基因芯片技术在致病微生物研究中的应用

基因芯片技术在致病微生物研究中的应用 林捷� � 谢曼凌 � 潘珍瑜� ( �福州市卫生防疫站, 福建 福州 � 350004 � 福建医科大学,福建 福州 � 350001) � � 高密度寡核苷酸 DNA 芯片技术可以通过一次杂 交试验获得大量的基因组信息, 在基因组结构与基因 表达分析中应用最广, 在与人类健康有关的遗传病、 传染病等诸多疾病中具有广泛的应用前景。本文重 点对基因芯片技术在细菌、病毒等致病微生物病原鉴 定、分类与致病机制研究中的应用作一简要介绍。 一、研究感染病毒基因组, 了解病毒抗药及致病 机制 人们多利用基因表达产物来研究病毒复制与致 病机制,或研究其理化性质及相互作用, 或构建突变 病毒并分析表型。DNA 芯片技术为病毒致病机制与 抗药性机制的研究提供了一种新。 1、分析病毒基因多态性,了解病毒抗药基因与抗 药机制 目前,关于人类免疫缺陷病毒 I 型( H IV- 1)抗蛋 白酶抑制剂作用的突变机制了解不多。Kozal 等 ( 1996)第一次在临床中应用高度寡核苷酸芯片测序 技术对 102例病人中 167 株分离病毒进行研究, 结果 发现美国H IV- 1 包膜 B 蛋白酶极其多变 , 99 个氨基 酸中 47. 5%存在变异,多变性高于已知的所有 HIV- 1 包膜氨基酸( 40% )。从未用蛋白酶抑制剂治疗的病 人中分离到 HIV- 1 毒株, 并观察到包膜氨基酸的自 然多变性,其中许多氨基酸改变与抗蛋白酶抑制剂的 抗药性有关。H IV- 1 蛋白主要变异在于包膜蛋白, 这种自然突变对临床治疗与预后具有重要意义。 2、分析药物作用下病毒基因表达情况, 了解药物 作用机制与基因功能 Chambers 等( 1990)首次利用病毒 DNA 芯片技术 同时对人巨细胞病毒( HCMV)几乎所有的开放阅读框 架( ORF)进行表达检测。利用 9- ( 1, 3- 二羟- 2- 丙氧甲基)鸟嘌呤( GCV )与环己酰亚胺分别封阻病毒 DNA的复制与病毒蛋白合成, 依据 ORF 动力学改变 进行分类, 勾画了即刻早期基因、早期基因、早晚期基 因、晚期基因在整个 HCMV 基因组中的表达图画, 表 明在早期基因、早晚期基因、晚期基因之间有可能存 在调节因子。通过病毒基因表达对药物敏感性的动 力学观察了解药物的作用机制与病毒致病机制。利 用病毒 DNA 芯片可以在整体基因组水平迅速、平行 分析基因表达,加速已知和新发现的病毒大型基因组 的功能分析。 二、检测感染宿主细胞基因表达改变, 研究病毒 致病机制 细胞基因对于 HCMV 复制和致病性的作用现在 还不明了, 但利用基因芯片技术可以鉴定细胞内基 因,并且这些基因与传染病的发病机制有一定的关 系,为病原菌致病机制的研究提供了一条新途径。 HCMV- 宿主细胞复合体相互作用具有强烈的调 节细胞基因表达的潜能, 但感染宿主细胞基因表达的 改变却很少得到证实。利用差异显示技术只能鉴定 mRNA 水平改变较大的基因, 且耗时、费力。而 DNA 芯片试验简便易行, 可以检测细微 mRNA 改变。Zhu 等利用 DNA 芯片对HCMV感染宿主引起的细胞基因 表达改变进行了全面分析。对约 6600 个人 mRNA 的 表达进行检测,结果感染前后 258种 mRNA 水平改变 4倍以上,其中一些 mRNA 编码的基因产物在病毒致 病性中起关键作用, 值得进一步深入研究。RNA水平 改变有可能反映宿主细胞的遗传变异, 258 种 mRNA 中 124 种 mRNA 增加, 134 种 mRNA 减少。经 Nor then 印迹分析及以前的研究可以证实和预测增加 的 mRNA 有 49种( 40% )减少的占 23 种 ( 17% ) ,其原 因可能在于转录调节的改变。因而, 利用 DNA 芯片 技术依据宿主细胞对病原体的 mRNA 水平改变的全 面分析结果, 对调节基因进行分类提供了工具, 值得 进一步进行研究。 三、研究细菌基因分型与菌种鉴定, 检测细菌抗 药性基因 42 学会月刊 2001 年第 10 期 � � � � � � � � � � � � � � 科技交流 Gingeras 等( 1999) 分析 10 种分枝杆菌种间与种 内的序列多样性, 确证了几种种特异性单碱基多态 性。结核杆菌 rPOB 抗药性基因 180bp 区内存在 3 个 有意义的特异核苷酸,其他 9 种非结核杆菌每种都有 其特有的核苷酸定位, 联系在一起形成了一套特有的 分枝杆菌指纹图。每种分枝杆菌多种样品制备方法 用不同批次制备的高密度寡核苷酸芯片杂交分析, 杂 交图象十分稳定, 保守性强, 特异性强, 重复性好, 不 同菌株在进化树中分类地位也相当稳定。这典型的 图谱可以用于在基因组水平对结核杆菌进行流行病 与临床调查 , 对临床分离分枝杆菌进行诊断, 对非结 核杆菌进行分类鉴定。 试验同时对 44 株临床上对利福平有抗药性的结 核杆菌进行 rpoB 基因突变检测, 共涉及到 41 株 8 个 密码子 12 种突变, 突变中 40 株为错义突变, 1 株为 6 碱基缺失突变, 3 株在 r poB 基因 705bp 内未检测到任 何突变(约 10%结核杆菌抗药性机制不明 )。测定结 核杆菌利福平抗药性基因, 可以区别鉴定非结核杆 菌,为微生物的群体结构提供了资料。利用基因芯片 探针杂交方法还可以对 2 个以上不同的抗药性基因 同时进行分析 ,如对结核杆菌异烟肼、对氨基苯甲酸、 乙胺丁醇等多种药物的抗药性基因 KasA、PncA、emb 等都可以同时进行检测, 包括结核杆菌多个抗药性基 因的基因芯片现在已经得到应用。检测重要基因组 对了解尚未完成全序测定的有关基因在临床及生物 学中的作用提供了一种很好的工具。 T roesch、Gingeras 等 ( 1999 ) 又将 165mRNA 和 r poB 两种基因高密度 DNA 探针芯片用于分枝杆菌种 属的鉴定和利福平抗药性的测定, 结果 27 种 70 株不 同分枝杆菌中 26/ 27及 15 株利福平抗药性 rpoB 基因 得到了正确鉴定。利用基因芯片技术平行检测大量 基因为细菌疾病的诊断与治疗带来了新的前景。 四、利用与总 RNA杂交, 测定细菌多基因的转录 与表达 细菌许多基因受环境的激发而表达, 同时分析多 基因表达长时间以来受技术的影响难以完成。现在, 利用体外转录的 mRNA 与高密度探针芯片杂交, 通过 单一杂交试验可以对上百种细菌基因的表达进行检 测。Antoine等( 1998)用总 RNA标记探针与寡核苷酸 芯片杂交实现了对细菌表达基因的定量检测, 发现 rRNA 杂交背景不会随总 RNA 的量增加而增加,重复 性好、敏感性强。Antione基因芯片分析每一种基因用 150对探针,实际上每种基因用 20 对探针就可以满足 对高、低丰度 mRNA 的检测。增加与芯片杂交的标记 RNA 量可以提高基因芯片检测的敏感性。另外 RNA 的不稳定不会影响准确定量, 因为在杂交前 RNA 已 经被水解为 100bp大小的片段, 降解标记片段仍可与 芯片上对应探针杂交, 相应定量。一次试验总 RNA 的量还需进一步减低, 正在推出一种不需要体外培 养、直接用环境细菌分离 RNA 进行化学标记的方法。 利用基因表达同时进行定量分析, 为了解细菌基因调 节网络、研究细菌对环境信号或药物的反应、研究细 胞侵袭力的发生提供了一种直接、高效的检测方法。 五、小结 基因芯片技术近几年在微生物诊断与抗药性筛 选工作中的应用情况表明, 分析感染病毒基因的多态 性与病毒- 宿主细胞系统病毒基因与细胞基因的表 达改变,有助于人们了解病毒的感染发病机制与抗药 性机制;利用细菌基因组与抗药性基因、致病岛基因 等重要基因的基因芯片, 通过单一的杂交试验就可以 完成感染细菌或分离菌株的基因分型与菌种鉴定, 快 速诊断、鉴定致病细菌与非致病细菌, 指导临床治疗; 对细菌基因组多个基因表达同时进行定量分析,为研 究细菌对环境信号或药物的反应, 研究细菌侵袭力的 发生提供了一种直接、高效的检测方法。 目前,基因芯片技术在医学、分子生物学领域应 用已经越来越广泛深入, 受到科学界的普便重视, 但 研究成本相对较高, 待测定的靶探针标记方法也比较 繁琐,国内研究还处于起步阶段。但这项研究是一种 实力的较量,要想在基因功能分析领域取得更有价值 的成效,必须集中人力、物力来研制适合我们国情的 基因芯片技术。相信不暇时日, 经过生物工作者等的 努力,在一些领域我们会有突破性进展, 跻身世界前 列。 43科技交流 � � � � � � � � � � � � 学会月刊 2001 年第 10 期