用非手性衍生化法提高肾上腺素类药物在手性固定相上的分离度

第28卷 第2期 2009年2月 测试学报 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) Vo1．28 No．2 239～242 用非手性衍生化法提高肾上腺素类 药物在手性固定相上的分离度 曹雪玲 ，刘发现 ，金东日 (1．吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2．中国石油吉林石化研究院， 吉林 吉林 132021；3．延边大学 理学院 化学系，吉林 延吉 l33002) 摘 要：建立了高效液相色谱法分离肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的苄氧羰基衍生物对映体的方 法。以氯甲酸苄酯为衍生化试剂，在室温 、碱性条件下，对 3种肾上腺素类药物进行衍生化反应。采用手性 CHIRALPAK@AD—RH色谱柱 ，在检测波长为226 nm条件下 ，考察了流动相、流速 、柱温对对映体手性分离 的影响。结果表明，肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素衍生物对映体分别在乙醇为流动相 、流速为 0．5 mL／min、柱温为 25℃；甲醇 一乙醇(体积比 3：1)为流动相、流速为 1．0 mlVmin、柱温为 25℃；甲 醇 一水 一四氢呋喃(体积比 150：20：7)为流动相、流速为0．5 mL／min、柱温为25 时，分离效果最佳。 关键词：手性固定相；肾上腺素类药物手性化合物；氯甲酸苄酯；衍生化 中图分类号：0657．72；R458．3 文献标识码：A 文章编号 ：1004—4957(2009)02—0239—04 Enhanced Chromatographic Resolution of Adrenalines Enantiomers as Carbobenzyloxy Derivatives on Chiral Stationary Phase CAO Xue—ling ，LIU Fa—xian ，JIN Dong—ri (1．College 0f Chemical＆Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 1 32022， China；2． Resem'ch Institute of Jilin Petrochemical Company，PetroChina Corporation Ltd．，Jilin 132021， China；3．Department of Chemistry，Science College，Yanbian University，Yanji 133002，China) Abstract： A HPLC method was developed for the chiral separation of benzyl0xycarh0nyl derivatives of epinephrine，norepinephrine and isoprenalinum． The adrenalines enantiomers were firstly derivatized by carbobenzyloxy(CBZ)at room temperature in alkaline condition and then separated on a CHIRAL— PAK@ AD—Rtt column ． The effects of mobile phase composition．temperature and flow rate on the separation of adrenalines enantiomers were investigated at detection wavelength of 226 nm． The re— sults indieatecl that a good separation was obtained at 25 oC by using ethanol as the mobile phase with a flow rate of0．5 mL／min for epinephrine，a mixture of methanol—ethanol(3：1，by volume)as the mobile phase with a flow rate of 1．0 mIYmin for norepinephrine，and a mixture of water—metha- nol—tetrahydrofuran(20：150：7，by volume)as the mobile phase with a flow rate of0．5 mL／min for isoprenalinum，respectively． Key words：chiral stationary phase；adrenalines enantiomers；carbobenzyloxy；derivatization 随着生物化学、药物化学等学科的发展，手性药物的开发和研究越来越受到人们的高度重视，通 过适当的拆分并制备光学纯的手性化合物是开发高效手性药物的基础 ¨ 。由于 目前许多光学纯 手性药物仍不能通过不对称合成、化学拆分、结晶拆分等技术制备 j，采用高效液相色谱技术 (HPLC)拆分外消旋手性化合物是获得光学纯对映体的重要手段 J。手性固定相法(CSP)HPLC是至少 能拆分毫克数量级光学纯对映体的一种有效方法。CSP—HPLC手『生识别基于 CSP与两对映体形成瞬时 非对映异构配合物能力的不同，使对映体 HPLC分离。在 HPLC手性拆分过程中，分离度是一个重要 的影响因素。分离度的大小直接影响各对映体的光学纯度和制备效率等。手性制备色谱的分离度通常 大于 2．0。一股I青况下，一种类型 CSP通常只对某些对映体药物表现出良好的对映体选择性。另 收稿日期：2008—08—07；修回日期：2008—09—15 第一作者：曹雪玲(1982一)，女，吉林松原人，助教，硕士 通讯作者：金东 日，Tel：0433—2732913，E—mail：drjin@ybu．edu．cn 分析测试学报 第28卷 外，手性柱都很昂贵。这些因素限制 CSP—HPLC在各种对映体化合物拆分中的日常应用。如何充分利 用现有的手性柱经济、有效地制备研究所需的各种光学纯对映体(毫克数量级)是实际工作中面临的重 要问。解决这些问题的一个可行方法是改变待分离对映体结构，使它们适合于CSP拆分。非手性衍 生化法或待分离物结构中官能团的保护是改变待分离对映体结构的有效方法。有关 HPLC拆分外消旋 肾上腺素类药物的方法已有报道。例如 Imai等 以环糊精为 CSP拆分肾上腺素和去甲肾上腺素，而该 2种对映体均未得到基线分离；Caccamese等 以纤维素多糖为 CSP拆分了异丙肾上腺素，但分离度很 差(R =0．4)。Kraml等 虽然用氯甲酸苄酯(carbobenzyloxy，CBZ)作为衍生化试剂，以纤维素多糖为 CSP拆分了异丙肾上腺素 一苄氧羰衍生物，但没有达到分离。因此，上述方法很难用于制备肾上腺素 类光学纯对映体。本文采用氯甲酸苄酯作为衍生化试剂，研究氯甲酸苄酯与肾上腺素的衍生化反应， 制备肾上腺素、去甲肾上腺素及异丙。肾上腺素(结构式见图 1)的苄氧羰衍生物，然后在纤维素多糖 CSP柱上对各对映体进行拆分，选择最佳色谱条件，得到较满意的分离度(R >2．0)。进一步扩大了 CSP[硅胶键合三(3，5一二甲基苯胺甲酸酯)淀粉]的使用范围 J。 H H 0H H( H( 图 1 3种肾上腺素类药物的分子结构式 Fig．1 Chemical structures of three adrenalines 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 Hitachi液相色谱仪，包括 Integrator D一7500，Pump L一7150，Detector L-7420 UV一~IS，20 定量 管。HP1 100 LC／MS 1949A，美国安捷伦公司。 色谱柱 CHIRALPAK@AD．RH(150 nlm×4．6 rain i．d．，5 txm)、保护柱 CHIRALPAK~AD—RH(0．4 cmO X 1 ClI1)，Daicel化学工业公司，日本。肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素均为东京化成工 业公司产品，氯甲酸苄酯购于丰特斯化工公司；甲醇(购自山东禹王实业有限公司禹城化工厂，色谱 纯)，乙醇、乙腈和四氢呋喃购白天津科密欧试剂科技公司(色谱纯)；水为二次蒸馏水。 1．2 标准溶液的配制 精密称取。肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、异丙肾上腺素(IS)各 0．1 g置于 10 mL容量瓶中， 加入 5 mL水和 5～6滴乙酸，充分溶解。用甲醇定容至 10 mL，作为储备液。 1．3 衍生化反应 旧J 用微量取液器取氯甲酸苄酯(CBZ)标准溶液 1 000 L于聚丙烯管中，在室温下分别加入肾上腺素、 去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准品溶液 1 mL，加入 KOH的甲醇溶液，用涡旋搅拌器搅拌 1 min。然 后每次进样 2O L。 1．4 HPLC—ESI MS条件 色谱条件：CHIRALPAK@AD．RH色谱柱(150 mm x4。6 mm，5 m)；保护柱CHIRALPAK@AD．RH 0．4 cm0 X 1 cm；流动相：纯乙醇；检测波长：226 nm；柱温：25℃；流速：0．5 mL／min；进样量： 2O L。 质谱条件：美国安捷伦 HPLC1100／MSD液相色谱 一质谱联用仪，进样模式：FIA，离子化方式： API—ESI(+)，扫描电压：70 V，质量范围：500～700 U、干燥气：8．5 L／rain(N：)、干燥气温度：350 cIC、雾化器压力：2．41×10 Pa。 丫 H H 第2期 曹雪玲等：用非手性衍生化法提高肾上腺素类药物在手性固定相上的分离度 241 2 结果与讨论 2．1 衍生化反应 以肾上腺素为例，研究肾上腺素类化合物与 CBZ的衍生化反应。肾上腺素与 CBZ的反应如图2所 示。CBZ分子中的酰氯基团可与肾上腺素分子中的氨基和儿茶酚基团的 2个羟基反应形成含有酰胺和 酯的衍生物。经 HPLC—ESI MS分析(图 3)，得到该衍生物分子离子峰 [M+H] 586．5、[M+Na] 608．4。该衍生化反应条件温和、反应快，在衍生化过程中各对映体未发生消旋反应。 H() H() 350 300 250 星 200 l50 1O0 50 0 100 80 60 ＼ 40 20 O H ／ ＼ ＼ H舢 一 ， OH 图2 肾上腺素与氯甲酸苄酯的反应式 Fig．2 Reaction of epinephrine with carbobenzyloxy(CBZ) 0 5 】0 15 2O 25 30 t／in1n 100 80 蓉 6(】 、 40 20 0 ] 以 ． 2()0 300 400 500 600 700 200 m／Z 图3 肾上腺素衍生物的色谱图(A)、总离子流图(B)及质谱图(C) Fig．3 Chromatograms of HPLC(A)，total ion(B)and MS(C)of epinephrine derivatives 2。2 色谱分离 2．2．1 流动相的选择 采用 CHIRALPAK@AD—RH手性色谱柱，在纯甲醇、纯乙醇、甲醇 一水、乙 醇一水、乙腈 一水、甲醇一乙腈一水、甲醇一乙醇、甲醇 一乙醇 一水、乙腈 一乙酸、甲醇一水一四氢 呋喃等流动相体系及其不同比例条件下，考察了肾上腺素、去甲。肾上腺素、异丙肾上腺素对映体及其 CBZ衍生物的分离。结果发现，该3种肾上腺素类对映体均未能分离，而其衍生物分别在乙醇、甲 醇 一乙醇(体积比3：1)、甲醇 一水 一四氢呋喃(体积比 150：20：7)流动相中得到分离。 2．2．2 流速的选择 考察了流动相流速对3种肾上腺素类对映体衍生物分离度的影响。实验发现，随 着流速的提高，肾上腺素对映体衍生物分离度逐渐增大，当流速为0．5 mL／min时，分离度达到最大， 继续增加流速则分离度降低。样品保留时间随着流速的增大逐渐变小。所以，分离。肾上腺素对映体衍 生物时流速选为0．5 mL／min。而去甲肾上腺素衍生物随着流速的增加分离度和保留时间都逐渐减小， 一 >== 242 分析测试学报 第 28卷 综合考虑分离度与保留时间，分离去甲肾上腺素衍生物的流速选为 1．0 mL／min。当流速为0．2 mL／min 时，异丙肾上腺素衍生物分离度可达 2．0，但保留时间较长，为了缩短分析时间，分离异丙肾上腺素 衍生物的流速为0．5 mL／min。 2．2．3 柱温的选择 考察了柱温对 3种肾上腺 素类对映体衍生物分离度的影响。结果表明，肾 上腺素对映体衍生物的分离度随着柱温的升高而 逐渐减小。去甲肾上腺素对映体衍生物的分离度 开始随着柱温的升高而提高，但当柱温超过 25 ℃时，分离度随柱温的升高而逐渐减小。与肾上 腺素、去甲肾上腺素对映体衍生物相比，柱温对 异丙肾上腺素对映体衍生物的分离度影响不显 著。因此 ，实验柱温均选为 25℃。 在上述优化条件下，对肾上腺素、去甲肾上 腺素、异丙肾上腺素对映体的 CBZ衍生物进行分 离，结果如图4所示。 3 结 论 从 8 9 IO l1 l0 l4 18 ／rnI13 ，／Hlln 图4 3种肾上腺素衍生物的色谱图 Fig．4 Chromatograms of three adrenalines derivatives a． epinephrine derivative；b． norepinephrine derivative； c． isoprenalinum derivative 本文首次将氯甲酸苄酯用于含有氨基和酚羟基的肾上腺素类对映体化合物的衍生化反应，使所生 成的两对映体衍生物与 CSP[硅胶键合三(3，5 二甲基苯胺甲酸酯)淀粉]有不同的相互作用能力，从 而提高了手性柱的手性拆分能力，为 HPLC手性药物制备提供了新的分离方法。 参考文献： [8] [9] [10] 徐旭，兰先秋，杨丹，等．扁桃酸对映体光学纯度的柱前衍生化 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