西藏药业公司对丘小庆论文真伪的药学验证报告(之三)-文档资料

西藏药业公司对丘小庆论文真伪的药学验证报告(之三)-文档资料 西藏药业公司对丘小庆论文真伪的药学验证报告(之三) 关于使用丘小庆的原始菌种制备的Ph-SA和硫酸链霉素 残留量对MRSA的抗菌活性的关系 一、实验目的, 使用丘小庆提供的原始基因菌种,按照Ph-SA授权专利描述的工艺,制备抗金黄色葡萄球菌工程多肽,Pheromonicin,SA,Ph-SA，,检测所得Ph-SA样品和样品中等量的硫酸链霉素残留量对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA，的抗菌活性的关系。 二、实验材料, 1. 主要仪器 1.1 摇床,上海离心机械研究所, SCF-24， 1.2 超声波细胞粉碎机,宁波新芝科器研究所,JY98-3D， 1.3 离心机,Beckman ,J2-HS， 1.4 AKTA蛋白多肽纯化系统,Pharmacia Biotech,Purifier 100， 1.5 超纯水装置,Millipore ,Milli Q Biocel， -可见分光光度计,Pharmacia Biotech,Ultrospec 4000，1.6 紫外 1.7 KXB-250A生化培养箱,上海科析试验仪器厂， 1. 8 培养皿 2,分离介质及试剂 CM,Sepharose Fast Flow ,Pharmacia Biotech， 硼酸、氯化钠等均为国产AR级试剂 3,实验用菌种 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,BA42 MRSA,由四川抗生素工业研究所提供， 三、实验过程, 1. 制备抗金黄色葡萄球菌工程多肽 采用丘小庆提供的原始基因工程菌种,按照Ph-SA授权专利描述工艺流程进行抗金黄色葡萄球菌工程多肽的制备。 将工程菌用摇床培养,4L FAB,225rpm,30?,6h，至对数生长中期,然后升温至42?诱导培养4小时,离心沉淀菌体,4?,6000g,20min，， 取4?,PH 9.0,50mM硼酸缓冲液,含2mM EDTA， 50-80mL悬浮菌体,超声破碎,4?,400W,1-2min，,高速离心破碎菌体,4?,50000-70000g,1.5h，,取上清液,弃沉淀， 在上清液中加入硫酸链霉素沉淀DNA,由于Ph-SA专利上没有准确表述这一流程使用多少支链霉素,我们根据丘小庆实验室提供的数据----每200ml上清液中最多使用10支链霉素、最少使用3支链霉素,所以将这一流程成三个剂量组,即分别用3支,6支,9支硫酸链霉素加入上清液中沉淀DNA。1支硫酸链霉素含量为1g，,25%硫酸链霉素,水溶液，徐徐加入上清中,4?搅拌约1小时， 离心,4?,30000g,10min，,取上清装入分子量15000的透析袋于4?,PH9.0,50mM硼酸缓冲液,2mM EDTA， 4L透析过夜， 将透析液离心,4?,30000g,10min，,取上清上样于CM,Sepharose Fast Flow离子交换柱,用平衡缓冲液冲洗,4?, 0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液洗脱,得到分别用3支,6支,9支硫酸链霉素加入上清液中沉淀DNA的3批抗金黄色葡萄球菌工程多肽,通过SDS-PAGE电泳检测发现3批样品中目的蛋白未见明显主带。 SDS-PAGE电泳图谱 KDa 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 M 1 2 3 4 1.小庆实验室提供原始基因工程菌诱导前 2.丘小庆实验室提供原始基因工程菌诱导后 3.丘小庆实验室提供原始基因工程菌破菌液离心后上清 -SA样品4.丘小庆实验室提供原始基因工程菌制备的Ph 2、样品溶液中硫酸链霉素的残留量的测定 硫酸链霉素的含量的测定按照分光光度法进行 2.1 硫酸链霉素曲线的制备, 取硫酸链霉素200mg,溶解于50mlddHO中， 2 取0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别置于100ml三角瓶中,再各加7mlddHO，2 另取10mlddHO作空白对照， 2 在上述各瓶中加入1mol/L NaOH 2ml,80?水浴10min,再冰浴3min， 再在各瓶中加入1.2mol/L HCl 2ml,FeCl 8ml,分别加水至25ml，于波长3 550nm处测吸收度。 硫酸链霉素标准曲线图 注,此标准曲线可信度,99.8, 硫酸链霉素浓度在0.08mg/ml-0.8mg/ml范围内,光吸收度与浓度呈良好的线形关系。 2.2 待测品的测定, 分别取待测品0.4ml， 在上述各瓶中加入1mol/L NaOH 0.2ml,80?水浴10min,再冰浴3min， 再在各瓶中加入1.2mol/L HCl 0.2ml,FeCl 0.8ml,分别加水至2.5ml，3 于波长550nm处测吸收度。 注,FeCl制备,称取FeCl 5g,用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至50ml,临用前,33 吸取上述溶液2.5ml用0.01mol/L盐酸稀释至100ml。 硫酸链霉素残留量曲线图 2.3 测定结果, 样品中硫酸链霉素含量 样品编号 样品液中硫酸链霉素含量mg/ml 1.1 1,3支， 2.9 2,6支， 4.1 3,9支， 3. 抗MRSA活性检测, a.将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA，取0.1ml接种于1.5%斜面琼脂过夜， b.取2mlPBS洗脱1.5%斜面琼脂的金葡菌,将其反复吹打均匀， c.制备测定板底层,15mlLB培养基，, d.将0.5%顶层琼脂熔化,待冷却至50?左右,加入0.5%菌液， e.将混匀后的菌取10ml左右铺在已铺制底层的测定板上,待其冷却凝固后,将钢圈置放其上， f.依次在钢圈中加入待测品各200μl。 待测品如下, 0?. PBS,阴性对照， 1?,样品Ph-SA-1 蛋白浓度,0.54mg/ml 硫酸链霉素残留量浓度,1.1mg/ml 2?. 1.1mg/ml纯硫酸链霉素PBS溶液 3?,样品Ph-SA-2 蛋白浓度,0.34mg/ml 硫酸链霉素残留量浓度,2.9mg/ml 4?. 2.9mg/ml纯硫酸链霉素PBS溶液 5?,样品Ph-SA-3 蛋白浓度,0.51mg/ml 硫酸链霉素残留量浓度,4.1mg/ml 6?. 4.1mg/ml纯硫酸链霉素PBS溶液 待测品各取200μl,做复板,放于37?孵箱中过夜， 四、实验结果, BA42 MRSA抑菌圈测活图, 0. PBS阴性对照 1. 样品1,硫酸链霉素残留量1.1mg/ml， 2. 纯硫酸链霉素溶液1.1mg/ml 3. 样品2,硫酸链霉素残留量2.9mg/ml， 4. 纯硫酸链霉素溶液2.9mg/ml 样品3,硫酸链霉素残留量4.1mg/ml， 6. 纯硫酸链霉素溶液4.1mg/ml5. 编号 1 2 3 4 5 6 抑菌圈直径cm 1.3 1.3 1.4 1.4 1.6 1.6 五、结论, 使用丘小庆提供的原始基因工程菌种,按照Ph-SA授权专利描述的工艺流程,制备得到的抗金黄色葡萄球菌工程多肽,Ph-SA，,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA，表现出的抗菌活性与相同浓度的硫酸链霉素溶液的抗菌活性相当,因此,Ph-SA样品表现出的抗菌作用可能是其中残留的硫酸链霉素的抗菌作用,不能证实Ph-SA样品表现出的抗菌作用既为抗金黄色葡萄球菌工程多肽,Ph-SA，的抗菌作用。 通过上述实验现象初步判定,在Ph-SA专利中所表述的抗菌活性实验数据和主要药效学实验报告中的抗菌活性实验数据未得到我公司实验数据的支持和证实。