细胞论文：扑热息痛致小鼠肝细胞线粒体损伤机制的研究

华西药学杂志 W C J� P S � 2010, 25( 6)� 682~ 684 � � 基金项目:江苏省自然科学基金项目 (No. BK2009172) ;江苏省高校自然科学基金项目 ( No. 08KJB360011) ; 江苏省高校自然科学重大基础研究 项目 ( No. 07K JA18017) ;江苏省 333 !、 青蓝工程 !人才计划项目 作者简介:严丽芳,女,正攻读生药学专业的硕士学位。 * 通信作者 ( Corresponden t author) : Em ai:l xinhu itang@ s ina. com 扑热息痛致小鼠肝细胞线粒体损伤机制的研究 严丽芳 1, 2,汤新慧1* , 林 � 娜 2, 高 � 静 2,徐力致3,汤亚红 3 ( 1.盐城师范学院生命科学与技术学院,江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室, 江苏 盐城 224002; 2. 江苏大学药 学院, 江苏 镇江 212013; 3.南京大学医学院, 江苏 南京 210093) 摘要: 目的 � 研究扑热息痛 ( APAP )引起小鼠肝细胞线粒体损伤的机制。方法 � 小鼠分为对照组及 40、80、160、320 mg� kg- 1 APAP组, 腹腔注射 12 h后测定小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶 ( ALT )、天门冬氨酸氨基转移酶 ( AST )的活力和肝组织中谷胱 甘肽 ( GSH )的水平,测定肝细胞线粒体膜电位、肿胀敏感性及游离钙的含量。结果 � 与对照组相比, APAP组小鼠的血清中 ALT、AST的活性显著增高、肝组织中 GSH 的水平降低, 肝细胞线粒体的膜电位下降、肿胀敏感性下降, 同时检测到 80、160、 320 mg� kg- 1 APAP组小鼠肝细胞线粒体内钙离子超载。随剂量的增大, APAP对小鼠各指标的影响逐渐增加。结论 � 随着 APAP剂量增加,小鼠肝损伤加剧,线粒体损伤加重,可能与线粒体内钙超载导致线粒体的膜通透性转运孔高通透性开放有关。 关键词: 扑热息痛; 肝细胞线粒体损伤; 小鼠 中图分类号: R96� 文献标志码: A� � 文章编号: 1006- 0103( 2010) 06- 0682- 03 M echanism study on liverm itochondrial damage in APAP- in toxicited m ice YAN L i- fang 1, 2 , TANG X in- hu i 1 , L IN Na 2 , GAO Jing 2 , XU Li- zh i 3 , TANG Ya- hong 3 ( 1. J iangsu P rov incia lK ey Laboratory of CoastalW etland B ioresources and Environm entalP rotection, S chool of L if e Science and Technol� ogy, Yancheng Teachers Co llege, Yancheng, J iang su, 224002 P. R. Ch ina; 2. School of Pharm acy, J iang su University, Zhenjiang, J iang su, 212013 P. R. Ch ina; 3. School of M ed icine, N anjing Un ivers ity, Nanjing, J iangsu, 210093 P. R. China ) Abstrac t: OBJECTIVE� To study the m echan ism o f liver m ito chondrial dam age in APAP- intox ic ited m ice. METHODS� M ice w ere random ly div ided into the no rm al group, 40 m g� kg- 1, 80 mg� kg- 1, 160 mg� kg- 1, 320 m g� kg- 1 APAP groups. A lan ine am in� o transferase ( ALT ) and aspartate am ino transferase( AST ) ac tiv ities and level of liver g lutath ione ( GSH ) in m ice serum w ere detected after 12 h intraperitonea l in jection w ith APAP. M eanwh ile, the m itochondrial membrane po ten tia,l the sensitiv ity o f m itochondr ia l swe lling and m itochondria l ca lcium con tent were m easured. RESULTS� Com pared w ith the norm al group, the se rum ALT and AST activ ities and leve l o f live rGSH in APAP- tox ic itied m ice obv iously ra ised in APAP g roups. Them itochondr ia lmembrane po tential and sensitiv ity of m itochondr ial swe llingw ere reduced when trea ted w ith APAP. Intram itochondria lC a2+ over load occurred in the live r in 80 m g� kg- 1, 160 mg� kg- 1 and 320 m g� kg- 1 groups. The deg ree o f the above changes in APAP dam aged m ice was g radually increased w ith the increasing of concentration o fAPAP. CONCLU SION � The damage to liver m itochondria indicated that the suppression on m ito� chondrial membrane po ten tia l and sensitiv ity of m itochondr ia l sw e lling occurred in all APAP exposed g roups and increased g radually w ith the do se increas ing o f APAP. The m echan ism s underly ing the liverm itochondr ia l dam agem ay be re lated to the excessive open ing o fm itochondr ia l perm eability transition pore induced by in tram ito chondrial C a2+ ove rlo ad. K ey words: APAP; L iv erm ito chondrial dam age; M ice CLC num ber: R96� � � Docum ent code: A� � A rticle ID: 1006- 0103( 2010) 06- 0682- 03 � � 过量扑热息痛 (醋氨酚, APAP)肝损害累及的 多种细胞器中, 线粒体损伤是其中最关键的环 节 [ 1]。线粒体除通过氧化磷酸化产生 ATP为机体 提供能量外, 还参与调节细胞内钙自稳平衡、调节 pH等,尤其在调控细胞生存和死亡中起决定性作 用 [ 2]。因此, 作者建立了 APAP肝损伤模型,检测小 鼠血清丙氨酸氨基转移酶 ( ALT )、天门冬氨酸氨基 转移酶 ( AST)活力及肝组织中谷胱甘肽 ( GSH )水 平, 测定肝细胞线粒体膜电位、线粒体肿胀敏感性的 变化,同时,检测线粒体内游离钙的浓度,旨在探讨 APAP引起的小鼠肝细胞线粒体损伤的毒理机制。 1� 实验部分 1�1� 动物、试药与仪器 ICR∀ 小鼠 [南京医科大学实验动物中心, 动物 许可证号: SCXK (苏 ) 2002- 0031] ,体重 18~ 22 g。 扑热息痛 (APAP, S igm a- A ldr ich公司 ); T ris- HC l、 Hepes( Promega公司 ); 甘露醇、蔗糖、鱼藤酮、琥珀 酸、罗丹明 ( Rh123)、Fura- 2 /AM ( S igma公司 ); 丙 氨酸氨基转移酶 ( ALT )、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、谷胱甘肽 ( GSH )、考马斯亮蓝测定蛋白试剂 盒 (南京建成生物工程研究所 ); 其余试剂为分析 纯。850型荧光分光光度计 (日本日立 )。 1. 2� 方法与结果 1. 2. 1� 动物分组与染毒 � 将 40只 ICR小鼠, 随机 均分为正常对照组和 40、80、160、320 mg� kg- 1 APAP组。正常对照组小鼠按 0. 01 mL� g- 1体重 ip 生理盐水, APAP各组按相同剂量分别 ip相应浓度 的 APAP;同时小鼠禁食不禁水, 12 h后, 摘取眼球 取血,测定小鼠血清中 ALT、AST的活力。颈椎脱臼 处死小鼠,取部分肝组织制备肝细胞线粒体,测定线 粒体膜电位、线粒体对钙诱发肿胀的敏感性以及线 粒体内钙离子浓度。其余肝组织匀浆,测定 GSH水 平。肝匀浆及肝细胞线粒体蛋白浓度采用考马氏亮 蓝法测定。 1. 2. 2� 生化指标的测定 � 各组小鼠所取全血, 在 4 # 静置 2 h, 3 ∃ 103 r�m in- 1离心 20m in,分离后得 到血清。于分光光度计上测定小鼠血清中 ALT、 AST的活性及肝组织中 GSH 的水平。与正常小鼠 相比, 各剂量组小鼠血清中 AST的活性显著升高, 80、160、320mg� kg- 1 APAP组小鼠血清中 ALT的活 性高于正常小鼠,且随药物剂量的增大,酶活性升高 (P < 0. 05)。 80、160、320 mg� kg- 1 APAP损伤组小 鼠肝组织中 GSH的水平均显著减少 ( P < 0�05) ,表 明随药物剂量的增加, APAP诱导的小鼠肝组织中 GSH的耗竭增加,肝细胞损伤加剧 (表 1)。 表 1� 小鼠血清中 AST、ALT的活性及肝组织 GSH的水平 ( x % s, n= 8) Table 1� Serum AST and ALT activities and GSH levels o f liver tissue in m ice( x % s, n= 8) Groups Dose / m g� kg- 1 ALT activity /U�L - 1 AST activity /U� L- 1 GSH level/nm ol� mg- 1 Norm al 29. 3 % 6. 3 60. 71 % 9. 66 258. 3 % 27. 8 APAP 40 60. 2 % 18. 0 123. 7 % 21. 5* 224. 6 % 22. 0 80 145. 8 % 20. 5* 205. 1 % 21. 3* 190. 0 % 40. 1* 160 223. 7 % 36. 9* 261. 3 % 24. 3* 168. 0 % 33. 7* 320 241. 3 % 34. 1* 325. 7 % 33. 0* 163. 0 % 20. 7* C ompared w ith norm algroup: * P < 0. 01 1. 2. 3� 肝细胞线粒体的制备 � 按 A pprille法 [ 3] ,取 各组小鼠肝脏,在预冷的分离液 ( 225mmol� L- 1甘露 醇、75 mmo l� L- 1蔗糖、0. 05 mmo l� L- 1 EDTA、10 mmo l� L- 1 Tris- HC ,l pH 7. 4)中剪碎, 洗净,冰浴匀 浆, 600 r�m in- 1离心 5m in,取上清液,于 4 # 、8. 8 ∃ 10 3 r�m in- 1离心 10 m in,弃上清液, 沉淀用 4 # 分离 液洗 3次,所得沉淀即为纯化的线粒体。 1. 2. 4� 肝细胞线粒体膜电位的测定 � 按 Emaus 法 [ 4] , 使用荧光染料 Rh123作为线粒体膜电位的标 记物,测定线粒体的膜电位。Rh123为一种阳离子 亲脂性荧光染料,依赖于线粒体的跨膜电位,特异性 地结合于线粒体内膜,当线粒体膜电位下降时,储积 在线粒体内的 Rh123将释放出来, 引起测试体系中 Rh123荧光强度升高,反之,荧光强度降低。测定时 各处理组小鼠线粒体按 0. 5 mg�m l- 1重悬于测定缓 冲液 (含 225 mmo l� L- 1甘露醇、70 mmo l� L- 1蔗糖、5 mmo l�L- 1H epes, pH7. 2)中,在 25 # 下,分别与 0. 3 mol� L- 1 Rh123共孵 3 m in后, 选取激发波长 505 nm、发射波长 534 nm,用荧光分光光度计,测定各组 线粒体悬液的荧光强度。测定体系的荧光强度越 高,表明线粒体膜电位越低。正常小鼠的线粒体的 荧光强度为 140. 7 % 10. 1, 40、80、160、320 mg� kg- 1 APAP组小鼠线粒体的荧光强度显著增加, 分别为 158. 2 % 18. 9、202. 2 % 14. 3、210. 4 % 19. 6、230. 9 % 21. 3, APAP在 80~ 160 mg� kg- 1范围内, 随浓度增 加, 线粒体膜电位值下降越明显 (P < 0. 05 ), 但 40 mg� kg- 1APAP组小鼠肝细胞线粒体的荧光强度与 正常小鼠无显著差异。 1. 2. 5� 线粒体肿胀敏感性的测定 � 线粒体肿胀程 度依据线粒体悬液在 540 nm处的吸光度来评价 [ 5]。 各组肝细胞线粒体按 1. 0 mg�mL- 1重悬于测定缓冲 液 ( 125 mmo l� L- 1蔗糖、50 mmo l� L- 1 KC l、2 mmo l� L - 1 KH2 PO 4、5mmo l� L- 1琥珀酸、5mo l� L- 1鱼藤酮、 10mmo l� L- 1 Hepes, pH 7. 4)中, 于 30 # 下,在线粒 体悬液中加不同浓度的氯化钙溶液, 测定各线粒体 加氯化钙后 0~ 5 m in的吸光度。计算线粒体 A 540的 减少值 �A, 绘制线粒体肿胀曲线, �A越大,表明线 粒体肿胀越严重。由图 1可看出: 正常组及不同浓 度 APAP组小鼠的肝细胞线粒体均可受高钙诱发产 生明显的肿胀,且均随钙浓度增加肿胀程度加大,但 各组小鼠肝细胞线粒体受高钙诱发产生肿胀的程度 明显低于正常肝脏线粒体。提示 APAP各组小鼠肝 细胞线粒体本身已经处于损伤状态, 对钙离子的缓 冲能力降低, 对钙产生肿胀的敏感性下降, 且随着 APAP剂量增加, 受高钙诱发产生的肿胀程度减少 越多,线粒体敏感性下降越显著, 即肝细胞线粒体损 伤程度加重。 1. 2. 6� 肝细胞线粒体内游离钙的测定 � 用钙离子 荧光指示剂 Fura- 2 /AM测定线粒体内游离钙的浓 度 [ 6]。设定激发波长为 340 nm, 发射波长为 510 nm,采用荧光分光光度计测定荧光强度 ( F )。测定 时各处理组小鼠的线粒体按 0. 5mg�mL- 1悬浮在测 683第 6期 严丽芳, 等。扑热息痛致小鼠肝细胞线粒体损伤机制的研究 � � � 图 1� 高钙诱发的小鼠肝细胞线粒体肿胀的曲线 F ig 1� Curves of Ca2+ - induced liverm itochondria l swelling inm ice 定缓冲液 (包括 125 mmo l� L- 1蔗糖、65 mmo l� L- 1 KC l、5 mmo l� L- 1 Hepes、1 mo l� L- 1 Fura- 2 /AM, pH7. 4)中,于 30 # 恒温下孵育 30m in, 然后用不含 荧光指示剂的悬液荡洗 2次, 去除多余的 Fura- 2/ AM, 最后调整线粒体悬液为 0. 5 mg�mL- 1。向负载 了 Fura- 2 /AM的各组线粒体悬液中加入 0. 4% Triton X- 100、5mmo l� L- 1 CaC l2后, 测定最大荧光 强度 ( Fm ax ), 在 Fm ax的基础上加入 10 mmo l� L- 1 EGTA后,测定的为最小荧光强度 (Fm in )。计算线粒 体内游离钙浓度, Kd (F - Fm in ) / ( Fmax - F ) ; Kd = 224 nmo l� L- 1, 为 Fura- 2与 Ca2+ 的解离常数 [ 6 ]。 肝细胞线粒体内游离钙浓度的测定结果见表 2。正 常小鼠肝细胞线粒体内游离钙浓度为 106. 2 % 13. 1 nmo l�L- 1,经 80、160、320 mg� kg- 1 APAP处理小鼠 的肝细胞后,线粒体内游离钙浓度分别升高达正常 小鼠的 1. 7、2. 5、2. 6倍, 40 mg� kg- 1 APAP组线粒 体内游离钙浓度升高达 1. 3倍, 但无统计学意义。 表明在一定剂量范围内,随着 APAP浓度增加, 线粒 体内游离钙超载越严重。 表 2� APAP对小鼠肝细胞线粒体内游离钙浓度的影响 ( x % s, n= 8) Table 2� Effects of APAP on the free Ca2+ content in liver m ito� chondria( x % s, n= 8) G roups Dose/mg� kg- 1 Ca2+ con tent /nmo l� L- 1 Norm al - 106. 2 % 13. 1 APAP 40 134. 0 % 30. 4 80 175. 2 % 25. 9* 160 264. 1 % 36. 8* 320 278. 0 % 38. 9* C om pared w ith norm al group: * P < 0. 01 1. 2. 7� 统计方法 � 进行单因素方差分析 ( ANO� VA ), 组间差异采用 SNK - q检验进行比较。 2� 讨论 APAP损伤组小鼠血清中 ALT及 AST的活性呈 剂量依赖性上升,肝组织中 GSH的水平剂量依赖性 下降,表明随着药物剂量加大, GSH的耗竭加剧, 肝 细胞损伤加剧,因此, APAP造成的小鼠肝损伤伴随 着肝细胞线粒体的损伤, 且损伤程度随着剂量增大 而加剧。随着 APAP剂量增加, 检测的线粒体体系 荧光强度增加值逐渐升高, 小鼠肝细胞线粒体膜电 位耗散越严重,表明线粒体损伤的加剧。高钙诱发 的线粒体肿胀模型可用于线粒体活性的检测。研究 发现: APAP导致小鼠肝细胞线粒体对高钙产生肿 胀的程度下降,即线粒体肿胀敏感性下降,且随剂量 的增加,细胞线粒体肿胀敏感性下降程度加大,即线 粒体损伤加剧。 进一步检测各组小鼠肝细胞线粒体内钙离子的 浓度,发现正常小鼠肝细胞线粒体内游离钙离子浓 度处于较低水平, 而 APAP组小鼠肝细胞线粒体内 钙显著超载。随着 APAP剂量增加, 肝细胞线粒体 钙超载程度加大, 表明 APAP对肝细胞线粒体损伤 过程中同时伴随着线粒体游离钙超载。作者推测: APAP引发小鼠肝细胞线粒体内 Ca2 +超载, 而线粒 体内过多的 Ca2 +将激活线粒体 PTP, 触发 PTP的高 通透性开放,导致线粒体膜电位耗散、线粒体肿胀敏 感性下降,细胞能量耗竭;同时, 线粒体 Ca2 +大量释 放, 可导致多种蛋白水解酶和磷脂酶激活,使细胞膜 崩解,细胞坏死,最终导致细胞凋亡或坏死。 参考文献: [ 1] � 顾兴丽, 孙继红, 季晖. 扑热息痛肝损伤机制研究进展 [ J ]. 中国临床药理学与治疗学, 2009, 14 ( 5) : 596- 600. 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