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第二章 微生物实验室常用试剂、培养基 第九章 微生物实验室常用试剂与培养基 第一节 常用试剂及其使用方法 一、诊断用纸片 1.杆菌肽纸片（0.04U/片），抑菌圈>10mm为敏感。 质控菌株 A群链球菌阳性 D群链球菌阴性 2.SMZ纸片（1.25μg/23.75μg/片），出现抑菌圈即为敏感。 质控菌株 D群链球菌阳性 A群链球菌阴性 3.新生霉素纸片（5.0μg/片），抑菌圈≥16mm为敏感。 质控菌株 表皮葡萄球菌阳性 腐生葡萄球菌阴性 4.O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片参见第五节《生化试验培养基》。 二、诊断用血清 1.沙门菌属诊断血清 A-F群O多价血清 特异O群因子血清 常用的有O2，O4，O7，O9，O10 特异H因子血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子血清。 2.志贺菌属诊断血清 志贺菌属四种多价血清（含有痢疾志贺、福氏、宋内志贺） 痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清。 福氏志贺菌多价血清及分型血清（1-6型）。 宋内志贺菌诊断血清（除光滑相抗血清外，能制备粗糙相抗血清）。 鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。 3.致病性大肠埃希菌诊断血清 肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清。 产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清。 肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清。 肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157：H7。 4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清。 5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清。 6.链球菌分类诊断血清。 7.肺炎链球菌诊断血清。 8.耶尔森菌诊断血清。 三、常用染色液 (一)革兰染色液 1. 结晶紫溶液 A液 结晶紫 20g 95%乙醇 20ml B液 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前24小时将A液. B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。 2.碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。 3.脱色液 95%乙醇 4.复染液 A贮存液 沙黄 2.5g 95%乙 100ml B应用液: A液 10ml 蒸馏水 90ml (二)抗酸染色液 1．碱性复红染色液 (1)萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5%石炭酸溶液 90ml (2)脱色液 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml (3)复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 100g/L氢氧化钾 0.1ml 蒸馏水 100ml 2.金胺0-罗丹明B染色液 (1)​ 罗丹明B液 罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。 (2)1g/L金胺O液 金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸 5ml,混匀。 (3)3%盐酸酒精 (4)稀释美蓝液 吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。 (三)鞭毛染色液(改良Ryu法) A液 5%石炭酸 10ml 鞣酸 2g 饱和硫酸铝钾液 10ml B液 结晶紫酒精饱和液 应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。 (四)异染颗粒染色液 甲液 甲苯胺蓝 0.15g 孔雀绿 0.2g 95% 乙醇 2.0ml 蒸馏水 100ml 乙液 碘 2g 碘化钾 3g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再中入碘,使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。 (五)荚膜染色液 1．印度墨汁或50g/L黑色素水溶液 2．5g/L苯胺兰水溶液 第2节​  第3节​ 基础培养基 一、液体基础培养基 (一)蛋白胨水(Peptone water) 用途 1.供细菌靛基质试验用。 2.一般细菌培养和传代。 配法 蛋白胨（或胰蛋白胨） 10g Nacl 5g 蒸馏水 1L pH 7.2 将上述成分溶于水中，校正pH,分装试管，每管2~3ml，置121℃灭菌15min备用。 质量控制 大肠埃希菌 生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌 生长良好，靛基质阴性。 (二)营养肉汤(Nutrient broth) 用途 供一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g Nacl 5g 蒸馏水 1L pH 7.4 将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH，按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121℃灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。 质量控制 金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌 生长良好。 保存 置冰箱3周内用完。 (三)牛肉浸液培养基 用途 细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。 配法 新鲜除脂牛肉 500g Nacl 5g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1L pH 7.4~7.6 1.先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用NaOH溶液矫正pH至7.6~7.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经121℃15min灭菌备用。 2.根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基，加入琼脂15g/L~20g/L即可。 质量控制 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。 保存 置4℃冰箱内可以使用较长时间。 注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为3g/L～5g/L。 二、固体基础培养基 (一)营养琼脂(Nutrient agar) 用途 供一般细菌和菌株的纯化及传种用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g Nacl 5g 琼脂粉（优质） 12g 蒸馏水 1L pH 7.2～7.4 将上述成分(除琼脂外)溶于水中，校正pH后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121℃灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。 质量控制 金黄色葡萄球菌 菌落浅黄色； 痢疾志贺菌 菌落无色；铜绿假单胞菌 菌落无色或浅绿色。 保存 置4℃冰箱保存，两周内用完。 (二)血琼脂培养基(Blood agar medium) 用途 供一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种用。 配法 pH7.4~7.6牛肉浸液琼脂 100ml 脱纤维羊血(或兔血) 5~10ml 将血琼脂基础经121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右以无菌手续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。 质量控制 化脓性链球菌ATCC 19615生长良好，β-溶血；肺炎链球菌ATCC 6303生长良好，α-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生长良好,不溶血。 保存 置4℃冰箱，1周内用完。 (三)巧克力琼脂培养基 用途 主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。 配法 鲜牛肉浸出液 1L 蛋白胨 10g Nacl 5g 琼脂粉 12g 无菌脱纤维羊血或兔血 100ml 将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH7.2，置121℃15min高压灭菌，待冷至约85℃，以无菌方法加入兔血，摇匀后置85℃水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室温冷至约50℃，倾注平板或制成斜面备用。 质量控制 流感嗜血杆菌ATCC 10211、肺炎链球菌ATCC 6305生长良好，菌落典型。 保存 置4℃冰箱，1周内用完。 (四)胱氨酸胰化酪蛋白琼脂（CTA） 用途 常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。 配法 胱氨酸 0.5g 胰化酪蛋白 20g NaCl 5g 亚硫酸钠 0.3g 琼脂 3.5g 酚红 0.0175g 蒸馏水 1L 将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，115℃15min灭菌。 用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35℃孵箱，18h~24h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。 第三节 保存和增菌培养基 一、菌种保存培养基 (一)疱肉培养基(Chopped meat medium) 配法 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液（pH7.6） 7ml 将干燥的肉渣0.5克装入15mm×150mm试管内，再加入pH7.6牛肉浸液7ml，两者高度比例为1﹕2。在试管液面上加一层3~4mm高度的融化凡士林，用橡皮塞塞紧，经121℃灭菌15min后，置4℃冰箱备用。 质量控制 破伤风杆菌或坏死梭杆菌48h的培养物，稀释1000倍，每管接种0.01ml，生长良好。 保存 置4℃冰箱内，数月有效。 (二)半固体培养基(Semi-solid medium) 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 3g Na2HPO4·12H2O 2g 琼脂粉 4.5g 蒸馏水 1L pH 7.4~7.6 将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管内的2/3左右的高度，121℃15min高压灭菌，备用。 质量控制 大肠埃希菌(ATCC25922)生长良好,动力阳性。 福氏志贺菌(ATCC12022)生长良好,动力阴性。 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)生长良好,动力阴性。 培养基呈淡黄色半固体状。 二、增菌培养基(enrichment medium) (一)葡萄糖肉汤 用途 用于血液增菌。 配法 蛋白胨(或月示 胨) 10g NaCl 5g 肉浸液（或心浸液） 1L 葡萄糖 3g 枸橼酸钠 3g 5g/L对氨基苯甲酸水溶液 10ml 1mol/L MgSO4·7H2O 20ml 青霉素酶 1000U 将蛋白胨、NaCl混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。 过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50U，经无菌试验合格后，冷却备用。 将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每日取出观察一次结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、EMB及巧克力平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7天，仍无细菌生长方可弃去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。 注:1.枸橼酸钠为抗凝剂，使血液加入培养基中不凝固。 2.对氨基苯甲酸主要能中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。 3.硫酸镁主要能破坏血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。 4.本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体抗药作用提高检出率。 (二)血液增菌培养基(Blood enriched medium) 用途 供血液和骨髓液病原菌的增菌培养用。 配法 蛋白胨 10g Nacl 5g 牛肉膏 3g 葡萄糖 1g 酵母膏粉 3g 枸橼酸钠 3g K2HPO4 2g 5g/L对氨基苯甲酸 5ml 1mol/LMgSO4。7H2O 20ml 4g/L酚红溶液 6ml 青霉素酶 50U 聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g 蒸馏水 1L pH 7.4 将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min经35℃24h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.5～2.5U青霉素酶。 质量控制 伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。 (三)亚硒酸盐增菌培养基(SF)（Selenite enrichment medium） 用途 供沙门菌增菌培养用。 配法 蛋白胨 5g 乳糖 4g 磷酸氢二钠 4.5g 磷酸二氢钠 5.5g 亚硒酸氢钠 4g 蒸馏水 1L pH 7.0~7.1 先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH7.0~7.1(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15mm×150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸10min~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。 取新鲜便例标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35℃培养过夜，如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、HE琼脂或麦康凯平板等，进行培养。 质量控制 培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。 增菌灵敏度 伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。 保存 4℃保存，1周内用完。 注：1.亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠、原则上均可使用。但以亚硒酸氢钠效果为好。 2.磷酸盐缓冲对，两者的用量比例与含量和亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。 3.在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物，而降低抑制性。 4.培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。 (四)SS增菌液(Salmonella Shigela Enrichment Broth) 用途 用于沙门、志贺菌的增菌。 配法 月示 胨 2g 蛋白胨 8g 牛肉膏 3.5g 酵母膏 2g 葡萄糖 2g 枸橼酸铁 10g 硫代硫酸钠 10g 亚硫酸钠 0.7g 胆盐 5.5g Na2HPO4 4g KH2PO4 0.1g 去氧胆酸钠(进口) 1.5g 煌绿 0.005g 蒸馏水 1L pH 7.1 将上述成分加热溶于水中，分装试管（150mm×15mm），每管5~7ml，隔水煮沸5min备用。 取病人粪便标本1g直接种于增菌液内，35℃16h~18h培养，取出分离平板即可。 质量控制 培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。 伤寒沙门菌ATCC50096,福氏志贺菌ATCC12022 生长良好；大肠埃希菌ATCC25922 抑制生长。 注：1.切勿高压，隔水煮沸时间不宜超过5min。 2.煌绿用量应根据不同批号酌情增减。 (五)碱性蛋白胨水(Alkaline peptone water) 用途 供霍乱弧菌增菌培养用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 蒸馏水 100ml pH 8.6 将上述成分溶解于水中,校正pH，分装于试管8~10ml，经121℃15min灭菌备用。 将待检标本接种到碱性胨水中，置35℃培养6h~8h，取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。（经6h~8h培养，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。） 质量控制 各实验室自配或采用商品培养基，用前有条件的实验室可用菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，生长良好者方可使用。 霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌 生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC25922 不生长（6h）。 保存 置4℃冰箱，2周内用完。 注：若在碱性胨水中加入1%亚碲酸钾0.5~1ml/L，则成为亚碲酸钾碱性胨水，其增菌效果更为理想。 第四节 分离培养基 一、革兰阳性杆菌分离培养基 (一)罗-琴改良培养基（Lowenstein-Jenden medium） 用途 供结核分枝杆菌培养用。 配法 KH2PO4 2.4g MgSO4·7H2O6 0.24g 枸橼酸镁(或枸橼酸钠) 0.6g 天门冬素 3.6g 甘油(纯) 12ml 蒸馏水 600ml 马铃薯淀粉 30g 新鲜鸡卵液 1L 2%孔雀绿水溶液 20ml 先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60℃左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支5~6ml，塞紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经85℃1h间歇灭菌二次(或高压灭菌115℃20min)，待凝固后经无菌试验，4℃冷藏备用。 取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约二滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置35℃5%~10%CO2温箱内培养1~4周，观察结果。凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，呈奶油状，略带黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检，及作其鉴定。 质量控制 自制或商品培养基在使用前，均应进行性能监测，符合要求者方可应用。 保存 置4℃冰箱内2~4周有效。 注：1.本培养基pH约为6.0左右，一般无须校正。 2.间歇灭菌的温度不宜超过90℃。 (二)血清斜面培养基(吕氏血清斜面) 用途 供白喉棒状杆菌培养用。 配法 1%葡萄糖肉汤(pH7.6) 100ml 无菌动物血清(牛羊猪兔) 300ml 将上述成分混合后，分装于试管内，每管约4~5ml。斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热80~85℃30min，使血清凝固成斜面，冷却后放4℃冰箱内。取出后采用间歇灭菌法，85℃灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。 将喉拭直接接种于上述斜面上，置35℃培养16h~24h。白喉杆菌在上述培养基上，菌落呈圆形，表面光滑、完整，盐水中易乳化，用阿尔培脱染色，两极异染颗粒明显。 注：1.所用血清不能含有防腐剂。 2.该培养基不能高热灭菌，以防破坏其营养成分。 3.配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。 (三)亚碲酸钾血琼脂 用途 分离白喉杆菌用 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉浸膏 3g 葡萄糖 2g 胱氨酸 0.05g 1%亚碲酸钾 45ml 脱纤维羊血 100ml 琼脂 2g 蒸馏水 900ml pH 7.6 先将蛋白胨、NaCl、牛肉膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解，调pH至7.6，加入琼脂，高压灭菌115℃15min备用。待冷至50℃左右，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血，混匀倾注平板。 将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。置35℃孵箱，经24h~48h培养，观察结果。白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成黑色和灰黑色的菌落。其它大部分细菌在此培养基上被抑制，故较易鉴别。 二、革兰阴性杆菌分离培养基 (一)弧菌分离培养基 1.碱性琼脂 用途 供霍乱弧菌分离培养用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 脂 20g 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分混合于水中，加热溶解，校正pH至 8.4，分装后高压灭菌121℃15min倾注平板。 凡急性病人水样便在做增菌培养的同时，应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。置35℃培养12h~16h，观察结果。霍乱弧菌生长较快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑湿润。在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。 质量控制 各实验室凡自配或商品培养基,在使用前有条件的实验室可用标准菌株生长对照，临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进行目的菌监测,质量可靠者方可使用. EL-Tor弧菌 生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 抑制生长。 保存 置4℃冰箱，1周内用完。 2.碱性胆盐琼脂(Alkaline bile-salt agar） 用途 用于霍乱弧菌的分离培养。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g~10g 琼脂 20g 胆盐（牛、猪） 2.5g 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分称量混合于水中加热溶解，校正pH，分装高压灭菌121℃15min，倾注平板。 取病人粪便标本或增菌培养物1接种环接种平板，置35℃温箱培养16h~18h。霍乱弧菌迅速生长，其它细菌生长较缓慢。在16h~18h，霍乱弧菌的菌落较大，直径可达2mm左右。呈扁平，青灰色，半透明，光滑湿润，易挑起。其它细菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。 质量控制 同碱性琼脂。 保存 置冰箱，1周内用完。 3.庆大霉素琼脂(Gentamicin Agar) 用途 供霍乱弧菌分离培养用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 枸橼钠 10g 无水亚硫酸钠 3g 蔗糖(或白糖) 10g 琼脂 15g~20g 庆大霉素,多粘菌素B“双抗液” 2ml 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分(除双抗液外)称量混合于水中，加热溶解，校正pH，分装灭菌121℃15min，待冷却至50℃后，每100ml内加“双抗液”0.2ml，另加5g/L亚碲酸钾水溶液0.1ml，再倾注平板。最后每ml培养基内含有庆大霉素0.5U，多粘菌素B6U。 将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上，置35℃培养16h~18h。 由于该培养基抑制性强，其他非弧菌科细菌被抑制，而霍乱弧菌生长迅速，16h菌落可达2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑湿润。培养时间长，菌落略黄色、隆起，中心厚而不透明。 质量控制 霍乱弧菌(小川、稻叶)生长良好，培养18h~24h菌落直径2.5~3.0mm；大肠埃希菌和变形杆菌抑制生长。（由于临床实验室不允许保存霍乱弧菌，实际工作中可用非01群弧菌代替）。 保存 置4℃冰箱内，1周内用完。 注：1.该培养基国内有商品出售，多数产品已加入庆大霉素，使用时，应详阅#说明#。 2.“双抗液”配制 98ml灭菌蒸馏水中加庆大霉素(25，000U/ml)1ml，多粘菌B或抗敌E(300，000U/ml)1ml。4℃冰箱保存一个月用完。 4.四号琼脂(No.4 Agar) 用途 供分离霍乱弧菌用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 亚硫酸钠(无水) 3g 柠檬酸钠 10g 猪胆汁粉 5g 十二烷硫酸钠 20g 利凡诺（雷佛奴尔） 3g 琼脂粉 12g 庆大霉素亚碲酸钾混合液 1ml 蒸馏水 1L pH 8.0 将上述8种成分放入玻璃或搪瓷容器内(严禁用铝制容器等金属容器)，加入蒸馏水，加热溶解混合后，调整至pH8.0,然后按1.2%加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后，冷至60℃左右，按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液(1ml 40，000U庆大霉素加79ml蒸馏水混合后，加入0.8g亚碲酸钾溶解混合即成，每ml含500U的庆大霉素和10g/L亚碲酸钾)0.1ml，摇匀，倾注平板。 取待检标本划线接种平板，置35℃培养过夜。 8h后即可初步观察结果，24h培养霍乱弧菌呈中心黑色较大而扁平的菌落，较易鉴别。 质量控制 配成的培养基呈亮黄色透明； EL-Tor弧菌稻叶型生长良好； EL-Tor弧菌小川型生长良好； 大肠埃希菌ATCC25922抑制生长。 注：1.庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。 2.雷夫奴尔应避光保存，而且每批均应预试后方可使用。成品培养基应避光保存。 (二)肠杆菌分离培养基 1.中国蓝琼脂(Chinese blue Agar) 用途 系分离肠道菌的弱选择性培养基。 配法 肉膏汤琼脂(pH7.4) 1L 10g/L中国蓝水溶液(灭菌) 10ml 乳糖 10g 10g/L蔷薇红酸乙醇溶液 10ml 取乳糖10g置于已灭菌的肉膏汤琼脂瓶内，加热溶解琼脂并混匀。待冷却至50℃左右，加入中国蓝、蔷薇 红酸溶液混匀，立即倾注平板，凝固后备用。 将标本接种平板，置35℃18h～24h。分解乳糖产酸的细菌，其菌落呈蓝色；不分解乳糖的细菌，菌落为淡红色的透明菌落。 质量控制 大肠埃希菌ATCC 25922菌落呈蓝色。 痢疾志贺菌Ⅰ型ATCC 13313和鼠伤寒沙门菌ATCC 13311菌落呈淡红色。 保存 4℃冰箱保存，1周内用完。 注：(1)中国蓝水溶液需煮沸或高压115℃15min灭菌后应用。蔷薇红酸乙醇溶液无需灭菌，但加热时应避开火焰。 (2)蔷薇红酸能抑制革兰阳性细菌生长，但对大肠埃希菌没有抑制作用，标本接种量不宜太多。 (3)此培养基pH7.4，制好后应呈淡红色，若过碱呈鲜红色，过酸则呈蓝色，均不适用。 2.木糖、赖氨酸、去氧胆酸盐(XLD)培养基 用途 为肠道菌选择性培养基。 配法 酵母浸膏 3g L-赖氨酸 5g NaCl 5g D-木糖 3.75g 乳糖 7.5g 蔗糖 7.5g 去氧胆酸钠 2.5g 硫代硫酸钠 6.8g 枸橼酸铁铵 0.8g 琼脂 13.5g 1%酚红溶液 8ml 蒸馏水 1L 将上述成分(酚红除外)混合，加热溶解，校正pH至7.2,再加入酚红溶液混匀。121℃高压灭菌15min，倾注平板备用。 将标本划线接种平板，置35℃培养18h～24h。大肠埃希菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属细菌在本培养基上形成黄色、不透明菌落；大多数沙门菌属细菌因不利用糖类，为半透明红色或无色菌落。 质量控制 大肠埃希菌 呈黄色菌落； 宋内志贺菌 呈无色菌落； 伤寒沙门菌 呈红色菌落有黑心； 金黄色葡萄球菌 抑制生长 保存 贮存于4℃有效期5天。 3.SS琼脂(Salmonella~Shigella agar) 用途 供沙门菌属和志贺菌属的分离培养用。 配法 月示胨 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 琼脂 15~20g 胆盐(No.3) 3.5g 枸橼酸钠(2H2O) 8.5g 硫代硫酸钠(5H2O) 8.5g 枸橼酸铁 1g 1%中性红水溶液 2.5ml 0.1%煌绿水溶液 0.33ml 蒸馏水 1L pH 7.0~7.1 将上述成分(除中性红，煌绿外)混合于水中，加热煮沸溶解，校正pH，然后加入中性红和煌绿水溶液，充分混匀冷却至50℃时倾注平板。 将标本接种平板，置35℃培养18~24h。沙门菌属其菌落呈无色半透明，产生H2S者菌落中心呈黑色。志贺菌属的菌落呈无色半透明。大肠菌属呈红色浑浊。宋内志贺菌能延缓发酵乳糖，培养24h后可以出现红色菌落。肠道致病菌的菌落均可达1.5mm以上。 质量控制 大肠埃希菌菌落 呈红色； 痢疾志贺Ⅰ型、福氏志贺菌和伤寒沙门菌 生长良好，菌落无色； 肠炎或猪霍乱沙门菌菌落 呈黑色； 粪肠球菌、金黄色葡萄球菌 不生长。 保存 避光，3天内用完。 注：煌绿要新配，中性红要优质。 4.麦康凯琼脂(Maconkey agar) 用途 供肠道致病菌的分离培养和非发酵细菌鉴别用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 胆盐(猪、牛、羊) 5g 乳糖 10g 琼脂 15~20g 1%中性红溶液 5ml 蒸水 1L pH 7.2 将上述成分(除中性红外)称量加入水中，加热溶解，校正pH，加入中性红溶液，分装灭菌115℃20min，冷却至50℃左右时倾注平板。 取标本或增菌培养物接种平板，置35℃培养18~24h。不发酵乳糖的肠道细菌呈无色菌落，直径约2.0mm左右，光滑半透明。 质量控制 大肠埃希菌菌落 呈桃红色； 痢疾志贺菌菌落 呈无色； 伤寒沙门菌菌落 无色； 金黄色葡萄球菌 不生长。 保存 置4℃冰箱(避光)，1周内用完。 注：非发酵细菌在该平板上是否生长，是临床鉴定某些非发酵细菌的指标之一。 5.伊红美蓝琼脂(Eosin methylene blue agar) 用途 供肠道致病菌及大肠菌群的分离培养。 配法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 20g/L伊红Y水溶液 20ml 6．5g/L美蓝水溶液 10ml 琼脂 17g 蒸馏水 1L pH 7.1 将蛋白胨、磷酸盐、琼脂称量混合于水中，并加热煮沸溶解，校正pH，分装灭菌121℃15min备用。临用时加热溶化琼脂加入乳糖，冷至50℃~55℃时加入伊红和美蓝水溶液，摇匀倾注平板。 取粪便标本或增菌培养物接种平板，置35℃培养18h~24h。根据检验目的不同，挑取无色菌落或挑选紫红色及有金属光泽的菌落转种克氏双糖或三糖铁琼脂进行鉴定。 质量控制 大肠埃希菌菌落 呈紫红色，有时有金属光泽，直径＞2.3mm。 伤寒沙门菌菌落呈灰白色，直径＞1.8mm。金黄色葡萄球菌不生长。 保存 置4℃冰箱，1周内用完。 6.克氏双糖铁琼脂(Kliger iron agar) 用途 供肠杆菌科细菌的初步鉴定用。 配法 蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 50g 枸橼酸铁铵 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 0.2%酚红水溶液 5ml 琼脂 12ml 蒸馏水 1L pH 7.5 将上述成分（除琼脂、酚红外）称量混合于水中，加热溶解，校正pH，再加入琼脂和酚红溶液，煮沸溶解分装试管，每管4ml，经115℃灭菌20min，立即制成高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。 取待检菌纯培养物，用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35℃培养18～24h，观察结果。斜面变黄，底层变黄，产气者或不产气者多属大肠埃希菌群及发酵乳糖的菌株。斜面变红，底层变黄，为不发酵乳糖菌株。产H2S菌株可使底层或全管产生黑色反应。 质量控制 奇异变形杆菌 K/A H2S阳性； 大肠埃希菌 A/A； 志贺痢疾杆菌 K/A； 伤寒沙门菌 K/A H2S阳性； 铜绿假单胞菌 K/K。 保存 置4℃冰箱，2周内用完。 注:该培养基pH尤为重要，pH7.5时使用效果最佳。 7.三糖铁琼脂(Triple sugar iron agar) 用途 供肠杆菌科细菌初步生化鉴定用。 配法 蛋白胨 15g 月示胨 5g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 5g 硫酸亚铁 0.2g 硫代硫酸钠 0.3g 0.2%酚红溶液 5ml 琼脂 12g 蒸馏水 1L pH 7.4 将上述成分(除琼脂和酚红外)称量混合于水中，加热溶解后校正pH，再加琼脂及酚红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4ml，经115℃灭菌20min，立即置高层斜面，待凝固后，经无菌试验备用。 取待检菌纯培养物，用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35℃培养18h~24h观察结果。发酵乳糖或蔗糖的菌可使斜面及底层均变黄色。不发酵乳糖和蔗糖的细菌仅发酵葡萄糖时使底层变黄，斜面变红。产生H2S的菌株可使底层或整个培养基呈黑色。分解乳糖或蔗糖后产气时有些菌株还能使培养基断裂。 质量控制 伤寒沙门菌 K/A H2S阳性； 副伤寒沙门菌 K/A H2S阳性； 痢疾志贺菌 K/A； 大肠埃希菌 A/A； 普通变形杆菌 A/A H2S阳性； 铜绿假单胞菌 K/K。 保存 置4℃冰箱，2周内用完。 注：该培养基pH7.5时使用效果最佳。 8.山梨醇麦康凯琼脂(Macconkey agar with Sorbitol) 用途 用于致病性、侵袭性和产毒性大肠埃希菌分离培养。 配法 蛋白胨 5g 月示胨 3g Nacl 5g 胆盐（猪、牛、羊） 5g 山梨醇 10g 琼脂粉 12g 0.1g/L结晶紫水溶液 1ml 5g/L中性红水溶液 5ml 蒸馏水 1L pH 7.2 将上述成分(除琼脂粉、山梨醇、结晶紫和中性红)混合于水中，加热溶解，校正pH，再加入琼脂粉加热煮沸溶解。分装三角烧瓶100ml。经121℃15min灭菌备用。临用时，加热溶解，再加山梨醇、结晶紫及中性红水溶液，摇匀倾注平板。 将标本或增菌液接种平板，置35℃培养18h～24h。与麦康凯琼脂不同之处是挑取致病性大肠的菌落时，以无色菌落为主，同时也不能放弃红色菌落，如EPEC迟缓分解山梨醇，菌落呈红色。EHEC O157﹕H7菌落无色。 质量控制 参照麦康凯琼脂。 保存 置4℃冰箱，1周内用完。 (三)非发酵细菌用培养基 1.金氏培养基(甲)(Kings Medium) 用途 检测假单胞菌产生的青脓素 配法 蛋白胨 20g 无水氯化镁 1.4g 无水硫酸钾 10g 琼脂 15g 甘油 10ml 蒸馏水 1L pH 7.2 将上述成分加热、溶解，调整至pH7.2，分装试管，118℃~121℃灭菌15min，制成斜面和高层备用。 取待检菌划种于上述斜面上，35℃培养过夜。观察斜面上产色素情况。 2.氧化-发酵试验培养基(Hugh-Leifson) 用途 本试验供检测细菌的代谢类型用。 配法 （1）Hugh-Leifson培养基(革兰阴性杆菌用) 蛋白胨 2g 葡萄糖 10g K2HPO4 0.3g NaCl 5g 溴麝香草酚蓝（BTB） 0.03g 琼脂 2.5g 蒸馏水 1L pH 7.1 （2）葡萄球菌O/F(供葡萄球菌和微球菌鉴别用) 胰蛋白胨 10g 酵母浸膏 10g 琼脂 20g 溴甲酚紫 0.001g 蒸馏水 1L 葡萄糖 10g pH 7.1 将上述成分混合加热溶解，调pH至7.1，分装于试管中，每支试管5ml，高压灭菌121℃15min，使成琼脂高层，备用。 从斜面上挑取少许培养物，同时穿刺接种两支培养基，其中一支接种后，滴加液体石蜡于培养基表面，高度约1cm。置35℃孵箱培养24h~48h。培养基变黄表示细菌分解葡萄糖而产酸，颜色不变为不分解葡萄糖。 质量控制 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC 25922 发酵型； 铜绿假单胞菌ATCC27853 氧化型； 易变微球菌、粪产碱杆菌 不利用。 注：(1)有些细菌不能在上述培养基上生长，若出现这种情况，要在该培养基中加入2%血清或10g/L酵母浸膏，重做试验。 (2)指示剂不能用乙醇配制，因有些细菌可使乙醇产酸，导致发酵或氧化反应的假阳性。 （四）其它革兰阴性杆菌用培养基 1．军团菌培养基 缓冲活性炭酵母琼脂培养基（Buffered charcoal yeast extract agar ，BCYE） 用途 用于嗜肺军团菌的分离培养。 配法 酵母浸液 10g 活性炭（NoritSG） 2g L-半胱氨酸盐酸盐 0.4g 可溶性焦磷酸铁盐 0.25g 琼脂 17g N-2-乙酰氨基-乙氨基乙醇磺酸（ACES） 10g 蒸馏水 80ml pH 7.0 上述成分除半胱氨酸及焦磷酸铁外，其余成分混合加热溶解，经121℃15min 灭菌，放水浴中冷却到50℃，另外分别配新鲜L-半胱氨酸溶液（10ml蒸馏水中含0.4g）及焦磷酸铁溶液（10ml含0.25g），分别过滤除菌，再加入已灭菌琼脂中， 加入1mol/L KOH4～5ml使培养基的最终PH为6.9～7.0，需要时可用1mol/L HC1校正，倾注平板，冷却后置4℃冰箱备用，亦可制成斜面，用于保存菌种，该培养基为黑色。 液体标本可直接接种培养基， 肺、肝、脾等固体标本须制成100g/L悬液后再接种培养基，接种后的培养基置35℃需氧环境培养，培养箱需保持一定的湿度。每天用解剖镜检查平板培养物，用略高于10度角的斜射光源照明。在BCYE平板上，培养4～5天，菌落直径约1～2mm，并出现亮蓝和切削玻璃样的构造，继续培养后菌落增大呈黄绿色，较光滑。 保存 在室温、暗室中可保存1周 2．弯曲菌选择性培养基 （1）Skirrow’s培养基(Skirrow’s medium) 用途 供空弯及幽门螺杆菌分离培养用 配法 蛋白胨 5g 胰蛋白胨 5g 酵母膏 5g NaCl 5g 琼脂粉 12g 万古霉素 10ml 多粘菌素B 2500U TMP 5mg 脱纤维羊血 70ml 蒸馏水 930ml pH 7.4 除血和抗生素外，其余成分混合于水中，加热溶解，调pH7.2，121℃灭菌15min。待冷至50℃时加入羊血7ml和多抗液0.5ml，摇匀，倾注无菌平皿。 将标本接种平板，置25℃或43℃微需氧环境中培养48h，菌落直径达1~2mm，不溶血的菌落。 质量控制 大肠埃希菌ATCC 25922和粪肠球菌ATCC33186 不生长；空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC 29424 生长良好。 注：1．多抗液的配制 （1）乳酸62mg(约2滴)加入100ml灭菌水中，然后加入TMP100 mg，混合加热100℃灭菌。 （2）取（1）液5ml，再加万古霉素100mg和多粘菌素B 0.38mg，摇匀后即可成多抗液。 2．弯曲菌属系微需氧菌，培养时可提供5% O2及10% CO2。高浓度氧不利于细菌生长，尤其是幽门螺杆菌，因此标本采集后，应尽快接种培养，或置运送培养基中运送。 3．弯曲菌运送可用布氏菌汤培养基。 2．Campy-BAP培养基（Campy-BAP medium） 用途 分离培养弯曲菌用 配法 蛋白胨 10g 胰胨 10g 葡萄糖 10g 酵母浸膏 3g NaCl 5g 重亚硫酸钠 0.1g 蒸馏水 900ml 脱纤维羊血 100ml 抗菌药物添加剂 万古霉素 10mg 多粘菌素B 2500U TMP 5mg 两性霉素B 2mg pH 7.2 用法 将上述成份（除羊血和抗菌补充剂外），加入900ml蒸馏水，加热溶解，调pH后分装，121℃15min灭菌，加入羊血和抗菌药物添加剂，充分混匀后倾注于无菌平皿内。取标本接种于平板，置25℃或43℃微需氧环境中培养48h，菌落直径达1~2 mm，不溶血的菌落。 质量控制 大肠埃希菌ATCC 25922 不生长； 粪肠球菌ATCC 33186 不生长； 空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC 29424生长良好。 第五节 生化试验培养基 一、糖发酵试验培养基 (一)糖醇发酵试验培养基 用途 检查细菌对不同糖(醇)类的发酵能力，达到鉴定细菌的目的。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 安德烈(Andrade)指示剂 10ml 蒸馏水 1L 各种糖(醇)类 5~10g pH 7.2 将上述成分混合后，加热溶解。矫正pH至7.2。根据需要，分别再加相应的糖和醇。分装于13mm×100mm的试管，每管约3ml，115℃15min灭菌。如需观察产气，可在试管内加小倒管一只。 将分离的纯菌接种到糖（醇）发酵管中，置35℃培养18h～24h。接种菌若能分解培养基中的糖（醇）类而生成酸，使指示剂呈酸性反应，若产生气体，则可使液体培养基中的倒管(Durham管)内出现气泡，若接种菌不分解糖（醇）则无反应。 (二)血清菊糖试验培养基(Serum Inulenin Medium) 用途 供肺炎链球菌及其它链球菌鉴别用。 配法 血清(兔血清或牛血清) 25ml 0.1%酚红溶液 2ml 菊糖 1g 蒸馏水 75ml pH 7.4 先取血清25ml、蒸馏水75ml混合，置阿诺灭菌器内加热15min，以破坏血清内的淀粉酶。调pH至7.4，然后加入菊糖1.0g、1g/L酚红溶液2ml摇匀。分装于13mm×100mm的试管，每管2ml。用间歇灭菌法灭菌，每日1次，连续3天，每次20min。 将被检菌接种培养基，置35℃18~24h培养。分解菊糖的菌株使培养基变黄；不分解菊糖的菌株，培养基不变色。 质量控制 肺炎链球菌ATCC 10015 阳性； 化脓性链球菌ATCC 19615 阴性。 (三)胆汁七叶苷试验培养基(Bile Esculin Hydrolysis Test) 配法 蛋白胨 5g 牛肉浸膏 3g 牛胆汁 40g 七叶苷 1g 枸橼酸铁 0.5g 琼脂 15g 蒸馏水 1L 将上述成分混合加热溶解，调pH至7.2，分装试管，115℃灭菌15min。 将待测菌种接种到七叶苷培养基的斜面上，置35℃孵育18h～24h，观察结果。培养基变为黑色或棕色者为阳性；不变色者为阴性。 质量控制 粪肠球菌 ATCC29212 阳性； 化脓性链球菌ATCC19615 阴性。 保存 置4℃冰箱，2周内用完。 二、酶类测定培养基和试剂 (一)氨基酸脱羧酶试验培养基(赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸) 用途 检查细菌使氨基酸脱羧基形成胺使培养基变碱的能力。常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。 配法 蛋白胨 5g 牛肉浸膏 5g 溴甲酚紫 0.1g 甲酚红 0.005g 吡多醛(VB6) 0.005g 葡萄糖 0.5g 蒸馏水 1L 加热慢慢溶解，按10g/L浓度加入所需要的氨基酸，调pH至6.0，呈深亮紫色。分装每支2ml，同时配对照管(不加氨基酸)，高压灭菌121℃15min,冷却后4℃冷藏备用。 将试验菌接种培养基，同时接种对照管一支。并用灭菌的液体石蜡覆盖，置35℃18h~24h培养。阳性菌初期由于细菌发酵葡萄糖产酸呈黄色，若继续孵育，氨基酸经脱羧产生胺类使培养基变碱，指示剂改变颜色，呈紫色或紫红色。阴性呈黄色或不变色。 质量控制 赖氨酸脱羧酶 迟缓爱德华菌 阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性； 鸟氨酸脱羧酶 产气肠杆菌阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性； 精氨酸脱羧酶 鼠伤寒沙门菌阳性，普通变形杆菌阴性。 (二)耐热DNA酶培养基 用途 用于检测细菌所产生的耐热脱氧核糖核酸酶。 配法 胰蛋白胨 1.5g 植物蛋白胨 0.5g NaCl 0.5g DNA 0.2g 琼脂 1.5g 蒸馏水 100ml 2g/L甲苯胺蓝溶液 0.25ml 除甲苯胺蓝外，将其余成分徐徐加热溶解后，调pH至7.4，分装试管，高压灭菌121℃15min后备用。 上述琼脂倾注于载玻片上，凝固后，打孔，孔径2cm，孔内加入经100℃15min隔水加热处理后的肉汤培养物。将载玻片孵育于35℃湿盒内4h,取出观察结果。阳性反应在孔周围出现不小于4mm直径粉红色圈，阴性反应培养基的颜色无改变。 质量控制 金黄色葡萄球ATCC 25923 阳性； 表皮葡萄球菌ATCC 12990 阴性。 (三)DNA酶试验培养基(DNase medium) 用途 供细菌DNA酶测定用。 配法 DNA(脱氧核糖核酸) 2g 胰酪胨 15g 大豆胨 5g Nacl 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1L pH 7.2~7.4 将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，分装三角烧瓶，经115℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，4℃冷藏备用。 将待检菌作点状穿种在平板上，置35℃培养24h。待细菌生长成集落菌苔后，在其菌苔上及周围滴加0.1mol/L HCl溶液数ml，待片刻后，如待检菌DNA酶阳性者，可在菌苔的周围出现明显的透明圈。而阴性者则无透明圈出现。 质量控制 金黄色葡萄球菌ATCC 25923和粘质沙雷菌 ATCC 274 阳性; 表皮葡萄球菌ATCC 14990和大肠埃希菌ATCC 25922 阴性。 保存 置4℃冰箱1周内用完。 (四)氧化酶试验 用途1.区别假单胞菌与氧化酶阴性的肠杆菌科细菌。 2.大多数革兰阳性菌是氧化酶阴性。 3．有助于属间的鉴别 莫拉菌属、奈瑟菌属、产碱杆菌属、弧菌科（阳性）不动杆菌属、肠杆菌科（阴性）， 试剂 盐酸二甲基对苯二胺（或四甲基对苯二胺）0.1g加蒸馏水10ml，置棕色瓶内可用一周，4℃冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。亦可采用市售商品试剂或试纸，但均需进行质量控制后方可使用。 取白色洁净滤纸一角，沾取试验菌落少许，加试剂一滴。阳性者立即显粉红色，并于5s～10s内呈现深紫色反应，阴性不变色。四甲基对苯二胺阳性呈蓝色，阴性不变色。 质量控制 铜绿假单胞菌ATCC27853 阳性; 大肠埃希菌ATCC25922 阴性。 (五)尿素酶试验培养基(Urea Medium) 用途 用于细菌尿素酶测定。 配法 蛋白胨 1g 葡萄糖 1g Nacl 5g 磷酸二氢钾 2g 4g/L酚红溶液 3ml 琼脂 18~20g 20%尿素溶液 100ml 蒸馏水 1L pH 7.0 将上述成分（除酚红、尿素外）混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，然后加入酚红溶液，分装每瓶100ml，经121℃灭菌15min备用。临用时，加热溶解，冷却至55℃左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀立即无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面。经无菌试验后备用。 取培养物接种斜面，35℃孵育24h。尿素酶阳性者斜面变红色,阴性者无颜色变化。 质量控制 普通变形杆菌ATCC 13315(8h)整个培养基变红、肺炎克雷伯菌ATCC 27236仅斜面变红(24h)； 大肠埃希菌ATCC 25922为阴性(24h)； 保存 置4℃冰箱，2周内用完。 (六)血浆凝固酶试验培养基（Plasma Coagulase） 用途 凝固酶试验专门用于葡萄球菌属内金黄色葡萄球菌（阳性），表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌（阴性）的鉴定，它通常作为细菌毒力或致病性的指征。 1.玻片法 取未稀释的血浆与生理盐水各一滴，分别滴在玻片上，挑取试验菌分别与血浆及盐水混合，立即观察结果。阳性结果一般在5s～20s内出现凝集，超过2min方出现凝集者为阴性。 2.试管法 预备小试管3支，各加1﹕4稀释的血浆0.5ml，其中一支加试验菌的生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml;另一管加阳性阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml,为阳性对照；第三支管加生理盐水或肉汤做阴性对照。将3支试管同置35℃水浴中，每隔30min观察一次结果。若3h内试验管和阳性对照出现凝固，阴性对照不凝固，为阳性。 多数致病性葡萄球菌在30min~1h内，就会出现明显凝固，但也有少数致病性菌株凝固力较弱，在24h出现凝固。 质量控制 金黄色葡萄球菌ATCC 25923 阳性； 表皮葡萄球菌ATCC 14990 阴性。 (七)磷酸酶试验培养基(Phosphatase Test) 用途 测定细菌产生磷酸酶的能力。用于区别葡萄球菌有无致病性，致病性葡萄球菌阳性。另外有助于克雷伯菌属与肠杆菌属的鉴定。 配法 1.10g/L的磷酸酚酞溶液。 2.培养基 营养琼脂培养基。 将上述琼脂加热溶化，待冷却至45℃时，加入滤过除菌的10g/L的磷酸酚酞溶液1ml，摇匀后倾注平板。 接种待测菌株，35℃培养18~24h。在平皿盖上滴加浓氨水一滴，熏蒸片刻。如有酚酞释出，菌落即变为粉红色为阳性；不变色为阴性。 注：1.亦可用液体法进行试验，经培养后在培养基内滴加NaOH溶液，观察结果，显红色为阳性。 2.以上为酸性磷酸酶的试验方法。如果作碱性磷酸酶试验，可将磷酸对硝基酚加入pH10.5，0.04mol/L的甘氨酸NaOH缓冲液内，此试液为碱性，观察结果时不必另行加碱。 3．酚酞指示剂产生的颜色随其pH而变化，试剂的量要准确，太少或太多的碱均可引起假阳性或假阴性结果。 (八)马尿酸盐试验培养基(Hippurate Medium) 用途 测定细菌水解马尿酸钠能力用。该培养基常用方法有二种。 1.氯化高铁法 苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成有色的苯甲酸铁沉淀。 配法 马尿酸钠 1g 肉汤 100ml pH 7.8 FeCl3试剂配制 FeCl3·6H2O 12g溶于2%盐酸100ml中备用。 将上述成分加热溶解后分装于试管中，每管4ml，高压灭菌121℃15min。冷却后用玻璃蜡笔记录培养基液面，置冰箱中备用。 取纯菌接种培养基，35℃培养48h，观察培养基液面，如液面下降时以蒸馏水补充之，离心沉淀，取上清液0.8ml加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀。经10min～30min观察结果，出现稳定沉淀物为阳性。反之为阴性。 2.茚三酮法 甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，二氧化碳和相应的醛。而茚三酮则生成还原型茚三酮。反应过程中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。 (九)触酶试验培养基（Catalase） 用途 供链球菌及革兰阳性球菌的初步分群。 方法 1.玻片法 取18h~24h培养物，置于清洁玻片上，加1滴3%过氧化氢，如产生大量气泡为阳性。 2.试管法 取琼脂斜面（不含血液的）18h~24h培养物，接种于试管内，加入3%过氧化氢1ml，如果产生大量气泡为阳性。 质量控制 金黄色葡萄球菌ATCC 25923 阳性；无乳链球菌ATCC 13813 阴性。 (十)ß-半乳糖苷(ONPG)试验培养基 用途 供乳糖迟缓发酵菌和不发酵菌的鉴别。 配法 试剂(甲) 0.01mol/L pH7.0 Na2HPO4缓冲液100m1 试剂(乙) 蛋白胨 3g NaCl 1.5g 蒸馏水 300m1 pH 7.0 将甲、乙液分别置121℃灭菌15min，冷至40~50℃左右，乙液加入0NPG 0.6g，置56℃水浴中加热溶解，无菌过滤，将过滤液与甲液合并分装试管每管2m1，做无菌试验后备用。 将检标本接种培养基，35℃培养4h~18h。培养基呈黄色者为阳性，不变黄色为阴性。 质量控制 大肠埃希菌ATCC 2592