药物半数有效抑制浓度EC50检测步骤

细胞半数毒性浓度（CC50）测定将293S细胞以3x104个/孔/100山的密度接种到96孔板中培养，待细胞密度达到80%时开始实验；吸掉各孔细胞培养上清液，加入100U梯度稀释的药物DMEM-2%FBS溶液，使药物终浓度分别为：500册1,250册1,125|jM,62.5|jM,31.25|jM,15.63|jM及7.81|jM,同时设置加入100山空白DMEM-2%FBS的细胞对照，每个浓度设置3个平行孔，放入CO2恒温培养箱，5%CO2,37C。的条件下进行培养；48h后，每孔加入100山CellTiter-Glo®荧光细胞活性检测试剂，室温反应5min,转移至多孔板，利用多标记微孔板检测560nm激发光下细胞的荧光信号；根据所测得的细胞荧光信号,计算各浓度下的细胞活性百分比：细胞活性（%）二药物组细胞荧光值/细胞对照组细胞荧光值x100%；以药物浓度为横坐标,细胞活性百分比为纵坐标,利用Graphpad5.0软件绘制细胞活性的剂量依赖曲线并进行回归，计算细胞半数毒性浓度（CC50）。细胞病变效应半数有效浓度（EC50）测定细胞病变检测条件优化将293S细胞以3x104个/孔/100山的密度接种到96孔板中培养，待细胞密度达到80%时开始实验；将细胞培养上清液吸弃,按照梯度MOI：0.08,0.04,0.02,0.01,0.005,0.0025,0.0013,0.00063加入100山EV71活病毒DMEM-2%FBS溶液，同时设置加入100山空白DMEM-2%FBS的细胞对照，每个浓度设置3个平行孔，放入CO2恒温培养箱，5%CO2,37C的条件下进行感染；分别于病毒感染后24h、48h和72h,每孔加入100山CellTiter-Glo®荧光细胞活性检测试剂，室温反应5min,转移至多孔板，利用多标记微孔板检测560nm激发光下细胞的荧光信号；根据细胞荧光信号,计算各个MOI下感染细胞后所致细胞活性降低情况,选择能够使细胞活性降低至细胞对照组50%及以下的最适MOI及最适感染时间,作为细胞病变效应的检测条件；细胞活性（%）二病毒组细胞荧光值/细胞对照组细胞荧光值x100%；细胞病变效应半数有效浓度（EC50）测定将293S细胞以3x104个/孔/100山的密度接种到96孔板中培养，待细胞密度达到80%时开始实验；将细胞培养上清液吸弃，加入50山梯度浓度的Retro-2cycl,Retro-2.1及chloroquineDMEM-2%FBS溶液处理细胞，使其终浓度分别为:Retro-2cycl：50^M,25^M,12.5|jM,6.25|jM,3.13|jM,1.56|jM及0.78|jM；Retro-2.1：6.25|jM,1.56|jM,0.39|jM,0.098|jM,0.024|jM,0.0061|jM及0.0015|jM；chloroquine：62.5|jM,31.25|jM,15.63|jM,7.81|jM,3.91|jM,1.95|jM及0.98|jM；5h后，Retro-2cycl.Retro-2.1及chloroquine组加入50^LEV71活病毒（MOI二0.04）DMEM-2%FBS溶液；luteolin组同时加入50山EV71活病毒及50山luteolinDMEM-2%FBS溶液，使其终浓度为：50|JM,25|JM,12.5|jM,6.25|jM,3.13|jM,1.56|jM及0.78|jM；同时设置未加入EV71活病毒感染的细胞对照组及未用药物处理的病毒对照组,每个浓度设置3个平行孔，放入CO2恒温培养箱，5%CO2,37C的条件下进行感染；48h后，每孔加入100山CellTiter-Glo®荧光细胞活性检测试剂，室温下反应5min,转移至多孔板,利用多标记微孔板检测560nm激发光下细胞的荧光信号；根据细胞荧光信号,计算各药物浓度下细胞病变效应抑制率：细胞病变效应抑制率（%）=（药物组细胞荧光值-病毒对照组细胞荧光值）/（细胞对照组细胞荧光值-病毒对照组细胞荧光值）x100%；以药物浓度为横坐标，细胞病变效应抑制率为纵坐标，利用Graphpad5.0软件绘制细胞病变效应抑制率的剂量依赖曲线，并进行回归，计算半数有效浓度（EC50）。