蛋白质芯片技术及生物医学应用

蛋白质芯片技术及生物医学应用 摘要 蛋白质芯片技术是一种新型蛋白质技术，基于1995年所提出的光学生物传感器的概念，可以在很小的面积上，通过表面格式化和表面改性，以阵列式集成多种蛋白质活性，利用生物分子的特异结合性和高分辨的光学成像相结合，仅需微量生理或生物采样，即可以同时检测、识别和纯化不同的生物分子和研究分子间的相互作用。无需预处理和样品标记，可以直接测量像血浆、尿、唾液、淋巴液和细胞裂解液等生理样品。它的高空间分辨率和高通量的特点，可以同时完成多元分析物或多样本的重复性分析，具有快速和高复现的特点。此芯片技术可用于快速、原位的蛋白质医学诊断，药物筛选和蛋白质功能分析。 关键词:蛋白质芯片、蛋白质分析、椭偏成像、表面改性 一、 蛋白质芯片的目的和意义 生物芯片技术具有并行、快速和自动化分析的特点，和广泛的应用前景，成为二十一世纪生物医学工程的研究热点。生物芯片技术包括:基因芯片即DNA芯片、蛋白质芯片或叫做生物分子芯片、细胞芯片和组织芯片，以及药物芯片、生物电子芯片、仿神经网络等技术。 蛋白质是构成生命体的最小活性单位，按目前的认识，人体中存在着十万种以上的蛋白质，在肌体中各尽职守，功能各异。随着人类对于蛋白质的认识，对于了解人体的健康状况，诊断和治疗，越来越多地需要识别和检测蛋白质，并认识其生理功能，这是非常艰巨和繁重的工作。 蛋白质的组成具有多样性和可变性，蛋白质的表达受着多种因素的调控，在生命发育不同阶段的蛋白质的种类和构成是不一样的，不同的组织中细胞表达的蛋白质也有很大的差异，在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常过程中的也不同，因此，蛋白质研究是在一个更加深入、和更贴近生命本质的层面上去探讨和发现生命活动的规律和揭示重要生理、病理现象的本质。 光学蛋白质芯片系统是探测和研究蛋白质的新技术。此方法将高分辨率的光学显微成像技术和集成化多元蛋白质芯片技术相结合，形成了新型的并行、快速生物分子识别和检测技术。它不需要任何添加剂，对生物活性无影响，还可以检测生物分子反应的动力学参数,从而获得很多传统技术所难以提供的信息，而且还可以广泛地用于生物医学研究、健康预测、临床诊断、新药筛选和鉴定以及生物工业流程中的活性监测等。 二、 蛋白质芯片研究的主要内容及研制过程 概括地讲，蛋白质芯片技术主要包括五部分内容:1)芯片;2)配基装配;3)芯片反应器;4)芯片信号采样和处理;5)芯片数据库。 蛋白质芯片是一种蕴含多学科知识的系统工程，为蛋白质分析和检测提供新型技术平台。它不仅仅局限于蛋白质检测，还可以用于蛋白质识别，特意位点研究、药物 筛选，以至蛋白纯化等。根据用途，进行蛋白质芯片的设计。以疾病相关蛋白质的检测为例，在诊断乙型肝炎时，国际公认的检测指标为五项(HBsAg乙肝表面抗原，anti-HBsAg乙肝表面抗原抗体，HBeAg乙肝e抗原，anti- HBeAg乙肝e抗原抗体和anti-HBcAg乙肝核心抗原抗体)，通常需要在医院的化验室里经过两天到一周的时间，用常规免疫检测的方法逐项进行。如果采用蛋白质芯片来检测，可以在一片乙肝诊断芯片上装配检测该五项的配体，即可在30分钟内同时完成五项检测。 在检测对象确定以后，芯片设计的一个重要环节就是确立特异性生物学系统，即具有生物特异结合性的分子对或分子组合，如:配体,受体;蛋白,蛋白;抗原,抗体;病毒,受体，等等;并优选配基。以此为基础实现配基和待测生物分子在芯片表面上的特异性复合。 随着分子生物学和生物化学的发展，人们已经认识到生物分子是一些空间结构非常复杂的有机大分子，而生物活性则仅仅表现在某些特定位点上。配基的使用实际上是配基分子上活性位点的利用。蛋白质芯片是由多个表面生物探针组合而成，配基固定于表面上。通常由于生物分子与芯片基底表面的相互作用，会造成生物分子在表面的变形和变性，使生物活性减弱甚至消失。为了充分保持配基在芯片表面上的生物活性，需要设计芯片表面的蛋白质活性装配，将涉及基底的选择，生物相容性、表明化学性质、光学特性。为此进行表面改性，包括物理、化学、生物化学及其组合表面改性，以适合配基的装配。为了获得高灵敏的检测，配基的来源、装配点、活性位点、表面位阻、非特意性阻隔、特异活性维持等诸问题，都需要统筹考虑和解决。 一个典型的蛋白质检测芯片是一个组合多种生物活性探针的微小表面，表面积可以从平方毫米到平方厘米量级，视需要而定。当检测时，活性表面要与待测的生物分子溶液接触，即需要芯片反应器。分子表面相互作用、分子间相互作用、多面元独立处理和样品检测的串、并行、反应条件、结合速率、试剂用量、清洗、均一性等问题将在微小的芯片反应器中得到体现。 在芯片的不同区域内，所装配的各种配体与待测溶液中所对应的生物分子发生特异性结合，生成生物分子复合物，就会改变芯片表面的形貌。此变化可以通过芯片检测系统来获得芯片数据的采集和处理。此芯片检测系统是一种具有高空间分辩率的光机电组合的非接触型光学显微成像系统，它的控制、设置、调试、稳定性、噪声、时空分辩率、均一性、校对、信号采集、多元信息处理以及人机对话等均由计算机自动化操控。 由于蛋白质的种类繁多，仅人体内就超过十万种，蛋白质芯片数据库将为用户提供:蛋白质种类、配基，试验条件，定、动态检测结果等参考和各种应用的积累结果。 1998年11月，该实验室系统通过中国科学院专家组的鉴定和验收，认为其性能指标达到国际领先水平。 三、蛋白质芯片的特点 (1) 直接测量非纯化分析物 在进行生物分子的特异性结合研究时，可以直接测量非纯化分析物。 (2) 多元样品同时检测 由于观测的样品面积大，所以能够用于多元样品观察，在同一表面上可以同时观察几个、几十个、上百个以至更多样品单元。此技术可以同时检测体液中的多种蛋白质，可以同时测量多对生物分子:包括蛋白质、核酸、多糖、磷脂、甚至生物小分子，以及侯选药物的分子间相互作用的情况。它提供了同时分析多元分子溶液综合信 息和多样品检测的技术手段。 (3) 样品用量少 采用了可以达到次单分子膜层分辨能力的光学成像技术和集成蛋白质芯片技术，样品用量仅在10微升量级。 (4) 样品无需任何标记物 直接测量生物分子的特异性结合所形成的生物分子复合物，并不需要象酶联免疫或放射免疫法那样对生物分子作标记，不会对待测生物分子活性造成任何扰动和损伤。 (5) 实时检测生物分子相互作用的动态过程 可以实时测量多对生物分子的分子间相互作用过程，如分子间是否存在特异性结合、结合的强度和速度、解离的快慢以及结合部位的分析，可以获得生物分子反应的动力学信息。 (6) 具有分辨和排除干扰信号能力 面阵式芯片测量具有分辨和排除干扰信号能力。 (7) 检测速度快 电子图像采样具有快速摄取图像的能力，为生物分子动力学研究提供了可能。 (8) 结果直观 检测结果均以数字图像形式输出，可以进行定性和定量测量。 四、 生物医学应用及发展前景 利用蛋白质芯片已经开展了一些生物医学应用。如:乙型肝炎表面抗原的检测;研究了配体和受体的特异结合(白介素 6);进行了内分泌激素的测定尝试;实验多种抗原-抗体相互作用研究;鉴定治疗肝癌的单克隆抗体药物，其中所测量的肝癌细胞裂解液成分复杂，是其它免疫学方法所不能测量的;以及病毒检测，蛋白质的竞争吸附和细胞黏附的研究等。 单克隆抗体药物与肝癌细胞裂 解液反应形成的复合膜层 单克隆抗体药物膜层 芯片基底 图1. 鉴定治疗肝癌的单克隆抗体药物。单克隆抗体药 物与肝癌细胞裂解液有明显的阳性反应。 B A 图2. 蛋白质芯片检测乙型肝炎表面抗原。同时在A 、B两点上固定单克隆抗 体后，A点同阴性血清反应，B点同含有1ng/ml的乙型肝炎表面抗原的血清 反应30分钟。同A点相比，B点出现明显的抗原抗体复合膜层。 HSA/antiHSA IgG/antiIgG IgG HSA BSA BSA Fib 基底 基底 图3. 多元蛋白质芯片同时检测多种生物分子。(A)多元蛋白质芯片上同时固定Fib/antiFib (A) 了牛血清白蛋白(BSA)、人免疫球蛋白G(IgG)、人血纤维蛋白原(Fib)和 人血清白蛋白(HSA)。(B)蛋白质芯片与含有人免疫球蛋白G(IgG)、人血 纤维蛋白原(Fib)和人血清白蛋白(HSA)抗体的血清反应后，生成了相应的抗此成果为医学诊断、药物筛选和分子生物学的研究和发展，开辟了新的途径。由原抗体复合膜层。牛血清白蛋白(BSA)膜层厚度没有增长，因血清中无牛血清 白蛋白抗体存在。 此获得其它方法无法提供的信息，为一些尚无答案的生物医学理论问题提供解答。 其主要应用领域: (1) 蛋白质的结构功能研究; (2) 医学诊断和医疗 (3) 新药开发; (4) 生物工业等。