人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

中国生物工程杂志 　China B iotechnology, 2009, 29 (6) : 20～24 人白细胞介素 11的定点聚乙二醇修饰 3 李智华 　胡满仓　阎玲梅 　赵玉娇 　杨 　旭 　彭正华 　徐维明 　李健峰 33 (中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所　昆明　650118) 摘要 　利用 h IL211无 Cys残基这一特点 ,通过定点突变将一个 Cys残基引入 h IL211的 N末端。 然后 ,利用与 Cys巯基特异性反应的 mPEG2马来酰亚胺将 mPEG偶联到预先选定的位点 ,经层析 纯化得到 h IL211的定点 PEG修饰物。利用依赖型细胞株 7TD1测定其生物学活性 ,结果表明 ,其 体外生物学活性保持原有 h IL211活性的 30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造 h IL211, 提高其药效的应用研究打下基础。 关键词 　人白细胞介素 11　聚乙二醇 　化学修饰 中图分类号　Q789 收稿日期 : 2009202216　　修回日期 : 20092032103 云南省自然科学基金资助项目 (2005C0062M)33 通讯作者 ,电子信箱 : lijianfeng73@gmail. com 　　人白细胞介素 11 ( human interleukin211, h IL211)是 一种多功能的细胞因子 ,最基本的功能在于造血调控 , 它能刺激人的造血祖细胞和巨核细胞前体的分化并诱 导巨核细胞的生成和成熟 ,最终导致血小板数量的增 加。重组 h IL211于 1998年被美国 FDA正式批准上市 , 成为治疗血小板减少症的唯一药物 ,此外 ,对其它适应 症如肿瘤化疗引起的口腔粘膜炎、节段性回肠炎也具 有较好的临床应用价值 [ 1 ]。 　　尽管 h IL211药效较为明确 ,但 h IL211临床作用于 人体的有效剂量远高于其它一些用于临床治疗的重组 细胞因子药物 ,且需连续多次给药 ,大剂量应用易于引 起体内免疫原性 ,致使其体内生物学活性明显降低 ; h IL211蛋白分子量较小 ,蛋白分子中富含精氨酸等残 基 ,其等电点较高 (p I≥11)等分子特性 ,使其体内半衰 期较短 ,限制了其在临床上的广泛应用 [ 2, 3 ]。聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)修饰是解决上述问题的一种 有效途径 ,通过 PEG修饰可以克服多肽和蛋白质类药 物应用中的不足 ,它将 PEG衍生物修饰剂通过化学反 应 ,共价结合到多肽或蛋白质类药物的分子上 , PEG修 饰后的蛋白质或多肽类药物能降低免疫原性及抗原 性 ,延长其体内循环半衰期 ,并增强其在体内的生物学 活性。目前已有如 PEG化 G2CSF、PEG化干扰素等数 种 PEG修饰蛋白药物被批准上市 [ 4, 5 ]。 　　本研究在不影响 h IL211生物学活性的前提下 ,对 h IL211的 N末端进行了定点突变 ,将突变体在原核中 实现高效分泌表达并纯化 ,随之用分子量为 20kDa的 mPEG2马来酰亚胺 (mPEG2maleim ide)进行定点修饰 ,对 修饰产物进行分离纯化 , 期望获得体外活性保留较高、 半衰期延长的 PEG化 rh IL211产物 ,并为其药代动力学 和药效学性质等的进一步研究奠定基础。 1　材 　料 　　h IL211基因、pThioH isA 质粒、E. coli DH5α、Top10 菌株、7TD21依赖细胞株由本研究室保存 , pMD182T载 体及各种工具酶购自 TaKaRa公司 , Chelating Sepharose FF、CM Sepharose FF、Superdex 75 层 析 介 质 购 自 Amersham Pharmacia 公司 , mPEG2马来酰亚胺 (M r: 20kDa)购自北京凯正生物制品有限公司 ,牛肠激酶、 rh IL26为本实验室表达纯化提供 , h IL211标准品由中国 药品生物制品检定所提供。 2　方法 2. 1　hIL 211突变体 G1C基因的克隆及表达载体的构建 　　以含 h IL211基因的质粒为 ,突变的 PCR 引物 ,将编码 N末端甘氨酸 ( Gly)的密码子 GGG突变 为编码半胱氨酸 ( Cys)的 TGC,命名为 hIL 2112G1C ,并 在引物中分别引入 B am H I、EcoR I酶切位点 ,上游引物 2009, 29 (6) 李智华 等 : 人白细胞介素 11的定点聚乙二醇修饰 P1: CGGGATCCGGTGATGACGATGACAAGTGCCCACCA CCTGGCCCCCCTCGAG,下游引物 P2: CGGAATTC TTA CAGCCGAGTCTTCAGCAG,由上海 Invitrogen生物技术 有限公司合成。PCR扩增片段连接到 pMD182T载体 , 用 B am HⅠ、EcoRⅠ双酶切 ,与同样双酶切的 pThioH isA 载体连接 ,转化 E. coli DH5α,筛选重组子 ,测序确认 , 获得表达质粒 pThioH isA2hIL 2112G1C。 2. 2　摸索表达条件 　　将构建好的含突变体基因的质粒分别转化工程菌 株 Top10,挑克隆于含 50μg /m l氨苄青霉素的 LB液体 培养基中 , 37℃摇床培养过夜 ,以 1%接种量接种到 5 m l LB培养基中 ,当细菌培养 OD600值在 0. 4～0. 6之间 时加终浓度为 100μg/L IPTG诱导表达 6 h,取培养物 1 m l,离心收集菌体 , SDS2PAGE检测目的蛋白表达情况 , 对不同诱导时间、温度、诱导时初始菌体浓度、诱导剂 浓度等表达条件进行优化 ,筛选高效表达重组蛋白的 工程菌株 ,并据此进行发酵扩大培养。 2. 3　重组蛋白纯化 　　发酵液离心收集菌体 ,按 6 m l/g菌体 ( v /w)将菌 体重悬于 A 液 ( 20 mmol/L PB, 200 mmol/L NaCl, pH 8. 0)中 ,高压匀浆破菌 , 10000 r/m in离心 30 m in,收集 上 清 液。用 50 mmol/L EDTA 预 处 理 Chelating Sepharose FF亲和层析柱 ,然后 50 mmol/L N iSO4 螯合 N i2 +离子 ,用 A液平衡 ,将含融合蛋白的上清液上样 , B 液 (A液中加入 100 mmol/L咪唑 )梯度洗脱 ,收集洗脱 峰 , SDS2PAGE鉴定。取亲和层析后的纯化产物 ,加入 1: 500 (V /V )肠激酶 ( enterokinase, EK) 16℃酶切 12h。 CM Sepharose FF离子交换层析柱用 20 mmol/L PB pH 7. 4的溶液 C平衡后 ,将酶切后的样品上样 , D液 ( C液 中加入 500 mmol/L NaCl)进行梯度洗脱 ,收集洗脱峰 SDS2PAGE鉴定。经离子交换收集的目的峰进一步上 样 Superdex 75分子筛层析 , 20 mmol/L PB pH 7. 8缓冲 液洗脱 ,收集洗脱峰 SDS2PAGE鉴定 , Lowry法测定蛋 白含量。 2. 4　PEG修饰及修饰产物的纯化 　　将纯化的 rh IL2112G1C 蛋白与分子量 20kDa 的 mPEG2马来酰亚胺按摩尔比 1 /5的比例混合 ,反应在 100 mmol/L 磷酸钠缓冲液 ( pH 6. 8, 含 1 mmol/L EDTA )中进行 ,置室温 (约 25℃)反应 4 h,反应混合物 用 E液 (20 mmol/L PB缓冲液 pH 6. 8)稀释 ,上样同样 缓冲液平衡的 CM Sepharose离子交换柱 ,经 F液 ( 20 mmol/L PB缓冲液 + 500 mmol/L NaCl, pH 6. 8)梯度洗 脱 ,收集洗脱峰 , SDS2PAGE 鉴定 , Lowry法测定蛋白 含量。 2. 5　体外生物学活性测定 　　用 IL26依赖的小鼠杂交瘤细胞株 7TD1测定 h IL2 112G1C及 PEG2h IL2112G1C的生物学活性 , 7TD1细胞 用含 2 ng /m l IL26、20%小牛血清的 PM I21640培养液 , 37℃ 5% CO2 条件下培养 ,至对数生长期用未添加 IL26 的培养液洗涤 3次 ,并将细胞稀释到 6 ×104 /m l,加入 不同稀释度的 IL211标准品对照 (比活性为 8. 0 ×106 IU /mg)及待检品培养 , MTT法检测样品的细胞生物学 活性 [ 6 ]。 3　结 　果 3. 1　h IL 211突变体 G1C基因的克隆及表达载体的构建 　　设计引物 ,将编码 h IL211 N末端 Gly的密码子突 变为 Cys, PCR扩增得到与预期相符的 564bp片段 (图 1) ,将其用 B am HⅠ、EcoRⅠ双酶切 ,与同样双酶切的 pThioH isA载体连接 ,构建 pThioH isA2hIL 2112G1C 表达 质粒 ,测序结果与设计一致。 图 1　h IL 2112G1C基因 PCR扩增产物凝胶电泳分析 F ig. 1　Ana lysis of PCR am plif ied h IL 2112G1C gene M: DNA molecular standard DL22000; 1: PCR p roduct of hIL 2112G1C 3. 2　摸索表达条件 　　摸索优化表达条件时发现 h IL2112G1C蛋白在大肠 杆菌 TOP10感受态细胞中表达量高 ,在 BL21G中略有 表达 ,在 DH5α中几乎不表达。其中 TOP10工程菌最 适宜目的蛋白表达的条件为初始接种浓度 OD600nm为 0. 6, IPTG诱导浓度 100μg /m l , 37℃下诱导 6h (图 2)。 经凝胶扫描分子量约为 32kDa,表达量为 25%。 3. 3　重组蛋白纯化 　　菌体破菌后 ,融合蛋白主要表达在上清液中 ,将上 清液经 Chelating Sepharose亲和层析纯化后 ,用肠激酶 酶切去融合头 (图 3a) ,再经 CM Sepharose离子交换层 析 (图 3b)及 Superdex 75分子筛层析 ,约 20kDa处得到 12 中国生物工程杂志 China B iotechnology Vol. 29 No. 6 2009 单一蛋白条带 ,如图 3c所示。 3. 4　PEG修饰及修饰产物的纯化 　　通过控制反应体系的 pH 值、反应物间的计量关 系、反应时间、反应温度等条件 ,确定了最适修饰反应 条件为 :突变的 h IL2112G1C蛋白和 20kDa的 mPEG2马 来酰亚胺的摩尔比为 1 /5, pH 6. 8的磷酸钠缓冲液中置 室温 (约 25℃)反应 4h。反应混合物稀释后上样 CM Sepharose离子交换柱层析 ,纯化去除了 PEG和未修饰 蛋白 ,得到均一的 PEG2h IL2112G1C修饰产物 ,表观分 子量在 50kDa左右 ,如图 4所示。 3. 5　体外细胞生物活性测定 　　活性测定结果显示 ,突变的 h IL2112G1C细胞生物 图 4　 IL 211( G1C)的 m PEG修饰及纯化电泳图谱 F ig. 4　15% SD S2PAGE ana lysis of PEGyla ted h IL 2112G1C and pur if ied PEG2h IL 2112G1C prote in M: LMW standard; 1: PEGylation reaction m ixture; 2: PEGylated h IL2112G1C 学活性 (7. 8 ×106AU /mg)和标准品生物学活性基本相 当 (8. 0 ×106AU /mg) , PEG2rh IL2112G1C修饰产物活性 (2. 5 ×106AU /mg)比标准品或突变体 rh IL2112G1C蛋 白活性有所降低 ,体外细胞生物学活性保持在原有活 性的 30%左右。 4　讨 　论 　　 IL211具有明显的提升白细胞及血小板作用 ,且毒 副作用低。然而 ,临床研究表明 h IL211作用于人体的 有效剂量远高于其它一些用于临床治疗的重组细胞因 子药物 ,大剂量应用易于引起体内免疫原性 ,致使其体 内生物学活性明显降低。并且 h IL211蛋白分子量较 小 ,体内半衰期较短。所以 ,研究具有高比活性、低免 疫原性、体内半衰期长的重组 h IL211至关重要。 　　PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的 生物相溶性的高分子聚合物 ,也是经 FDA批准的极少 数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。PEG修饰 可以克服一些蛋白质类药物的不足 ,它将 PEG衍生物 修饰剂通过化学反应 ,共价结和到多肽或蛋白质类药 物的分子上。修饰后分子量变大 ,可以增强其体内循 环半衰期 ; PEG本身不具有免疫原性 ,修饰后 , PEG还 可能遮盖了蛋白的抗原决定簇 ,从而降低了其在体内 的免疫原性及抗原性 ,间接增强其体内生物学活性。 　　目前 , PEG修饰普遍采用的是单甲氧基聚乙二醇 (mPEG)。mPEG 修饰氨基的方法早期应用广泛 , mPEG偶联 Lys残基侧链的ε2氨基上及 N末端的α2氨 基上 ,修饰产物往往是不同程度及不同修饰位点的产 物混合物 ,这些混合物一般难以分开 ,不易分离 ,其反 22 2009, 29 (6) 李智华 等 : 人白细胞介素 11的定点聚乙二醇修饰 应修饰位点无特异性 ,对蛋白质活性影响较大。有研 究针对如 cys巯基特异性位点来进行 PEG修饰 ,将其 巯基进行 PEG偶联 ,可以得到均一的修饰产物 ,避免了 PEG修饰产物混合异构体的产生 [ 7, 8 ]。 　　蛋白质 PEG修饰时要根据蛋白质构效关系的分 析 ,选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位 点 ,这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。 h IL211蛋白分子中富含脯氨酸残基 (占 12% ) ,但没有 半胱氨酸残基 ,无二硫键和 N2糖基化位点。 h IL211蛋 白分子结构的变化能引起其生物学活性的变化 ,有研 究报道第 58位蛋氨酸的化学修饰 (烷基化和定点诱 变 )可以导致 h IL211在体外的生物学活性减少 25倍 , 第 41和 98位赖氨酸的化学修饰可使 h IL211的生物学 活性降低 3倍。此外有研究报道 h IL211的 C末端区域 为其生物活性中心区 , C末端缺乏 8个以上氨基时 , IL2 11将完全丧失活性。h IL211蛋白分子的 N末端的前 8 个氨基酸的变化对其生物学活性影响不大 , N 末端缺 乏 8个氨基时 ,其生物学活性不受影响 [ 9, 10 ]。并考虑到 PEG修饰的蛋白药物在体内的作用时间与偶联的 PEG 数量和相对分子量成正比 ,在体外的生物活性与偶联 的 PEG数量和相对分子量成反比 ,综合这些因素本研 究选择 N末端位点作为定点突变和 mPEG修饰位点 , 通过 PCR实现定点突变 ,引入一个半胱氨酸残基 ,并将 突变体蛋白在大肠杆菌中实现高效融合表达 ,克服 rh IL211的纯化难题 ,获得较高纯度 rh IL211突变体蛋 白。在此基础上选择分子量 20kDa的 mPEG2马来酰亚 胺作为修饰剂 ,通过控制反应体系条件 ,对突变的 h IL2 11半胱氨酸巯基进行定点 PEG修饰 ,结果得到均一的 mPEG2h IL2112G1C 修饰产物。mPEG 修饰后 , mPEG2 h IL2112G1C表观分子量略高于 mPEG及 G1C分子量之 和 ,这可能是由于线状的 mPEG分子伸展在蛋白表面 , 使蛋白泳动速率降低 ;另一可能的原因是 mPEG的水 化程度非常高 , 因此在 SDS2PAGE上的行为反常。修 饰产物体外细胞生物学活性保留了未修饰前活性的约 30% ,一般 PEG修饰蛋白体外生物学活性下降到原有 活性的 10%左右也较常见。 　　本研究成功获得定点 PEG修饰的 rh IL211,修饰后 rh IL211的免疫原性及抗原性、体内稳定性的变化及药 动学性质等有待进一步研究 ,期望能为降低其免疫原 性及抗原性 ,增强其体内循环半衰期的应用研究打下 基础。 参考文献 　[ 1 ] Du X,W illiam s D A. 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The remaining biological activity of PEGylated2rh IL211 was 30% of native rh IL211, suggesting chem ical modification of rh IL211 by PEG is a p rom ising app roach for imp roving the pharmacological efficacy. Key words　Human interleukin211 ( h IL11) 　Polyethylene glycol　Chem ical modification 梅特勒 -托利多旗下子公司 Rainin隆重推出 L iquidator 96手动移液工作站 　　梅特勒 -托利多旗下子公司 Rainin的创新产品 L iquidator 96手动移液工作站隆重上市 ! 　　L iquidator 96手动移液工作站是适合于所有实验室的一台功能强大的个人研究工具。帮助用户最大限度地提升并简 化工作 ,可一次性完成 96孔板或 384孔板转移。不可思议的超快移液 ,数秒内完成高通量的移液操作 , L iquidator96手 动移液工作站为高通量移液增添了出色的高品质功能及应用于领域。 　　显著特点 : 　　·独特的手工移液系统实现了高通量移液 　　·体积小巧 ,适合于任何一种实验室工作台或层流柜 　　·应用于 96孔板和 384孔板 　　·灵活、易于使用 ,与常规手动移液器相同的操作方式 　　·快速获得即时操作结果 　　·省时省力、节约成本 　　·符合人体工学原理 ,消除手部疲劳 　　更多详情请登陆 www. m t. com 42