脾细胞增殖实验

淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT） [ 来源： 点击数： 278 更新时间： 2009年08月26日 ][ 收藏本文 ] T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素Phytohemagglutimin，PHA）或特异性抗原刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加并能进行分裂，成为淋巴母细胞，即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之 一、形态学检测法 【原理】 淋巴细胞在有丝分裂原（PHA或ConA）或特异性抗原刺激下发生转化，产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率，了解机体的细胞免疫状态。 【材料】 Wright-Giemsa染液 细胞培养液：多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20%无菌NBS、PHA50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）。 肝素（400单位/ml，用Hanks液配制），0.5ml可抗凝血5ml。 2.5%碘酒、75%酒精。 载玻片、无菌棉签、无菌注射器5ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。 【方法】 1．灭菌器材将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌，0.103Mpa（15磅/吋2）20min。 2．分装培养液于各培养瓶中，每瓶2ml。 3．抽取静脉血0.2ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5%CO2孵箱培养72h，期间每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。 4．培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000r/min离心10min。 5．由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后，残留与管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列（计数走向似城墙形）进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。 【结果】 1．用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。 ⑴成熟的小淋巴细胞：与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 ⑵过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 ⑶淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 ⑷其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 2．计算转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过度型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60～80%，如为50～60%则偏低，50%以下则为降低。问题：1．T，B淋巴细胞在何种情况下能发生转化现象？何谓转化现象？2．做淋巴细胞转化实验过程中要注意什么问题   法： （1）     采肝素抗凝血1—2毫升（1毫升血中加肝素20单位）充分混匀。37℃静置1—2小时。红细胞沉淀后，吸取血浆层并捎带些红细胞。移入另一无菌试管中。计算白细胞数然后2000rpm离心10分钟。弃上清液。用199培养液将沉淀的白细胞配成1ⅹ107/毫升细胞悬液。 （2）     取细胞悬液0.6毫升（6ⅹ106细胞）加入含有2.4毫升199培养液的培养瓶中。 （3）     按每毫升营养液加30ugPHA加入PHA。 （4）     37℃孵育68—72小时。培养过程中，每天翻动培养瓶1-2次。 （5）     培养后。振荡培养瓶。将细胞重新悬起，然后移入试管中。 （6）     1000rpm离心5分钟。 （7）     尽量弃去上清液，将沉淀物混匀，取一滴放在载玻片上，推成血膜（头、体、尾分明）干燥，用瑞特氏染液染色）镜检。 （8）     计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（目的是减少推片中细胞分布不均的误差）。 图13 每张玻片记数200—400个细胞，计算转化率其中头部50—100，体部50—100，尾部100—200细胞。 一般认为转化率的正常值为60—70% 淋巴细胞的转化标准 细胞分类 转化的淋巴细胞 未转化的淋巴 淋巴母细胞 过渡型细胞 胞体直径（μm）： 10—20 10—16 6—12 胞核： 位置 多数位于一侧，少数位于中央 中央或稍偏 多数位于中央 染色质 细松，呈颗粒状 较粗松 致密团聚 核仁 清晰可见1—3个 有或无 无 有丝分裂 有时可见 无 无 胞浆： 量 丰富，核之一侧较宽 稍宽 较少呈一窄环 适碱性 ++++ +++ —++ +++—++ 空泡 常可见 有或无 无 伪足 常可见 有或无 无