CHINESEJOURNALOFCLINICALANATOMYVOL.25NO.52007
【收稿日期】2006-11-26
【基金项目】大理学院科研基金资助课
(2004×12)
【作者简介】张本斯(1969-),女,云南大理人,硕士,副教授,主要从
事干细胞研究,Tel:(0872)2257147,E-mail:ben-si-zhang@163.com
定向诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化
张本斯 1, 李正金 2, 邹汝荣 1, 王 凡 3, 李瑞祥 3
(1.大理学院基础医学院人体解剖学教研室,大理 671000; 2.大理学院附属医院病理科,大理 671000;
3.四川大学基础医学与法医学院人体解剖学教研室,成都 610041)
【摘要】目的:采用骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方
法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,5-氮杂胞苷诱导 24h后正常培养,通过形态学、PAS反应、磷钨酸
苏木素染色(PTAH)、免疫细胞化学染色作鉴定。结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单
个核、卵圆形、居中,似心肌细胞,PAS及 PTAH染色均为阳性。诱导后培养 2周的细胞
达 Sarcomeric
Actin和Connexin-43较弱,以后表达逐渐增强,而且1、3、5代细胞均稳定表达。结论:骨髓MSCs可在体
外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料。
【关键词】间充质干细胞; 心肌细胞; 分化; 5-氮杂胞苷
【中图分类号】Q813.5 【文献标识码】A 【文章编号】1001-165X(2007)05-0550-03
Inductionanddifferentiationofratmarrow-derivedmesenchymalstemcellsintocadiocytesinvitro
ZHANGBen-si,LIZheng-jin,ZOURu-rong,etal.
DepartmentofAnatomy,FacultyofPreclinicalMedicine,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China
【Abstract】Objective:Todifferentiateratmarrow-derivedmesenchymalstemcells(MSCs)tocadiocytes
invitroviatheinductionof5-azacytidineandprovidefoundationforservingMSCsasanewstemcellsourceto
treatheartfailure.Methods:RatMSCswereisolatedandcultured.Afterinducedwith5-azacytidinefor24
hoursandthennormalcultured,cellswereidentifiedbymorphology,periodic-acid-schiffreaction(PAS),
phosphotungsticacidhematoxylin(PTAH)andimmunocytochemistry.Results:MostMSCsinducedgradually
becamespindle-likeandpillar-formwithovalnucleilyinginthecenterofcellsandsimilartocadiocytes,and
beingofpositivereactioninPASandPTAH.Inaddition,morethan2weeksofcultivation,positivestainingof
SarcomericActinandConnexin-43wereobservedonthosecells,andthesameexpressionswereonP1,P3and
P5cells.Conclusions:MSCscanbeinducedintocadiocytesby5-azacytidineinvitro,whichsuggeststhatit
mightbeidealdonorcellsinstemcelltransplantationforheartfailuretherapy.
【Keywords】mesenchymalstemcells; cadiocyte;differentiation;5-azacytidine
骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (mesenchymalstemcells,
MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞,在一定条件
下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等转
化[1],将 MSCs培养诱导为上述目的细胞,进行相应组
织器官修复有着非常诱人的临床应用前景,故 MSCs
是近年倍受瞩目的组织工程种子细胞。一般认为,出生
后心肌细胞不能再生,损伤后由疤痕替代,导致心肌收
缩紊乱,最后发展为充血性心衰。Wakitani[2]首先报道
MSCs能在一定的条件下向肌细胞转化,使肌修复成为
可能。以后Orlic等[3,4]也证实MSCs可分化成心肌样细
胞,为MSCs在心脏疾病的运用奠定了基础。本实验将
MSCs在5-氮杂胞苷诱导下转化为心肌样细胞,为损
伤心肌的干细胞移植治疗提供基础。
1 材料与
1.1 材料
Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),5-氮杂胞苷、胰蛋白
酶(Sigma),L-DMEM(GIBCO)。小鼠抗人、大鼠、兔 Sarcomeric
Actin, 兔 抗 人 、 大 鼠 、 小 鼠 Connexin43( 博 士 德 );
HISTOSTAINTM-KIT免疫组化试剂盒(中山公司);SD大鼠(本
校动物中心)。
1.2 方法
1.2.1 骨髓 MSCs的分离培养 处死 6周龄 SD大鼠,冲出股骨
胫骨骨髓制成细胞悬液。洗涤1次(1000r/min,离心5min)。将悬
液加入预置等体积淋巴细胞分离液(比重 1.077g/ml)的离心管,
2000r/min,离心30min。收集云雾状白膜层的单个核细胞,洗涤
2次,L-DMEM(含 10%新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml
链霉素)重悬。1×105/ml接种,37℃、5%CO2孵箱培养,5d首次换
液,以后2~3d一次。待细胞接近融合,胰酶消化,1×104/ml传代,
并标记为 Passage1(P1)。细胞接近融合时,重复上述操作,反复
传代扩增,并标记为 P2~P5等。根据贴壁性能不同,每次换液弃
除悬浮生长的造血系细胞,每次传代用 0.25%胰酶(0.1ml/cm2)消
化2~3min,控制好酶的量和消化时间,将MSCs与可能混杂的淋
巴细胞、单核细胞分开,纯化MSCs。
1.2.2 骨髓 MSCs向心肌样细胞的诱导 以 1×104/ml接种传
代细胞于预置盖玻片的24孔板,第4d向诱导组加入5-氮杂胞
·实验研究·
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中国临床解剖学杂志 2007年第 25卷第 5期
表 1 对照组与诱导组细胞 SarcomericActin免疫
细胞化学染色结果平均灰度值(x±s,n=5)
Tab.1 Mean density of immunocytochemical
stainingofSarcomericActininbothofcontroland
inducedgroups(Mean±SD,n=5)
Group 1week 2weeks 3weeks 4week
Controlcells 168.88±1.65168.35±1.21 168.62±1.61 168.56±0.85
Inducedcells167.83±2.12164.91±1.32*161.05±2.75*160.87±1.93*
*P<0.05,vsControlgroup
表2 对照组与诱导组细胞 Connexin-43免疫细
胞化学染色结果平均灰度值(x±s,n=5)
Tab.2 Meandensityofimmunocytochemical
stainingofConnecxin-43inbothofcontroland
inducedgroups(Mean±SD,n=5)
Group 1week 2weeks 3weeks 4week
Controlcells 168.36±1.71168.52±1.08 168.27±1.52 168.68±0.92
Inducedcells167.94±2.33164.72±1.12*161.21±2.45*161.02±2.25*
*P<0.05,vsControlgroup
表3 不同代骨髓MSCs免疫细胞化学染色结果
的平均灰度值(x±s,n=5)
Tab.3 Meandensityofimmunocytochemistrical
analysisindifferentpassageofmarrow-derived
MSCs(Mean±SD,n=5)
Antigen Passage1 Passage3 Passage5
SarcomericActin 162.32±2.77 161.05±2.75 162.87±3.52
Connexin-43 160.98±2.76 161.21±2.45 161.15±2.81
*P<0.05,vsControlgroup
苷(终浓度为 10×10-6mol/L),诱导 24h后正常培养不同时间作
鉴定。
1.2.3 诱导后骨髓 MSCs的鉴定 (1)PAS反应:诱导后培养 4
周,取出细胞爬片,95%乙醇固定,过碘酸氧化,Schiff试剂浸染,
亚硫酸液冲洗,甲基绿复染。(2)PTAH染色:诱导后培养 4周取
出,95%乙醇固定,高锰酸钾氧化,草酸漂白,磷钨酸苏木素浸染。
(3)免疫细胞化学染色:① 诱导后培养不同时间 MSCs的免疫细
胞化学染色,于培养 1、2、3、4周取出细胞爬片,冷丙酮固定,
Triton-X100破膜,过氧化氢处理,血清封闭,加一抗(Sarcomeric
Actin、Connexin-43),37℃孵育 2h,加生物素化二抗,加碱磷酶标
记的链酶卵白素,碱磷酶的底物-色素混合液显色,同时用 PBS
作为一抗设置阴性对照。对染色结果作图像
,测定平均灰度
值(IPP图像分析软件,USA)。② 诱导后不同代 MSCs的免疫细
胞化学染色,取诱导后培养 4周的 1、3、5代细胞按方法①作
SarcomericActin、Connexin-43的免疫细胞化学染色。
1.2.4 统计学处理 采用 SPSS软件,多均数比较用单因素方差
分析,两均数比较用t检验。
2 结果
2.1 倒置显微镜观察
培养 2d,细胞逐渐贴壁,5d首次换液,可见多个
细胞克隆。1周后,增殖迅速,约10~14d接近融合。传
代初期细胞呈球形,很快沉降贴壁,伸展为多角形,并
逐渐变成梭形、三角形,胞质丰富,核明显,呈卵圆形。
3~5d增殖迅速,约7d长满瓶底。造血系细胞因不贴
壁,随换液除去。严格控制酶的量和作用时间,传代所
用酶不能使紧贴瓶壁的淋巴细胞、单核细胞脱落,2次
传代后细胞达融合生长时,有更均匀有序的成纤维细
胞样分布。连续传 5代,形态无明显变化,传代周期
6~7d,说明MSCs得到了进一步纯化。5-氮杂胞苷作用
后,细胞增殖减慢,部分脱落死亡,存活细胞形态发生
改变,以梭形、柱形为主,部分细胞有分支,并逐渐互相
连接,核一个,卵圆形,居中,似心肌细胞形态。
2.2 PAS反应
诱导细胞胞浆呈红色,以核周围更明显(图 1),对
照组为阴性。
2.3 PTAH染色
诱导细胞胞浆呈紫蓝色,核呈深蓝色(图2)。对照
组为阴性。
2.4 免疫细胞化学鉴定
诱 导 后 培 养 3、4周 ,SarcomericActin及
Connexin-43为阳性,2周为弱阳性,阳性细胞胞浆呈蓝
色(图 3,4)。诱导后培养1周以及未诱导细胞为阴性。
阴性对照组未着色,说明各结果均有特异性。随诱导后
培养时间延长,平均灰度值逐渐减少(表1、2),其中
3、4周间的差异无统计学意义。对照组灰度值随时间变
化不大,也无一定规律。除1周外,2、3、4周两组平均灰
度值间的差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.5 诱导后不同代细胞的免疫细胞化学鉴定
3代细胞均表达 SarcomericActin和 Connexin-43,
平均灰度值高低不一,但差异无统计学意义(表3)。
3 讨论
3.1 骨髓MSCs向心肌样细胞的分化
本实验分离培养骨髓 MSCs,经 5-氮杂胞苷诱导
后正常培养,细胞形态发生明显改变,以梭形、柱形为
主,部分细胞有分支,并逐渐互相连接,单核,卵圆形,
居中,说明诱导细胞具有心肌细胞的形态特征。
SarcomericActin是构成肌原纤维中细肌丝的主要
蛋白,存在于心肌和骨骼肌,Connexin-43只存在于心
肌。心肌细胞间通过特定的缝隙连接偶联在一起,在电
反应中形成整体。这些缝隙连接就是Connexin-43的六
聚物,这是心肌细胞的特征。本研究表明经5-氮杂胞苷
诱导,骨髓MSCs已向心肌样细胞分化,而且细胞间已
有 Connexin-43连接,这对于细胞间信号传递,心肌功
能的保持非常重要。另外,诱导细胞PAS、PTAH反应均
为阳性,说明诱导细胞富含糖原和肌原纤维,这都是心
肌细胞的特点,进一步表明骨髓MSCs已向心肌样细胞
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图 1 诱 导 后 培 养 4周
PAS反应 ×200 图 2 诱
导后培养 4周 PTAH染色
阳性 ×400 图 3 诱导后
培养 3周 SarcomericActin
免疫细胞化学染色阳性 ×
400 图 4 诱导后培养 3
周 Connexin-43免疫细胞
化学染色阳性 ×400
Fig.1 Positivereactionof
PAS in induced cells
culturedfor4weeks.×200
Fig.2 Positiveexpression
ofPTAH ininducedcells
culturedfor4weeks.×400
Fig.3 Positiveexpression
ofimmunocytochemistryfor
SarcomericActinininduced
cellsculturedfor3weeks.×
400
Fig.4 Positiveexpression
ofimmunocytochemistryfor
Cnnexin-43ininducedcells
culturedfor3weeks.×400
分化。
1、3、5代细胞诱导后培养 3周,SarcomericActin
和Connexin-43均为阳性,三代细胞平均灰度值不同,
表明SarcomericActin和Connexin-43在不同代细胞的
表达有一定差异,但三代细胞间的差异无统计学意义,
说明本实验条件下,细胞稳定表达 SarcomericActin和
Connexin-43,稳定地向心肌样细胞分化。
3.2 5-氮杂胞苷促进MSCs向心肌样细胞分化的机制
5-氮杂胞苷是胞苷类似物,为DNA甲基转移酶抑
制剂,当其作用于 MSCs时能整合进入 DNA中,通过
抑制DNA甲基转移酶使DNA低甲基化,而DNA的甲
基化程度和基因调节密切相关[5]。MSCs具有多能干细
胞的特点,并含有完整的遗传物质,在一定条件下可能
表达不同体细胞特异性蛋白,分化为不同体细胞。
Boheler等[6]通过研究5-氮杂胞苷诱导小鼠胚胎细胞系
C3H10T1/2向肌细胞转化认为,其机制可能与激活肌
源性基因 MyoD1有关。本实验表明 5-氮杂胞苷诱导
24h后正常培养,细胞形态改变,表达心肌特异性蛋白
SarcomericActin和 Connexin-43,合成糖原和肌原纤
维,具有心肌细胞的特征。5-氮杂胞苷诱导MSCs心肌
化,可能是它和控制向心肌分化的特异启动子基因上
阻遏蛋白结合,使其去甲基化而发生构型改变,从而启
动细胞向心肌分化,使 MSCs转变成心肌细胞[7]。如果
能发现该启动子上的阻遏蛋白,选出高特异性的去阻
遏剂诱导干细胞,将会提高体外分化心肌细胞的效率,
为建立自体心肌细胞库提供可能。本研究还发现,5-氮
杂 胞 苷 对 MSCs的 持 续 诱 导 并 不 能 明 显 增 加
SarcomericActin和Connexin-43的表达,以终浓度10×
10-6mol/L5-氮杂胞苷诱导72h,部分细胞脱落死亡,提
示 5-氮 杂 胞 苷 对 MSCs的 SarcomericActin和
Connexin-43基因在转录后无明显的调控作用。
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