肿瘤化疗与遗传多态性-终稿(刘泽源主任）

null肿瘤化疗与遗传多态性 chemotherapy ＆ polymorphisms肿瘤化疗与遗传多态性 chemotherapy ＆ polymorphisms307医院 刘泽源内 容内 容药物基因组学 概况、研究策略、国际研究现状、发展趋势等 肿瘤药物基因组学 研究现状及应用 我室开展的工作及发展 药物代谢酶的药物基因组学研究 药物转运体的药物基因组学研究 抗肿瘤药物的药物基因组学研究null一、药物基因组学药物反应的个体差异药物反应的个体差异有反应无反应毒性反应药物反应的个体差异给予一个群体同一种药物不良反应影响药物反应个体差异的因素影响药物反应个体差异的因素药物反应的个体差异年龄 老年 成年 儿童 婴儿体重 性别身高遗传因素环境因素 饮食 / 吸烟 / 合并用药 并发疾病疾病进程 null 1997年6月，世界上第一个独特的基因与制药公司由金赛特（巴黎）实验室宣布成立，Abbott-Geneset两大制药公司共同发起了药物基因组计划 Abbott-Geneset Alliance的诞生，标志着药物基因组学时代的到来。药物基因组学 (Pharmacogenomics）药物基因组学 (Pharmacogenomics）是基于功能基因组学和分子药理学研究遗传因素与药物反应相互关系的一门新兴学科。遗传多态性是药物基因组学的基础遗传多态性是药物基因组学的基础自然界中，某一群体同种生物常在某些方面有所不同，存在两种或两种以上变异型的现象称为遗传多态性。 遗传多态性是药物基因组学的基础。 人类基因0.1%的变化产生出300万种同质异构体，主要现在单核苷酸的多态性（SNPs）。多态性的存在导致了许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异。候选基因研究是药物基因组学研究的主要策略之一候选基因研究是药物基因组学研究的主要策略之一 从已知的药物代谢通路或疾病的发病机理上寻找可能与药物反应相关的基因，通过评估这些基因上的单核苷酸多态性（SNPs）在特定药物暴露人群中的基因型频率来研究它们和药物反应之间的相关性。如果检验结果阳性，则提示该敏感性基因可被假定为直接影响药物反应的基因。药物基因组学的技术平台 药物基因组学的技术平台 1基因组学平台 测序、基因芯片等 2蛋白质组学平台 双向蛋白电泳技术、蛋白质分析技术 、蛋白芯片技术等 3生物信息学平台 数据处理 信息学药物基因组学对药物研发和应用的潜在益处 药物基因组学对药物研发和应用的潜在益处 1 新药物靶点的鉴定 2 指导新药物研发全过程 临床前、上市前、上市后期 3 个体化用药 增加首剂处方的有效性 避免毒副反应 节约医疗费用 4 挽救过去在临床试验中未通过的药物临床试验与药物基因组学研究临床试验与药物基因组学研究临床试验控制了诸多影响药物疗效的因素，如治疗方式、药物剂量、治疗时间和患者对药物的依从性，从而消除了许多可能的混杂因素的影响。 在临床研究中，通过适当的试验，能够观察到基因、药物及基因—药物交互作用对疾病病程的影响。临床试验与药物基因组学研究临床试验与药物基因组学研究Ⅰ期临床试验 受试对象数目偏少 限制了药物基因组学在药物代谢过程的遗传变异研究的应用 Ⅱ期临床试验 对后期试验的设计和患者的选择有一定的参考价值 Ⅲ期临床试验 用来鉴定参与药物疗效或不良反应的关键基因 Ⅳ期临床试验 有助于识别与药物不良反应有关的重要的基因变异FDA药物基因组学资料呈递指导准则 (Guidance for Industry pharmacogenomic Data Submissions）FDA药物基因组学资料呈递指导准则 (Guidance for Industry pharmacogenomic Data Submissions）美国FDA在2005年3月公布了药物基因组学资料呈递指导准则。这份具有建议性的辅导手册中，解释了FDA将如何评价各项药物基因组资料以及哪些资料可用于行政决定中，鼓励研究者在药物研发过程中进行药物基因组测试。 FDA尝试将这一新的领域与药物研发整合，希望进一步提高新药的安全性和有效性，以保障逐渐形成的法规政策和药物研发过程是以最先进的科学知识为依据。因此药物基因组学的研究资料对其药物研发过程具有重要的作用。在下列情况下药厂必需提供药物基因组学资料在下列情况下药厂必需提供药物基因组学资料如果这些资料对说明该药物标签上的剂量、安全性或有效性具有重要参考价值 在含有某一遗传学标志物的亚组人群中进行的药物临床试验 有效的生物标志物,即患者的遗传学变异已被证实与其对某些药物的反应相关 这些必需提交的药物基因组学资料会影响FDA对这些药物的决策在下列情况下药厂自愿提供药物基因组学资料在下列情况下药厂自愿提供药物基因组学资料对于大多数其他的药物基因组学资料,例如这些资料并非作为临床试验或销售申请的一部分,则无强制要求,但FDA鼓励其自愿提交。 自愿提交的资料不影响FDA的决策null二、肿瘤药物基因组学研究抗肿瘤药物具有自身的特点抗肿瘤药物具有自身的特点抗肿瘤效应具有明显的量效关系，抗肿瘤作用增强的同时通常毒性也增加 治疗窗通常较窄，患者的治疗剂量往往是药物的最大耐受剂量 常多药联合应用，具有潜在的相互作用 基于多参数的剂量分层也不能解决这种多样性FDA批准的药物标签上的药物基因组学生物标记FDA批准的药物标签上的药物基因组学生物标记遗传因素决定毒性/药效的可能性遗传因素决定毒性/药效的可能性接受单药化疗的肝肾功能正常的癌症患者 患者之间对敏感药物药代动力学参数的高度可变性 AUC的双峰分布，非活性药物与敏感药物之间的代谢比值具有可变性 第一疗程结束后出现的严重毒性，甚至降低剂量在以后的疗程中再次出现的毒性情况null药物靶组织／细胞血浆I相反应排泄II相反应代谢产物药物转运体PKPD肝功能 肾功能 健康 饮食药物代谢酶受体血浆结合蛋白药物作用于体内的过程活化/非活化通路 分子靶点作用水平 DNA的修复机制 促-/抗-凋亡通路影响化疗药物反应的遗传多态性影响化疗药物反应的遗传多态性药物代谢酶 转运体 作用靶标影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物代谢酶的遗传多态性影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物代谢酶的遗传多态性null(Evans and Relling, Science 286: 487-91, 1999)具有多态特性的药物代谢酶活性对药代和药效的影响因素具有多态特性的药物代谢酶活性对药代和药效的影响因素是否介导母药或主要代谢产物的代谢 母药或代谢产物是否具有活性 介导的代谢途径在药物总清除率中占的比重 具有药理活性成份的作用强度 消除药物的其它途径的强度 6-巯基嘌呤（6-MP）与巯基嘌呤甲基转移酶（TPMT）6-巯基嘌呤（6-MP）与巯基嘌呤甲基转移酶（TPMT）6-MP6-mMP6-TIMP6-mTIMP6-TGNTPMT与DNA结合骨髓细胞6-MP与TPMT ——TPMT活性表型6-MP与TPMT ——TPMT活性表型白种人群 TPMT酶活性呈三态分布 89%具有较高的红细胞内TPMT酶活性 约11%中等酶活性 约300个个体出现1个极低的酶活性或无活性 亚洲人群 韩国人呈单态分布 中国人为二态分布，且TPMT酶活性明显高于美国白人或美国黑人6-MP与TPMT ——ALL患者中6-MP剂量的调整6-MP与TPMT ——ALL患者中6-MP剂量的调整TPMT缺陷患者 应接受常规剂量的7-10% (Relling et al, JNCI 1999) 高TPMT活性的野生型患者（90%的ALL患儿） 应用全剂量的6-MP 变异程度高达5倍，未来研究的挑战 原因不清，可能是由于基因表达差异 毒性增加降低剂量；没有毒性逐步增加剂量影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物转运体的遗传多态性影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物转运体的遗传多态性可能影响药物反应的转运体蛋白可能影响药物反应的转运体蛋白药物转运体OATOATPOCTPePTMDRBCRPMRPMDR/P-gp/ABCB1MDR/P-gp/ABCB1由 MDR-1 (ABCB1)编码 与多药耐药现象有关 多个化疗药是其底物 具有遗传多态性紫杉醇与MDR紫杉醇与MDRMDR能够转运紫杉醇 低表达ABCB1的肿瘤细胞对紫杉醇更为敏感 紫杉醇经静脉给药、经肠道排泄，P-糖蛋白在肠道表达的降低将减少紫杉醇自血液循环向肠道的排泄，增加药量。紫杉醇的药效学紫杉醇的药效学Rowinsky, E.K. et al. (1995) NEJM: 332; 1004-14.3435C>T SNP 对应用紫杉醇后周围神经病变的影响3435C>T SNP 对应用紫杉醇后周围神经病变的影响Sissung, T.M. (Figg) et al. (2006) EJC野生型的患者能将紫杉醇泵出胞外，避免了毒性2677/3435 双突变 (DV)基因型对应用紫杉醇的患者的嗜中性白血球减少症的影响2677/3435 双突变 (DV)基因型对应用紫杉醇的患者的嗜中性白血球减少症的影响Sissung, T.M. (Figg) et al. (2006) EJC2677/3435 双突变 (DV)基因型对应用紫杉醇的患者的嗜中性白血球减少症的影响2677/3435 双突变 (DV)基因型对应用紫杉醇的患者的嗜中性白血球减少症的影响Sissung, T.M. (Figg) et al. (2006) EJC同样，因为野生型ABCB1将紫杉醇泵出胞外，所以很少出现嗜中性白血球减少症影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物作用靶标的遗传多态性影响化疗药物反应的遗传多态性 ——肿瘤化疗与药物作用靶标的遗传多态性5-氟尿嘧啶（5-FU）和胸苷酸合成酶（TS）、二氢嘧啶脱氢酶（DPD）5-氟尿嘧啶（5-FU）和胸苷酸合成酶（TS）、二氢嘧啶脱氢酶（DPD）5-FdUMP+CH2THF+ TS ===稳定的三重复合物， 抑制TS活性，进而抑制DNA合成。5-FU和TS5-FU和TSLenz et al等人的研究报道：65例胃癌患者采用FP化疗，采用胃镜穿刺活检得到的新鲜胃腺癌标本，定量PCR检测TS mRNA水平： TS mRNA水平低者：中位生存期43个月。 TS mRNA水平高者：中位生存期06个月。 结论： TS mRNA水平低者对5-Fu为基础的化疗敏感。5-FU和TS5-FU和TSTS mRNA的高低与化疗有效率、生存期之间的关系在肠癌、肺癌、乳癌中也得到进一步证实。许多研究组认为TS的过表达还与多种恶性肿瘤的预后相关 TS的调节控制机制相当复杂，涉及转录、翻译及翻译后水平等多个步骤。已有研究表明TSER（TS增强子区域）的基因多态性在一定程度上控制着TS的表达。5-FU和TS5-FU和TSTSER由不同拷贝数的28bp三联子重复序列构成。 体外实验证实提高28bp三联子重复序列数目将导致TS基因表达增加，TS酶活性提高。 Pullarkat et al 报道TSER*3R纯合子的TS mRNA水平比TSER*2R纯合子高3.6倍。 另有研究报道，在TSER*3串联重复片段基因中G〉C的变异会影响TS基因的转录激活。5-FU和DPD5-FU和DPDDPD是5-FU代谢的限速酶 DPD缺陷能导致出现危及患者生命的毒性 DPYD至少有20个突变 多数DPD酶活性缺陷的患者至少可检测到一个突变null三、我室开展的工作我室开展的工作（一） ——药物代谢酶的药物基因组学研究 ——TPMT遗传多态性检测与6-巯基嘌 呤应用的研究 我室开展的工作（一） ——药物代谢酶的药物基因组学研究 ——TPMT遗传多态性检测与6-巯基嘌 呤应用的研究 TPMTTPMTTPMT遗传多态性对6-MP的影响已经证实 G460A和A719G是TPMT主要的两个突变点，对于TPMT酶活性至关重要 对这两个SNP进行检测，可将患者分为不同的基因型，预测其对于嘌呤类药物治疗的毒副作用 针对这两个突变位点，我们在原有的检测方法基础上加以技术改进和提高，现在检测方法成熟。欲开展这个检测项目为临床医生用药时提供参考 具体的操作流程见下图：具体的操作流程见下图：TPMT基因型PCR-RFLP结果TPMT基因型PCR-RFLP结果 图1：不同TPMT 460位点的酶切结果 图2：不同样本TPMT 719位点的酶切结果 M: 50 bp ladder 1、2、4、5、6：GG纯合子 3：AA纯合子、 M: 50 bp ladder 1、4、5、6：GG纯合子 2：AG杂合子 3：AA纯合子我室开展的工作（二） ——药物转运体的药物基因组学研究 我室开展的工作（二） ——药物转运体的药物基因组学研究 中国人群ABCG2遗传多态性识别及其功能评价中国人群ABCG2遗传多态性识别及其功能评价Non-synonymous ABCG2 Q141K SNP: substituted amino acid residue- 第五外显子421位碱基C到A的突变导致第141位氨基酸由Lys替代为 Gln (Q141K) - 功能研究表明Q141K遗传多态性具有以下功能： 1. 减少对托泊替康的转运 (Morisaki et al., CCP in press 2004) 2. 体外减少蛋白的表达 (Imai et al, Mol Cancer Ther 2002) 3. 使diflomotecan静脉给药的AUC提高了3倍 (Sparreboom et al, Clin Pharmacol Ther 2004)中国人群ABCG2遗传多态性识别及其功能评价中国人群ABCG2遗传多态性识别及其功能评价我们建立了检测BCRP Q141K、Gln126stop、G34A三个非同义SNP的PCR-RFLP方法，并对汉族96人、维吾尔族132人、蒙古族63人进行基因型分析，正在进行基因型鉴定，随后准备进行数据分析。C421A酶切结果G34A测序结果C376T酶切结果我室开展的工作（三） ——抗瘤药物基因组学研究 我室开展的工作（三） ——抗瘤药物基因组学研究 卢比替康卢比替康 属拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，干扰拓扑异构酶Ⅰ（TOPOⅠ）产生细胞毒作用和细胞抑制作用是一种口服抗肿瘤药物，是喜树碱衍生物，又称9-硝基-喜树碱卢比替康卢比替康卢比替康胶囊口服生物利用度和药代动力学的个体差异较大，这是卢比替康的研发过程中一个必需解决的问题。 国外曾有人研究ABC家族基因多态性和个体间药代动力学差异的关系，认为ABCG2基因与卢比替康的活性代谢产物9-AC有关。 又有文献报道，BCRP、MDR、MRP和TOPO І等的遗传多态性与喜树碱类物质耐药有关。卢比替康药物基因组学研究的总体设计卢比替康药物基因组学研究的总体设计符合入选标准的肿瘤患者接受一定剂量的卢比替康后,检测其各个时间点9-NC和活性代谢产物9-AC的血药浓度，求得9-NC和9-AC在人体内的药代动力学参数。 留取受试患者血样提取全基因组DNA，选取候选基因及相应的SNPs位点，用PCR-RFLP方法进行基因型检测分析。 用统计学方法评价基因型与卢比替康药代动力学的相关性。准备测定的候选基因准备测定的候选基因1 药物转运体有关的候选基因多态性 ① ABCG2(BCRP)② ABCB1(MDR1) ③ABCC1(MRP1) ④ABCC2(MRP2) ⑤ABCC4(MRP4) 2 其它可能与药代相关的候选基因 ①CYP3A4 ②NAT2 ③AST④UGT⑤HAS目前工作开展情况目前工作开展情况卢比替康受试者已收集25例，正尝试建立卢比替康液相-质谱联用的检测方法 已建立检测ABCG2 C421A、C376T和G34A基因型的测定方法 正在尝试建立其它候选基因的检测方法null四、我室发展计划抗肿瘤药物药物基因组学的研究抗肿瘤药物药物基因组学的研究充分发挥我院临床药理基地临床试验的优势，与生产厂家合作，开展抗肿瘤药物药物基因组学研究工作。 重点是中国汉族及少数民族人群药物反应相关基因的遗传多态性的识别及其对抗肿瘤药物的影响。 药物转运体的药物基因组学研究药物转运体的药物基因组学研究现今药物基因组学研究多集中于药物的代谢酶，而药物转运体的遗传多态性对药物反应的影响越来越受到重视。 除了我们正在关注的BCRP以外，其他的转运体是下一步的研究目标。小结小结药物基因组学是以快速增长的人类基因组中所有基因信息来指导新药开发的一个领域。 药物临床试验控制了更多的参数，消除了这些因素可能引起的复合效应，是进行药物基因组学研究的平台。 不同种族之间往往存在遗传差异，在一个种族中可能与疾病或者药物反应相关的某SNP位点在另一个种族中可能并没有任何关系。对于我们来说，国外的药物基因组学研究数据对于我们仅有参考意义。如何在药物临床试验这个平台上进行科学的、适合国情的药物基因组学研究是我们现阶段值得考虑的问题。null谢谢！