抗血清的制备

第一章 抗血清的制备 具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。 第一节 抗原的制备 一、概述 免疫原性 引起机体免疫反应的能力，包括特异免疫球蛋白的形成和特异淋巴细胞的产生两个方面。 抗原性 指抗原能够诱导免疫应答以及与特异免疫球蛋白和特异效应淋巴细胞结合和反应的能力。 二、免疫原的制备 （一）细胞性免疫原的制备 细胞性免疫原：人、动物、微生物或寄生虫细胞。 以红细胞抗原的制备为例： （1）无菌采取抗凝血。 （2）2000r/min离心10min，吸弃上层保存液及血浆。 （3）用约8倍的0.9%NaCl溶液洗涤3次。 （4）用无菌生理盐水悬起RBC，制成2%-5%的RBC悬液即可免疫动物。 阿氏液（Alsever’s): 葡萄糖 3.0g 柠檬酸三钠.2H2O 1.33g 柠檬酸. H2O 0.47g d H2O 100ml 过滤，分装，113 ℃高压灭菌20分钟，4 ℃保存。阿氏液可抗凝和保存红细胞。 （二）细菌细胞抗原的制备 以大肠杆菌为例： 1. 取大肠杆菌菌种接种于普通琼脂平板上，37 ℃培养10-20h。 2. 把菌体刮下，置于含无菌玻璃珠和生理盐水的三角瓶中，摇动混合菌体，60 ℃孵育1小时杀菌。 3. 5000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水洗涤一次。 4. 无菌检验后，配成8×108/ml的菌悬液，加入石碳酸，终浓度为0.5%，即为细菌悬液抗原。 （三）寄生虫细胞性抗原的制备 寄生虫一般较细菌或病毒大，结构与成分复杂，其成分和分泌物一般具有较强的抗原性。 多细胞寄生虫细胞性抗原的制备： 1. 虫卵的分离：2. 冻干虫卵的制备：3. 破碎虫卵抗原提取：将冻干虫卵充分研磨后， 用生理盐水配成V/V=1:100的虫卵悬液，-70~-80℃反复冻融5次或4℃超声粉碎，再4 ℃10000~12000r/min离心30min。上清液即为虫卵粗抗原。 （四）可溶性抗原的制备与纯化 1. 细胞抗原成分的提取 （1）酶处理法：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等。特点是作用条件温和，内含物成分不易受到破坏，细胞壁破坏程度可以控制等。 （2）冻融法：方法是-20 ℃冻完全冻结，然后37 ℃融化，反复2-3次。适用于组织细胞，对微生物细胞作用差。 （3）超声破碎法：使用频率1~20kHz，1-2min/次，总时间10-15min 。 （4）表面活性剂处理法： SDS，吐温，Triton-100等。特点是比较温和，常用于提取核酸。 2. 蛋白质抗原的制备 （1）离心分离法：适用于少数大分子抗原的分离，如IgM，C1q等。 （2）盐析法：盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。 在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。 各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同，控制盐的浓度，就能将血清中的免疫球蛋白分离出来。 用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。 用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获得较纯的IgG，但会损失一部分-球蛋白。 用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但-球蛋白也会同时沉淀。 如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用50%的饱和硫酸铵。 （3）凝胶过滤法 凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。 一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱较快。 常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和琼脂糖凝胶等。 （4）离子交换层析法 离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。 常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ 球蛋白）和QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变为零，不能吸附，被洗脱下柱。 由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它们分开。 在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为球蛋白和球蛋白，最后为白蛋白。 3. 核酸抗原的制备 一般认为大分子量的核酸具有免疫原性，但纯化的核酸往往很难诱导抗体的产生，但将变性的核酸偶联到载体如甲基化的BSA上，并同时注射佐剂，就很容易获得抗核酸的抗体。 （五）半抗原免疫原的制备 1. 常见的半抗原种类及性质 种类：多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物以及其他化学药品。 半抗原：在游离状态下无免疫原性的小分子物质。 载体：用于偶联半抗原的大分子物质。 2. 载体的种类和常见载体的性质 种类有：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物、一些颗粒。 蛋白类：人血清白蛋白、牛血清蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。 多肽类：多聚赖氨酸等。 羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。 3. 半抗原-载体连接方法 （1）原理： 直接连接：半抗原具有游离氨基或游离羧基。 间接连接：人为改造使其带有游离氨基或游离羧基。 物理吸附：载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。 化学方法：载体包括人血清白蛋白、牛血清蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。 （2）方法： 碳化二亚胺法：是一种化学性质非常活跃的缩合剂，能与半抗原上的氨基或羧基缩合。半抗原与载体按比例混合，假如碳化二亚胺，搅拌1-2h，透析除去未反应的半抗原。 戊二醛法、氯甲酸异丁酯、琥泊酸等。 （六）抗原抗体复合物的制备 抗原抗体复合物较单独的抗原更具有免疫原性，而且能得到更特异性的抗血清。 第二节 佐剂 一、佐剂的概念 二、佐剂的作用机制 三、佐剂的类型 四、佐剂的的制备方法 一、佐剂的概念 先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内,能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥辅助作用的一类物质。 储存佐剂(depot-forming adjuvant) 作用是保护抗原,延长其在体内的滞留时间,使抗原缓慢释放,同时促进局部吞噬细胞反应,如果将其与抗原分开，即失去作用。例如铝胶佐剂、油包水乳化住剂都属此类。 中枢作用佐剂(centrally acting adjuvant) 中枢作用佐剂的作用是直接刺激免疫活性细胞,若与抗原分开注射,仍具有免疫刺激作用。例如细菌内毒素、脂质D等都属于此类抗原。 二、佐剂的作用机制 (一)对抗原的作用 1. 增加抗原的表面积佐剂吸附抗原,增加抗原与免疫细胞的接触表面积, 尤其是小分子可溶性抗原或半抗原,经胶体颗粒吸附后免疫动物,可提高抗体产量。 2. 提高抗原的免疫原性佐剂抗原被吞噬细胞吞噬后,经加工处理,其免疫原性得到加强。 3. 延长抗原在局部组织内的滞留时间,以较少的免疫次数即可提高体液中的抗体含量。 4. 保护抗原(尤其是DNA、RNA)免受体内酶的分解。 (二)对机体的作用 1. 引起局都肉芽肿,促进局部炎症反应,增强吞噬细胞的活性。 2. 促进巨噬细胞和淋巴细胞的增殖与分化,增加T、B淋巴细胞的协同作用。 3. 增强淋巴细胞膜的活性并促进分泌辅助因子。 4. 引起佐剂病,有些动物(如大白鼠)因注射弗氏完全佐剂引起关节和关节周围发生炎症病变,该病又称为佐剂关节炎。 三、佐剂的类型 (一)不溶性铝盐类胶体佐剂 如氢氧化铝胶、明矾(接明矾、钾明矾)、磷酸三钙等。 (二)油水乳剂 这类佐剂是用矿物油、乳化剂(如Span-80，Tween-80)及稳定剂(硬脂酸铝)按一定比例混合做为油相,然后与抗原液混合制成各种类型的油水乳剂。 弗氏佐剂（Freund‘s adjuvant）是用矿物油（石腊油）、乳化剂（羊毛脂）和杀死的分枝杆菌(结核分枝杆菌或卡介苗)组成的油包水乳化佐剂，这三种成分俱全的佐剂称为弗氏完全佐剂(FCA)，不含分枝杆菌的佐剂为弗氏不完全佐剂FIA。 (三) 微生物成分及其产物的佐剂 某些死的菌体及其成分代谢产物 等均可起到佐剂作用例如：MDP(BCG细胞壁中的N-乙酰胞壁酸二肽)、肺炎克雷伯氏杆菌的荚膜多糖(CPS-K)、 (LPS)、细菌内毒素、短小棒状杆菌和酵母菌的细胞壁成分、百日咳疫苗等。 (四) 核酸及其类似物佐剂 从微生物中提取的核酸成分与抗原一起接种动物，可起到佐剂作用。 (五) 细胞因子(cytokine)佐剂 多种细胞因子都具有佐剂作用，可提高病毒、细菌和寄生虫疫苗的免疫效果。例如IL-1、 IL-2以及其它细胞因子等。 免疫增强剂(immune potentiator)：是指单独使用即能引起机体出现短暂的免疫增强作用，这与佐剂是不同的。然而有些物质具有双重作用。免疫增强剂的种类繁多，按性质不同可分为生物性免疫增强剂、细菌性免疫增强剂、化学性免疫增强剂、中药免疫增强剂等。 四、佐剂的的制备方法 1. 弗氏不完全佐剂 （FIA） 矿物油（石腊油）/乳化剂（羊毛脂）=1/1、2/1、3/1、5/1 弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。 第三节 免疫血清的制备 一、免疫动物的选择 免疫动物主要包括兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时也用山羊、马等。 1. 抗原和动物种属关系 2. 动物个体的选择 适龄、健壮、无感染的正常动动物，体重合乎要求，如家兔6个月以上，2~3kg。 3. 抗原性质与动物种类 蛋白抗原对大部分动物都合适，常用家兔和山羊。但如IgE对绵羊，胰岛素对家兔，多种酶类对山羊，均不易产生抗体。 4. 大量制备动物血清 应选用马、驴、骡、绵羊等大动物。 二、免疫剂量 家兔：首免抗原剂量100~200g 半抗原合成抗原2mg(半抗原量约20~200 g） 加强剂量：首量相同或2倍或一半，加强免疫通常用弗氏不完全佐剂。 参考免疫剂量 1.家兔：首次 50~200 g蛋白加 FCA，背部皮下注射6~8点，0.1~0.2ml/点；每隔10天用50~200 g蛋白或加 FIA，肌肉、皮下、静脉或腹腔注射加强免疫一次，0.25~2ml/点或次。 2.豚鼠或大鼠：首次 10~100 g蛋白加 FCA，背部皮下注射4~6点，0.1ml/点；每隔7~8天后10~50 g蛋白或加 FIA，肌肉、皮下、静脉或腹腔注射加强免疫一次，0.25~2ml/点或次。 3.绵羊或山羊：首次 0.5~10 mg蛋白加 FCA，背部皮下注射4~6点，0.2~2ml/点；14~28天后用0.5~10 mg蛋白或加 FIA，肌肉、皮下、静脉或腹腔注射，加强免疫一次，0.25~2ml/点或次。 4.鸡：首次 50~200 g蛋白加 FCA，胸肌注射2~4点，0.2~0.5ml/点；隔10天后 50~200 g蛋白或加 FIA，肌肉加强免疫一次。 三、免疫途径 静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等。 皮肤多点注射（40点左右） ；半抗原静脉和腹腔：颗粒性抗原或加强免疫 淋巴结：抗原宝贵（10~100 g） 四、免疫 通常基础免疫后4周进行加强免疫，加强免疫至少2次，必要时3~5次，周。 以家兔为例参考方案； 1．全量免疫法：首次脚掌皮下注射1~10 mg蛋白加 FCA，1~2周后用1~10 mg 蛋白加 FIA皮下注射，以后每隔一周皮下多点注射1~10 mg，共4~5周，5周后试血。 2．微量免疫法：于两脚掌皮下注射活卡介苗，每只约10mg。7~10天后于窝淋巴结注入蛋白加 FCA100~200 g，1月后再注入抗原400~600 g，8~10天后试血。 3. 淋巴结免疫法：在双后足掌皮下注射活卡介苗0.3ml，1-2周后在淋巴结内注入抗原佐剂混合液0.5ml。两周后再重复一次。末次免疫后7-10天试血。 4. 混合法： 此法综合皮下、淋巴结和静脉途径进行免疫，其特点是抗原用量省，血清效价上升快。首免在双后足掌皮下注射0.5ml，两周后在淋巴结注射0.5ml。第3周末试血，如果效价不够高，可用无佐剂抗原静脉注射加强免疫。一周内注射3次，分别为0.1，0.3，0.5ml，一周后试血。 五、动物采血法 (一)　心脏采用血法 1.　家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢定)； 2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮肤； 3.　用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位； 4.　用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死； 5.　将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分血清。 （2）​ 　颈动脉放血法 1．家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤； 2.沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌； 3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离； 4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住； 5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱； 6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。 六、分离血清与保存 　　将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，在无菌条件下分离出血清，并因尽量防止溶血。 1. 冰冻干燥保存：将血清分装，急速低温冰冻，然后在低温真空干燥机内干燥，封口。冻干后的免疫血清干粉，可在4C保存2-3年。 2. 冰冻保存：免疫血清分装小瓶后，用干冰急速冷冻，在-20C可长期保存，切记反复冻溶，因为 反复冻溶会使血清的效价降低甚至消失。 3. 加防腐剂保存：加入最终浓度0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，可保存1-2年，但荧光抗体的免疫血清不能用叠氮钠，因为它对荧光素有淬灭作用。 七、注意事项 1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。 2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。 3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。 4.抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。 在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。 5.　免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射也可产生高效价的免疫血清.