新建文件夹基因CAP-SOP8β-地贫检测SOP

广州金域医学检验中心 KM-SOP0303•08 Guangzhou Kingmed Center for Clinical Laboratory Edition 2.0 《文件已阅声明表》 《Procedure circulation form》 已阅声明：本人已了解此文件中的相关内容,今后的工作中将严格按照此文件执行,不随意对外传阅此文件,如有因与文件不相符的操作,由本人承担。 （I have understood the relevant content of the document。I will keep the document secret and be responsible to properly perform procedure） 阅读人签名表 姓名（NAME） 职务（POSITION） 签名（SIGNATURE） 签名日期（DATE） 胡朝晖 主任 曾征宇 主任助理 何雪葵 签字人 张建明 授权签字人 龙长友 技术员 彭丽霞 技术员 华 静 授权签字人 张晓璐 授权签字人 李嘉燕 技术员 郑建树 技术员 文艳琼 技术员 江真君 技术员 鲁碧稳 授权签字人 李 敏 技术员 秦建平 技术员 方 菊 技术员 罗 竹 技术员 姜成利 技术员 文件名称: β-地中海贫血检测操作程序（Gene analysis ofβ-Thalassemia） 表号:KM-MP03•02•02 《文件修改记录页》 《Procedure amendment form》 表号:KM-MP03•02•03 序号 NO. 页码(Page) 内容更改说明(Description of Modified contents) 审批人 (Approved by) 批准生效日期 (Approved date) 1 《文件信息表》 《Procedure information form》 表号:KM-MP03•02•04 文件名Title Of Doc.(Doc. Code) β-地中海贫血检测标准操作程序(KM-SOP0303•08) 版本号 (Edition No.) Edition 2.0 生效日期 (Operative date) 2007-08-28 文控部门 (Doc. Control Dept.) 实验室文控室 回顾人签名/日期(Reviewed by : Signature/ Review date) 回顾人(Reviewed by : Signature) 回顾日期(Review date) 替代文件(Replaces) 存放地点(持有人) (Location (Holder)) No. Location（Holder） 1 诊断部文控室 (陈 彬) 2 诊断部办公室 (胡朝晖) 3 分子病理室 (曾征宇) 作者签名/日期 (Author signature/Date) 张建明 审批人签名/日期 (Authorized by : Signature/Date) 胡朝晖 接收人签名/日期 (Receiptor/Date) 副本号 (Copy No./ Copy Num) 本文件是第 个文件拷贝 / 共发放 3 个文件拷贝。 β-地中海贫血检测标准操作程序 （Gene analysis ofβ-Thalassemia） 一、试验原理（Test Principle）： 本试验采用膜反向杂交技术，采用24条探针,检测17种基因突变。 二、样本采集与稳定性（Specimen Collection and Stability）： 1、 样本的采集（Specimen Collection） 用无菌注射器采3ml静脉血于含有枸橼酸钠或者EDTA抗凝剂的无菌管中，轻轻颠倒混匀,密封送检。 2、样本拒收的标准(Specimen unacceptable) 2.1不满足上述要求的标本拒收。 2、2冷冻拒收。 3、样本的稳定性（Specimen Stability） 3.1样本的稳定性：室温保存3天,冷藏保存1周。 3.2样本的保存条件:2-8℃。 三、安全防范（Safety Precautions）： 1、日常的安全防范(Daily safety precaution) 1.1工作人员在进行样本检测过程中必须穿戴口罩、帽子、手套和工作服。 1.2所有接触过样品的手套，枪头和其它物件须丢弃在标有生物危害的垃圾箱中。 1.3生物危害的垃圾必须每天适时的处理以保持清洁。 1.4工作台在每天工作结束后用10%的次氯酸钠溶液清洗，空间用紫外线照射30分钟。 1.5工作完毕，应脱去手套后洗手，再脱去工作服，然后用消毒液洗手。 2、样本的处理(Disposal of specimen) 2.1 检测完的样本，放4℃冰库保存2周。 2.2过期的样本交广州医用垃圾处理中心处理。 四、试剂（Reagents） 1、贮存与稳定性： 提取的DNA贮存在2-8℃，无菌纯水、PCR反应部分-20℃保存，有效期6个月。 2、试剂盒组成：（由深圳益生堂生物技术有限公司出产） 组成成分 数量 贮存温度 DNA提取液 TE （无菌） 1瓶（25ml） 室温保存 SolutionCL 1瓶（40ml） 室温保存 SolutionP 1瓶（60ml） 室温保存 1.2M NaCL(无菌) 1瓶（20ml） 室温保存 β-PCRMix 1管（920ul/管） 2-8℃ PCR扩增管 20管 -20℃ POD母液 1管(30ul/管) 2-8℃ TMB(2mg/ml) 1管(10ml/管) 2-8℃ 液体石蜡 1管(1ml/管) 2-8℃ 膜 条 20张 室温 30%H2O2 1管(100ul/管) 2-8℃ 以上试剂有效期6个月。 自备试剂 95%乙醇、70%乙醇、氯仿、 20×SSC 10％SDS(PH 7.0) 75％乙醇 无水乙醇等等 3、试剂的生物安全 因试剂中的TMB有毒,请注意带手套操作,如果不慎试剂进入口或眼内，用清水充分冲洗干净。 4、试剂实验前的准备： 将试剂从冰箱中取出并平衡至室温。 5、有效期：6个月 五、仪器（Instrument if Applicable）： PCR扩增仪 PTC200型 微量加样器 10uL 200 uL 1000 uL 离心机 恒温(42℃)振荡器 水浴锅 六、操作步骤(Steps of the flow) 1.标本处理（标本制备区）(Specimen processing): 1.1在200ul抗凝血中加入20ul蛋白酶K，加入200ul的缓冲液GB,充分颠倒混匀，56℃水浴10分钟，中途上下混匀几次； 1.2加入200ul的无水乙醇,充分颠倒混匀，将液体移500ul至吸附柱CB3中(吸 附柱放入收集管中)，13000rpm 离心1min； 1.3倒去收集管中液体,加500ul缓冲液GD至吸附柱内,13000 rpm 离心1min； 1.4倒去收集管中液体,加700ul漂洗液PW至吸附柱内,13000rpm 离心30sec； 1.5倒去收集管中液体,加500ul漂洗液PW至吸附柱内，13000rpm 离心3min； 1.6将吸附柱移入一个干净的离心管中,加入200ul的洗脱缓冲液TB，13000rpm 离心1min.将溶液收集到离心管中，即为所提取的DNA。 2.试剂配备(试剂贮存和准备区) (Reagent preparation) 设所需的反应管n(n=标本数),n+1管PCRMix-B,每管加反应液45ul,加一滴无菌矿物油。 3.加样（标本制备区）(Sampling)： 在反应管上做好标记，各加3ulDNA，终反应体积为48ul。 4.PCR扩增循环条件的设置（扩增区）(Amplification) 预变性 94℃ 5min 94℃ 60sec 55℃ 30sec 35 cycles 72℃ 60sec 72℃ 5min 5.杂交（标本制备区）(Hybridization)： 取15ml塑料离心管，标明实验号，加入同样标有患者编号的膜条，A液7-8ml及PCR产物，将盖拧上但不要太紧。将塑料管放入沸水加热10分钟（确保杂交液液面完全位于水浴液面之下），取出，放入42℃杂交箱杂交过夜。取一只50ml塑料管，加入40mlB液于42℃杂交箱中预热30分钟。 6.洗膜（分子杂交室）(Wash membrane)：取出膜条，移至装有B液的50ml管中于42℃轻摇30分钟（每管最多可同时洗涤4张膜）。 7.显色(分子杂交室)(Color development)：用A液配制1：4000的POD溶液（单做两张膜只需3ulPOD母液，配制成12ml使用液，做四张膜可用6ulPOD母液,配制成12ml使用液），室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液（显色液需新鲜配制）。将膜条浸泡于显色液中显色10-15分钟即可见斑点。将显色的膜条在纯水中快速漂洗1次,晾干后用透明胶袋封存。如需长时间保存，请将膜条扫描、复印或者照像。 8.结果判断（Judgment of results）：根据膜条上的杂交斑点判断突变位点。 41-42N 654N -28N 71-72N 17N βE N 31N 27/28M 41-42M 654M -28M 71-72M 17M βEM 31M IVS1-1M 43M -32M -29M -30M 14-15M CAP intM IVS1-5M 注：43M，41-42M可同时以41-42N为参照，-32M，-30M，-29M及-28M均可以-28N为正常对照，14-15M及17M可以17N作参照。 观察整张膜上出现的蓝色斑点，若在突变检测探针处出现显色强度与相应的野生型探针相近的蓝色斑点，则该位点为野生与突变的杂合子；若在突变检测探针处出现蓝色斑点，而相应的野生型探针处未出现蓝色斑点，则该位点为突变纯合子；若仅在野生型探针处出现蓝色斑点，则待检样品没有上述17种突变。 七、质量控制（Quality Control）： 1、质控品来源：自配,收集常见的突变的病人DNA，突变质控轮流检测。 2、接受标准 2.1取5ul产物加1ul溴酚蓝，混匀后经1.5％琼脂糖电泳15-20分钟后紫外灯下观察结果：扩增产物为600和200bp两个片段，若未见电泳带则实验失败。 2.2野生型探针杂交位点有蓝色斑点，则表明杂交正常。 3、失控处理：按《室内质量控制程序》进行处理。 八、室间质评（PT） 1、每年两次实验室间比对。 2、按《室间质评管理程序》的要求进行检测及处理。 3、如果有失控，进行纠正活动后，再用剩余的质控品进行验证。 九、结果解释（Interpretation of Results） β-地中海贫血为常染色体隐性遗传病，是β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白合成抑制而引起的溶血性贫血。突变能导致β+（β-珠蛋白能合成但合成量减少）和β0（β-珠蛋白完全不能合成）。广东省的β地中海贫血携带率为2.54%。 本实验使用PCR结合反向斑点杂交法，检测17个常见突变位点（β0包括Int,CD41-42，CD31，CD14-15，CD17，CD71-72，IVS-1-1，CD43，CD27/28;β+ 包括IVS-2-654,-28，-29，-30，CD32，CAP，IVS1-5,βE ）。本中心验证过的突变位点：CD41-42，CD43，IVS-2-654 ，-28，CD71-72，CD17，βE，CAP，Int，CD27/28 等常见位点，灵敏度为100%(对27例用本方法检测为基因突变标本,再用测序方法进行验证，结果一致)；特异性为100%(对74例血常规及血红蛋白电泳检测均为正常的体检标本,用本方法检测均未发现β-地贫基因突变)。 检测结果如有基因突变,建议咨询遗传或临床专家。 本实验的局限性为本方法主要检测17个中国人常见突变位点，但不排除其它少见突变的发生，余值风险为2.02%。 常用名称 国际命名法 常用名称 国际命名法 CD41-42 HBB:c.124_127delTTCT CD43 HBB:c.130G>T IVS-Ⅱ-654 HBB:c.316-197C>T －32 HBB:c.-82C>A －28 HBB:c.-78A>G －29 HBB:c.-79A>G CD71-72 HBB:c.216_217insA －30 HBB:c.-80T>C CD17 HBB:c.52A>T CD14-15 HBB:c.45_46insG βE或称CD26 HBB:c.79G>A CAP HBB:c.-11_-8delAAAC CD31 HBB:c.94delC Initiation codon HBB:c.2T>G IVS-I-1 HBB:c.92+1G>T IVS-I-5 HBB:c.92+5G>C CD27-28 HBB:c.84_85insC 十、该项目的技术参数：（由厂家提供）(Test Performance characteristics supplied by manufacturer) 1、检测灵敏度(Sensitivity)：无 2、灵敏度:0.5ngDNA 3、特异性(Specificity)： 100% 十一、经方法确认验证后的技术参数：（Test performance characteristics of assay validation） 1、本次共验证的基因位点包括：41-42，43，654 ，-28，71-72，17，βE，CAP，Int，27/28 等10个位点。 3、检测灵敏度(Sensitivity)：100%（36/36） 4、特异性(Specificity)：100%（74/74） 5、准确性（Veracity）：100%（110/110） 十二、临床意义（Clinical Significance）: 1． β-地贫的确诊。 2． 婚前检查。 3． 产前诊断。 4． 降低重度地贫的婴儿出生率,从而提高我国人口素质等等。 十三、参考文献（References）:益生堂生物技术有限公司β-地贫使用说明书。 STANDARD OPERATION PROCEDURE page 8/8 _1205326610.unknown