关。不过,不同 的是,在肿瘤的发生发展过程中起到抑制作用。先来说说其与结 直肠癌的关系,. 等人【】应用.技术,检测 在例早期大肠癌组织及相对应正常组织中的差异性表达。显示, 在结肠癌中表达下调,值.;而在直肠癌中,较正常组织 表达无变化,值.。 抑制大肠癌的作用机制介绍如下。 等研究【】,应用 .、微阵列分析等技术,检测在正常大肠组织和癌变组织 中的表达差异,用基因验证其差异性。结果显示,抑制了 基因的表达,抑制大肠癌的进展。在大肠癌的生物治疗方面的研究, .【 】等选择.氟尿嘧啶作用于人类大肠癌细胞株 ,他们应用.、 等技术,使细胞暴露在不同浓 度的下,通过特定方式记录蛋白质生成及细胞分裂情况。结果显示, 可以抑制大肠癌细胞分化,增强化疗药物作用等。等报道 ,调节结肠癌转移相关因子抑制肿瘤细胞的侵 袭和转移。【 等报道【】,调节甲基转移 酶发挥肿瘤抑制作用,他们推论这为肿瘤的治疗找到了潜在的手段。