实验一、 海洋微藻的培养、观察与计数

实验一、 海洋微藻的培养、观察与计数 第一部分 环境生物学实验 黄 健 实验一、 海洋微藻的培养、观察与计数 一、实验目的: 1、通过实验了解藻类生长的基本条件和方法，掌握海洋微藻的基本培养方法; 2、显微镜下观察并识别几种常见海洋微藻; 3、了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 二、实验材料:亚心形扁藻、小球藻、叉鞭金藻; 三、主要实验仪器和器皿 ,(显微镜，血球计数板，计数器 ,(培养瓶(三角瓶)，量筒; 四、试剂 ,(培养液: f/2培养液 ,(碘固定液 五、培养条件: 光照强度:1200Lux、温度:20-23?、盐度:3%、光照时间:黑暗/光照=12/12 六、方法和步骤 1、前期准备:各种器皿的消毒、培养液的配制、准备并培养3种不同的海洋微藻:亚心形扁藻、小球藻、叉鞭金藻; 2、接种:将不同的实验藻种分别接种到盛有培养液的不同三角瓶(100ml)中,接种的藻容量和新培养液之间的比例为1:2,1:3。培养量与总容量的比小于2/3; 3、培养 :按上述培养条件进行培养，在培养的过程中，每天摇瓶3次，使藻类充分见接触氧气和光照; 4、换代:5-7天换代1次，换代浓度同上; 5、固定:将藻液摇匀，用小三角瓶分别倒取一定量(20-30ml)的上述3种藻液加入几滴碘液，摇匀杀死细胞; 6、取样:摇匀后，用吸管吸取上述不同的藻液分别滴到盖有盖玻片 的学球计数板的边缘，使藻液慢慢进入盖有盖玻片的区域，避免盖玻片浮起，用吸水纸轻轻吸走多余的藻液，每种藻液取样2次; 7、观察计数:显微镜下观察不同的藻种并分别计数。 1)血球计数板计数原理 血球计数板是一块特制的载玻片，板的中部一“H” 型的凹槽，横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网。每个大格:边长 -4为,,,，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10ml)。中间大方格为计数室以计数室为中心，对角线两端各有一个有16个中格组成的大格。 2)计算藻细胞密度 数出对角线上的4个大方格中的总藻数A，若藻液的稀释倍数为B，则计算如下: A 4细胞密度,????×B×10(个,ml) 4 单位:个,ml 七、实验结果 按下表记录实验数据。 实验数据记录表 次数 各大格中的藻数 1 2 3 4 1 2 八、思考与讨论 用此法计数的结果是活藻体还是死、活菌体的总和, 实验二、藻类急性毒性实验 藻类是最简单的光合营养有机体，种类繁多，分布很广，是水生生态系统的初级生产者。藻类生长因子包括光照、二氧化碳、适宜的温度、pH值及氮、磷、微量元素等其他营养成分，这些因子的变化会刺激或抑制藻类的生长。在一定环境条件下，如果某种有毒有害的化学物质及其复合污染物进入水体，藻类的生命活动就会受到影响，生物量就会发生改变。所以，通过测定藻类的数量就可以评价有毒有害污染物对藻类生长的影响及对整个水生生态系统的综合环境效应。 一、目的: ,、在实验一的基础上，掌握藻类毒性试验的方法; ,、观察有机磷农药对扁藻的致死效应; ,、学会相对增长率(,)的计算方法; ,、绘制相对增长率(k)?有机磷农药浓度曲线 ,、学会使用直线内插法求半数有效浓度(E,); 50 二、实验材料 ,、亚心形扁藻;,、农药:对硫磷;3、培养液:f/2培养液 三、实验方法和步骤 1、藻种预培养:每96小时移种一次，,,,次后使藻达到同步生长;2、配制农药:配制100ppm的农药母液; 3、预备实验: 预备实验的目的在于探明污染物对藻生长影响的半数有效浓度(E,)的范围，为正式实验打下基础，其处理浓度的间距可大一些，50 以便找到值所在的浓度范围。其培养条件均与正式实验相同。 4、正式实验: 1)培养容器的清洗:三角瓶口覆盖灭菌牛皮纸或2-3层纱布; 2)实验浓度的选择:根据预备实验的结果，除对照组外，等对数间距的5个污染物浓度，其中必须包含一个能引起实验藻的生长率下降约50%的浓度，并在此浓度上下至少各设计2个浓度。其中每瓶 藻液100mL(盛在25ml的三角瓶中)，每个浓度梯度组有3个平行样，各组的实验条件保持一致; 3)培养72hr后，分别取样用碘固定液固定 ，血球计数板计数并计算; 四、计算公式 k,(lg,t-lg,0),T N:培养的起始浓度; 0 N:培养T时间后的浓度; t T:培养时间。 五、实验结果记录 实验记录表 实验藻种名称: 藻种编号: 标准培养液: 被试毒物: 实 温度: 初 pH: 验 始 光照: 条 测 光暗比: 藻细胞数N: 0件 定 通气情况: 组别 瓶号 农药浓度 细胞数 K值 平均K值 对照 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 六、根据实验记录，绘制,??,曲线 以试验浓度C为横坐标，以K值为纵坐标，绘制,??,曲线; 七、求半数有效浓度EC: 50 通过直线内插法， K的一半所对应的浓度C即为EC; T50八、思考与讨论 1、实验器皿是否可以用重铬酸钾等洗液洗涤, 2、为什么每个实验组要有3个平行样,为什么污染物浓度设计要采用等对数间距的5个浓度, 实验三 污染物胁迫对蛤蜊滤食率影响的测定 一、原理 滤食率:受试生物在单位时间内滤过的海水体积，是蛤蜊生命活力的一个重要指标。 二、实验目的: ,、通过实验了解蛤蜊滤食率的测定方法; ,、掌握以蛤蜊滤食率为指标的毒性试验测定方法 ,、学会绘制FR(滤食率)??,曲线 ,、求出滤食率的半抑制浓度IC 50 二、实验步骤 ,、预备实验: 预备实验的目的在于探明污染物对蛤蜊生长影响的半数抑制浓度(，,)的范围，为正式实验打下基础，其处理浓度的间距可大50 一些，以便找到值所在的浓度范围。其培养条件均与正式实验相同。 ,、正式实验: ,)致毒实验 (,)在2000ml的烧杯中盛有1000mL灭菌海水，除对照组外，设计等间距的5个污染物浓度，其中久效磷的浓度分别配制为,(对照)、,,、,,、,,、,,、50ppm，每个浓度3个平行样。 (,)选取大小基本一致的蛤蜊，上述每个烧杯中各放入,只，致毒,,hr。 ,)滤食实验 (,)预定的,,hr致毒时间一到，马上把毒液倒掉，把烧杯和蛤蜊冲洗干净，然后换上含有一定浓度微藻的新海水(灭过菌的)1000mL。 (,)记下初始情况下微藻的浓度,; 0 (,)恢复培养,hr，然后记下,hr后的藻类浓度,t; (,)用长尺测量蛤蜊壳长; 三、计算滤食率FR的公式 V(lnC-lnC) 0t FR,??????????? N×t ,:实验海水的体积(,) ,:受试生物个数 t:滤食时间(hr) 比较各实验组的FR与对照组,,，计算抑制百分率 FR,FR0t ????????,100, FR0 五、实验结果记录 实验记录表 蛤蜊的来源: 标准培养液: 被试毒物: 实 初 蛤蜊个数: 验 始 微藻初始浓度: 条 测 实验藻种名称 件 定 组别 烧杯号 农药浓度 微藻浓度 ,,值 平均,,值 对照 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 处理? 1 2 3 四、绘制FR??,曲线 以试验浓度C为横坐标，以FR值为纵坐标，绘制,??,曲线; 五、求出滤食率的半抑制浓度IC 50 通过直线内插法， FR的一半所对应的浓度C即为EC; t50六、结果与讨论 ,、本实验处理组为什么采用等差间距的,个浓度而不是等对数间距的5个浓度, 实验四 石油烃降解菌的富集、分离、纯化及其性能的测定 一、实验原理: 环境中存在各种各样的微生物，其中某些微生物能以有机污染物作为它们生长所需的能源、碳源或氮源，从而使污染物得以降解。本实验以石油烃降解菌为例。石油烃降解菌所含的酶一般是诱导酶，因此在油污染严重或污染时间久的水体中石油烃降解菌含量高，且降解能力强。取这里的表面水样进行石油烃降解菌的富集、分离、纯化，并进行石油烃降解能力实验。 二、实验目的: 学习并掌握分离纯化微生物的基本技能和筛选高效降解菌的基本方法。 三、设备和材料: (一)器材: 恒温振荡培养箱，三角瓶，培养皿，接种环，酒精灯 (二)培养基: 液体培养基:NHCl 2g、KHPO 0.7g、KHPO 0.3g 42424 海水 1000ml、石油烃(原油,柴油,,/,) ,, PH 7.4 固体培养基:另加琼胶粉15克 注:油是,磅,平方英寸，灭菌，固体和液体培养基均在15磅,平方英寸 四、实验步骤 ,、前期准备 ,)准备好液体培养基和固体培养基(未加油)在15磅,平方英寸条件下进行灭菌,,分钟; ,)石油烃在,磅,平方英寸条件下进行灭菌,,分钟; ,)广口取样瓶进行常规灭菌 ,、石油烃降解菌的富集实验(超静工作台中进行); ,)用灭菌的广口取样瓶在海边,个地方(石老人海水浴场、五四广场、第一海水浴场、鲁迅公园、育才中学旁边)野外取表层水50ml(冰桶保存); ,)实验室内，取样瓶摇匀后取,ml，加入盛100ml液体培养基(事先加入石油烃，,,)的250ml的三角瓶中，封口; ,)然后将三角瓶放置于15??条件下，振荡培养(150转,分),,,周，每天定期观察; ,、石油烃降解菌的分离与纯化实验(超静工作台中进行); ,)固体培养基倒平板，制备固体培养基，同时加入石油烃(含油,,) ,)将上述振荡培养,,,周的富集液用菌环挑取在固体培养基上划线，然后封闭; ,)将平板置于15??条件下培养,周，观察平板上长出的单菌落，就是来源于一个细胞的细菌群。 ,)用菌环挑取在固体培养基上的单菌落，再化平板，再长出单菌落，从而达到分离、纯化的目的; ,、石油烃降解菌降解能力的验证 ,)用菌环挑取在固体培养基上的单菌落，加入到前述含油的液体培养基中，放置于15??条件下，振荡培养(150转,分)，每天定期观察; ,),,,周后观察，培养液中的石油烃是否发生降解。 五、实验结果记录 实验记录表 海水来源及取样时间: 液体培养基石油烃的浓度: 固体培养石油烃的浓度: 实 初 液体培养起始时间: 温度: 验 始 固体培养起始时间: 条 测 二次固体培养起始时间: 振荡培养转速 件 定 单菌落液体培养的时间 组别 富集观察到的现分离纯观察到的二次分离观察到单菌落液观察到 培养象 化平板现象 纯化平板的现象 体培养瓶的现象 瓶号 号 号 号 石老人海水1 浴场 2 3 五四广场 1 2 3 第一海水浴1 场 2 3 鲁迅公园 1 2 3 育才中学旁1 边 2 3 六、讨论 对自己实验所得结果作一总结，各组别所得到的菌落数是多少,通过实验所观察到的现象，分析说明青岛前海索取海水样品的,个区域中，哪个区域受到石油烃污染的程度较重, 实验五 蚕豆(vicia faba)根尖微核实验技术 日前蚕豆根尖细胞微核监测技术已成为国内外较为昔遍用于研究和监测环境致突变物(致癌物)的高等植物间期体细胞遗传检测系统。1986年国家环保局已将蚕豆根尖细胞微核监测技术列入《环境监测技术规范》用于水环境监测。通过实验要求掌握蚕豆根尖细胞微核试验方法，并借此对受试物的诱变性进行评定。 一、原理 蚕豆根尖细胞在分裂时，染色体要进行复制，在复制过程中常发生断裂，断裂下来的断片在正常情况下能白行复位愈合，这样细胞可以维持正常生活。如果在细胞分裂时受到外界诱变因子的作用，不仅会阻碍染色体片断的愈合，而且有随因子作用使断裂程度加重的趋势，于是在细胞分裂中会出现一些染色体片断，这些片断由于不具着丝点而不受纺锤丝牵动，游离在细胞质中。当新的细胞核形成时，这些片断就独自形成大小不等的小核，这种小核就是傲核。由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所以可以用微核出现的百分率来评价环境诱变因子对生物遗传物质影响的程度。 二、实验条件 1、实验材料 松滋青皮豆。松滋青皮豆是从蚕豆不同品种中筛选出较为敏感的品种。本品种引入后栽培繁殖时要注意不和其他蚕豆品种种在一起，不喷农药，以保持该品种较低的本底微核率。如果只需对水环境监测起警报系统作用，也可用其他当地蚕豆品种，但要注意设好照组。种子成熟晒干后，为保证其发芽率，要贮于干燥器内，或用牛皮纸袋装好放入4?冰箱内保存备用。 2、设备与器材 显微镜，温箱，恒温水浴锅，冰箱，手揿计数器、解剖盘，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，试剂瓶，烧杯，三角烧瓶，培养皿等。 3、实验试剂 (1)5N HCL (2)卡诺氏液 无水乙醇(或95,乙醇)3份加冰醋酸l份配成。固定根尖时随用随配。 (3)席夫氏(Schiff)试剂 称O.5g碱性品红(Fuchsin Besic)加蒸馏水100mL置三角烧瓶中煮沸5min并不断搅拌使之溶解。冷却到58?时，过滤于深棕色试剂瓶中，待滤液冷至25?时再加入10 mI。1 mol,LHCI和l g偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾(NaS205或k2S205)充分振荡使其溶解:塞紧瓶口，用黑纸包好，置于暗处至少24 h，检查染色液如透明无色即可使用。此染色液在4?的冰箱中可储存6个月左右，如出现沉淀就不能再用。 (4)SO洗涤液 2 贮存液 ?10,Na2 S205 (或10,K2S205)溶液;?1 mol,LHCL。 使用液 现用现配，取上述10,Na2 S205 (或10,K2S205)溶液5 mL，加1mol,LHCL5mL，再加蒸馏水100mL配成。 三、试验步骤 1蚕豆浸种催芽 (1)浸种 将当年或前一年的松滋青皮豆种子按需要量放人盛有自来水(或蒸馏水)的杯中，置25?的温箱中，浸泡26,30 h(此期间至少换水2次，换用的水最好事置于25?温箱中预温(如室温超过25?，即可在室温下进行浸种催芽)。 (2)催芽 待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘内，保持湿度，在25?的温箱中催12,24h。待种子初生根露出2,3mm，再选取发芽良好的种子，放人带框的尼纱网中，并将其放人盛有自来水的解剖盘中，使根尖与水接触，仍置人25?的温中继续催芽，每天更换解剖盘中的自来水，经36,48h种子大部分初生根长至2,3cm，这时就可选择粗细、长短一致且根尖发育良好的种子，用来作为监测水源品或药物 溶液诱发效应之用。 2、蚕豆根尖染毒 每一处理组选取上述种子6,8粒，放入盛有被测液的培养皿中，使被测液泡住根尖即可，一般染毒4,6h(此时间亦可视实验要求和被测液的浓度等情况定)。另设自来水(或蒸馏水)对照组。 3、根尖细胞恢复培养 将处理后的种子用自来水(或蒸馏水)浸洗3次，每次2,3min。洗净后的种子再放人新铺好湿脱脂棉的培养皿中，放人25?的温箱中，使根尖细胞恢复22,24 h。 4、固定根尖细胞 将恢复后的种子，从根尖顶端切下1 cm的幼根放人青霉素空瓶中，加卡诺氏固定液固定24h。(固定后的幼根如不及时制片，可换入70,的乙醇中，置4?的冰箱内保存备用)。 5、浮尔根(Feulgen)染色 (1)固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，每次5min。吸净蒸馏水后，再加入5molHCL将幼根浸泡住，连瓶放人28C水浴锅中水解幼根25 min左右(视根软化的程度可适当增减时间)，至幼根被软化即可。 (2)用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。吸净蒸馏水后，在暗室或遮光的条件下加席夫氏(Schill)试剂，用量以淹住幼根液面高出2mm为宜。 (3)除去染液，并用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5min，然后再用蒸馏水浸洗5min。 (4)将幼根放入新换的蒸馏水中，置4?的冰箱内保存，可供随时制片之用。 6、制片 将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右的根尖，滴上少许45,的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎，然后加一清洁的盖玻片，井在盖玻片上加一小块滤纸，轻轻敲打压片。 7、镜检及微核识别标准 将制片先置低倍显微镜下，找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相较多的部位，再转到高倍镜(物镜40x)下进行观察。 微核的识别标准: (1)凡是主核大小的1,3以下，并与主核分离的小核。 (2)小核着色与主核相当或稍浅。 (3)小核形态可以是圆形、椭圆形、不规则形。 每一处理观察5个根尖，每个根尖观察1 000个细胞，并计数其中有微核的细胞数(微核十分率)。 四、实验结果与 将微核观察记载表上所得数据，按如下步骤进行统计学处理: 各测试样品(包括对照组)微核千分率(MCN‰)的计算: 某测试样(包括对照组)观察到的MCN数 ×100‰ MCN‰= 某测试样(或对照组)观察到的细胞数 (2)如果被监测样品不多，可直接用各样品MCN率平均值与对照组比较从差异的显著性判断水质污染与否。 (3)如被监测的样品较多，可先用方差分析(F检验)看各采样点(或各样品)所测的MCN率平均值和对照的差异显著性。如差异显著，还可进行各采样点微核差异显著性的多重比较，看被检样品MCN率平均值差异显著性的分组情况，以归 纳划分这转不同采样点不同级别的污染程度。 (4)“污染指数”判别:此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，故较宜适用。 样品实测MCN‰平均值 污染指数(PI)= 标准水(对照组)MCN‰平均值 式中，污染指数:0~1.5区间为轻污染;2~3.5为中污染;3.5以上为重污染。凡数值在上、下限值时，定为上一级污染。 五、实验结果记录 微核记录表 处理 制片编号 正常细胞数 产生微核细胞数 细胞总数 微核数 微核率% ,对照 污染物浓度 -1 /mg?L 六、结果与讨论 1、产生微核的实质是什么,在应用微核产生率评价环境污染物对环境生态系统影响时，应注意些什么, 2、怎样消除MCN本底可能有升高现象, 第二部分 生态毒理学实验 肖 慧 实验一 重金属离子对海洋生物的比较毒性实验 ――重金属Cu、Zn对海湾扇贝稚贝的比较急性毒性试验 一、实验目的: 1(掌握急性毒性试验的方法 2(了解重金属Cu、Zn对海湾扇贝稚贝的毒性程度、剂量——反应关系及其相对毒性。 3(比较重金属Cu、Zn对海湾扇贝稚贝的毒性大小。 二、实验原理: 急性毒性试验(acute toxicity test)是研究化学物质大剂量一次染毒或24h内多次染毒生物所引起的毒性实验。其目的是确定化学物质的毒性程度以及剂量-反应关系，确定此化学物质与其他化学物质的相对毒性，确定具体的急性毒作用以及提供毒作用模式方面资料，并为进一步开展其他毒性实验提供理论依据。 重金属离子特别是Cu、Zn对海洋的污染是引起海洋生物中毒的重要原因之一，由于海洋生物对毒物的积累作用，人体食用后，直接危害到人体健康。 三、实验器材 1( 金属离子标准液的配制 Cu:称取0.1000g高纯金属，置于500ml聚四氯乙烯烧杯中，加10ml硝酸(6N)于电热板上加速溶解，蒸至近干，取下稍冷，再加4ml(1:1)硝酸，转到容量瓶中，用去离子水稀释之标准，混匀。作为Cu1000PPm的母液。 Zn:称取1.0000g高纯金属锌到稀释的盐酸溶液中溶解，并用蒸馏水稀释，使总体积为1升，作为Zn 1000PPm的母液，盐酸调至1L左右。 (试验用水取自天然海水，经黑暗沉淀、砂滤 ，曝气后使用。 2 3(稚贝选择壳长3至4mm的健壮个体。 四、实验步骤: 1( 根据预试验结果，确定试验的毒液浓度范围，按对数间隔设定8组(要设空白对照组)。 2( 实验在500ml烧杯中进行，每组25尾，试验时间48h。每天全量换水一次，不通气。 3( 每天定时投喂一次单胞藻，定时观察，及时捡出死贝。(外套膜全部收缩，张口，用玻 璃棒触碰壳，不反应者定为死贝)。 五、实验结果: 1(记录海湾扇贝稚贝在两种重金属溶液中24h和48h的死亡数目，分别计算出24hLD50和 48hLD50。 六、思考 1.比较重金属Cu、Zn对海湾扇贝稚贝毒性的大小。 实验二 持久性有机污染物(POP)对海洋生物的慢性毒性实验 一、实验目的: 1、掌握慢性试验的方法 2、了解持久性有机污染物(POP)对大型蚤繁殖的影响 二、实验原理: 慢性毒性试验是以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生物学效应的试验。通过慢性毒性试验，可确定最大无毒作用剂量，为确定人体每日摄入量和环境最高容许浓度提供毒理学依据。 水生生物慢性毒性试验可以只是干扰水生生物的正常生长、发育和繁殖能力的化学物质浓度。 持久性有机污染物(POPs)是指人类合成的能持久存在于环境中、通过生物食物链(网)累积、在自然环境中滞留时间长，极难降解，毒性极强，能导致全球性的传播。被生物体摄入后不易分解，并沿着食物链浓缩放大，对人类和动物危害巨大的化学物质。 三、实验材料和方法: 1(试验生物:实验室养殖的大型蚤 2(试剂药品:六氯苯 3(稀释水:稀释水为活性炭去氯自来水 4(试验器材:光照培养箱、显微镜; 150mL烧杯、150mL三角瓶 四、实验步骤: 1. 试验设4个浓度组，一个对照组。取4个150mL烧杯注入100mL浓度分别是80、160、 320、640mg/L试验溶液，每个烧杯中放入3个大型蚤。 2. 将大型蚤放在光暗比为16:8，光强为2000Lux，水温24??1?的条件下进行培养。 553. 培养过程中采用小球藻给大型蚤喂食，保证每次投饵密度为5.0×10-6.0×10cell/mL。 4. 每次更换试验溶液时，计数母蚤存活数和繁殖的幼蚤数。试验周期为14d。 五、实验结果: 大型蚤14d存活繁殖试验对照表 污染物 浓度(mg/L) 存活率% 平均每雌蚤产幼蚤数 (个) 对照 80 六氯苯 160 320 640 实验三 UV-B辐射对海洋浮游动物生长和发育的影响实验 一(实验目的 1. 学习慢性毒性实验的设计与分析。 2. 学习UV-B辐射实验的原理与操作。 3. 学习桡足类的培养技术，加强对桡足类生长发育阶段以及各阶段形态的了解。 二(实验原理: 整个海洋生态系统和海洋生物,尤其是海洋浮游生物(包括浮游植物和浮游动物)均局限生活在水体表层,极易受到紫外光UV-B辐射的影响。本次实验采用单个体培养方法,研究了不同UV-B辐射剂量对褶皱臂尾轮虫生活史各个阶段(胚胎发育期、生殖前期、生殖期、生殖后期)经历时间以及平均寿命和产卵量的影响。 三(实验器材 1( 褶皱臂尾轮虫 2( 轮虫饵料:小球藻。实验前用f/2培养液培养至对数生长期待用。 3( 8W紫外B灯(外用0.12mm厚乙酸纤维素薄膜包被)，UV-B型紫外辐射强度仪，容积 为15mL的6孔凹槽培养板。 4( 解剖镜，解剖针。 四(实验方法: 1( 预培养:挑选一个活泼健壮携非混卵的褶皱臂尾轮虫雌体，在恒温光照培养箱内培养待 -2-1用。培养温度23?，光照60umol?m?s培，光暗比为12:12。培养所用海水经过滤、 煮沸消毒,盐度为30，pH为8.6。从预培养的褶皱臂尾轮虫中挑足量活泼健壮的携非混 交卵雌体进行培养。 2( 收集同步孵化的轮虫幼体,并将其放入实验用6孔凹槽培养板,每孔1个，培养液体积 4mL。 23( 设6个辐射量梯度:0、0.24、0.48、0.72、0.96和1.20kJ/m。UV-B辐射处理辐射强度2一定(20LW/cm)，通过调整辐射时间控制辐射剂量，则UV-B辐射相应的时间梯度为 20,40,60,80和100min。 4( 每天上午8点处理一次,直个体死亡。非辐射处理期间,置于恒温箱中黑暗培养。 5( 实验初期,每个个体每隔3h观察一次,准确录轮虫产第一枚卵以及卵孵化出第一个幼体的 间。该个体孵出第一个幼体之后每隔6h观察一并记录轮虫的产卵数，孵化出的幼体数 和母体存活情况,并移去幼体，实验至全部个体死亡时为止。UV-B辐射处理以及处理后 的培养过程中要定时定量向实验物中滴加蒸馏水(在U辐射处理过程中蒸馏水的滴加量 为1mL/h,培养程中为1mL/d)。 66( 在实验期间投以1×10细胞/mL的小球藻为饵料每隔24h投喂一次。 7( 记录褶皱臂尾轮虫生活史各阶段的历经时间以及平均寿命和产卵量，列表比较。 五(实验报告 1. 记录和计算褶皱臂尾轮虫生活史各阶段的历经时间以及平均寿命和产卵量，列表比较。 六.思考题 1.讨论UV-B辐射对褶皱臂尾轮虫的生活史各阶段有什么影响。 实验四 CO加富对两种绿藻的种群动态的影响试验 2 一、实验目的: 1、了解和掌握对藻类生长的测试方法; 2、通过实验观察CO加富对小球藻和亚心形扁藻的种群动态的影响. 2 二、 实验原理: 海洋在缓和全球变暖及大气CO浓度变化的作用上越来越受重视，大气CO浓度升高22使得海水中CO增加、PH下降，并引起不同形态无机碳比例的变化，在海洋生态系统中构2 成食物链基础的藻类不可避免的经受着这些物理化学因素变化的影响。 高CO浓度与大型海藻生长的关系中，存在促进、抑制及没有影响等效应，这可能与2 不同海藻种类和实验条件有关。大气CO浓度升高能提高海洋浮游植物的初级生产力。高2 CO浓度将促进微藻的生长。 2 三(实验材料与器材: f/2培养液、三角瓶、光照培养箱、气体流量计、压缩空气、压缩混合空气; 小球藻(Chlorella.sp)在分类上属绿藻门(Chlorophyta)，绿藻纲(Chlorophyceae)，绿球藻目(Chlorococcales)，卵孢藻科(OÖcystaceae)，小球藻属(Chlorella); 亚心形扁藻(Platymanas subcordiformis)属绿藻门(Chlorophyta)，绿藻纲(Chlorophyceae)，团藻目(Volvocales)，衣藻科(Clamydomonadaceae)，扁藻属(Platymanas) 四、实验步骤: 21、将1.05kg/cm海水灭菌20分钟，培养液选用f/2营养盐配方。将对数生长期的藻细胞接 入盛有200ml f/2培养基的1000 ml的三角瓶中，接种浓度控制在OD=0.200左右，实695 验置于光照培养箱中培养，光照强度为5000lx，光暗比为12:12，温度为20?1? ， pH为8.0?0.1。 2、将培养基的一组通含360μl/L CO的过滤空气，另一组通含有5000μl/LCO的过滤空22 气，通气玻璃管距液面一定距离。气体流量用流量计(LZB-3, 青岛华仪仪表厂，青岛) 控制在300ml/min。整个实验中所用气体用钢瓶中的压缩空气(CO浓度为360μl/L)2 和压缩混合空气(含有5000μl/LCO的过滤空气)来维持(空气和混合空气由青岛合利2 气体工业中心提供，青岛)。 3、细胞密度和干重的测定 将细胞共培养7天，每天分别从4个三角瓶中取出一定量的细胞，用Lugol碘液固定样品测定细胞密度,血球计数板计数。藻体被抽滤在0.45μm的微孔滤膜上，然后放在80?的干燥箱中烘干72h，并用电子天平称其重量，总重量减去微孔滤膜的重量即为藻体的干重。 4、数据处理 五、实验结果: 1、 记录每天细胞的密度和干重。 2、 分别做CO加富对两种绿藻影响的时间—密度图。 2 六、思考题 1、讨论CO加富对两种绿藻的影响。 2 实验五 有机锡对海洋生物酶活性的影响试验 一、实验目的: 1.了解常见的有机锡化合物及其毒性 2.掌握SOD和POD同工酶活性的测定方法 二、实验原理: 有机锡最初应用于塑料工业生产的稳定剂和催化剂。后来随生产量的不断提高和使用范围的不断扩大,大量的有机锡化合物被用于工业、农业、各种杀虫剂、除草剂、纺织品防霉以及海洋船只防污涂料中。海洋生物对有机锡的富集能力很强,因此在浓度很低的情况下就能引起它们累积性中毒或引起可怕的生殖逆向性变化,即具有干扰内分泌系统的作用。 SOD是广泛存在于生物体内防御氧化损伤的一种非常重要的金属酶，对生物体的氧化与抗 -氧化平衡起着至关重要的作用，其功能是将O歧化为过氧化氢(HO)，是生物体防御内、外222 环境中超氧离子对生物体侵害的重要酶，能够很灵敏地反映外界对生物体的损伤。POD是广泛存在于动物植物体内的抗氧化功能酶，催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应(RH+HO,2HO+R)。过氧化物酶同工酶是一种酶的多分子形式，它是生物体基因存在和表2222 达的间接反映。许多研究表明，过氧化物酶同工酶能够反映生物体生长发育、体内代谢状态以及外界环境的变化，可以灵敏地反映外界环境胁迫的变化。 三、实验材料和方法: 1(实验材料为太平洋牡蛎 2(实验用有机锡为0.1%三苯基氯化锡(TPTC)母液 3(冷冻离心机，DYY-6C型稳压稳流电泳仪，GDS-8000凝胶成像系统等 四、实验步骤: 1( 将太平洋牡蛎分别培养在装有4L砂滤海水的5L玻璃缸中，每缸放置5只。共设6个试验组，加入不同量的0.1%三苯基氯化锡(TPTC)母液,使培养海水中有机锡最终浓度为分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg,L，室温18,24?，期间不喂食，培养24h。 2( 活体解剖牡蛎，取肝胰腺称量后，按m?v(1?8)加入预冷提取液(0.05mol/L Tris-Gly，pH 8.3，含10%的蔗糖)，匀浆后13000r/min冰冻离心25min，取300μL上清液加入20μL 0.1%溴酚蓝，置-20?冷冻，24h内进行电泳。 3( 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳，凝胶缓冲系统为1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8),电泳缓冲液为0.05mol/L Tris-Gly(PH8.3)，用前稀释10倍。浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度SOD同工酶为10%，POD同工酶为8.5%，每孔加样40μL。用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，浓缩胶稳压90V,分离胶稳压110V，4?电泳5,7h，待指示剂移到距凝胶下边缘1cm处停止电泳。 4( 染色和拍照 电泳完毕后，SOD同工酶染色采用氮蓝四唑(NBT)法，POD同工酶染色采用 [18]醋酸联苯胺染色法，最后在GDS-8000凝胶成像系统上观察并拍照，实验结果采用TotalLab100进行分析处理。 五、实验结果: 1(记录各浓度条件下SOD同工酶酶谱和活性的变化 酶带序号 迁移率 有机锡浓度(mg/L) No.of isozyme band Migration rate 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2(记录各浓度条件下POD同工酶酶谱和活性的变化 酶带序号 迁移率 有机锡浓度(mg/L) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 六、思考题 1.有机锡对太平洋牡蛎SOD和POD同工酶活性有什么影响, 2.有机锡对太平洋牡蛎SOD和POD同工酶活性影响有何差异, 实验六 UV-B辐射和多环芳烃的遗传毒性联合实验 一(实验目的 1( 学习遗传毒性毒性实验的设计操作以及采用单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方 法。 2( 了解多环芳烃单独作用时对DNA的损伤情况;了解UV-B辐射和多环芳烃联合毒性作 用时对DNA的损伤情况。 二(实验原理 多环芳烃是指分子由2个或2个以上苯环连接在一起的一类化合物。它对人体的主要危害是诱发致癌。环境中的多环芳烃主要来源是煤和石油的燃烧过程。水体中的多环芳烃有三种状态:吸附于悬浮物和沉淀物中;溶解于水，呈乳化状态。UV-B辐射也会造成生物体DNA的损伤。两者在共同作用下，会发生协同作用(多环芳烃在紫外线的辐射下发生光敏化作用)进一步加剧对生物体DNA的伤害。 单细胞凝胶电泳(single-cell gel eiectrophoresis,SCGE)又称慧星试验(comet assay)是一项较新的电泳方法。自1978年被Rydcbert B。等人成功地用于检验DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。尽管 SCGE 技术己应用近 20 年，但其检测单个细胞 DNA 损伤的确切原理还不甚清楚。初步认为，各种因素诱发细胞 DNA 损伤后会影响 DNA 的高级结构，使其超螺旅松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解、 DNA 解链等过程后，电泳时，损伤的 DNA 从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的 DNA 部分保持球形，二者共同形成“慧星”。在一定范围内，“慧星”的长度(代表 DNA 迁移距离)和经荧光染色后“慧星”荧光强度(代表 DNA 的量)与 DNA 损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中 的DNA 损伤 三(实验材料 1( 实验用藻:三角褐指藻(指数生长期，在f/2培养液中培养，培养温度为 (20?0.1) ?， 光照3500 Lx，光暗比为12:12)。 2( 8W紫外B灯(外用0.12mm厚乙酸纤维素薄膜包被)，UV-B型紫外辐射强度仪，容积 为15mL的6孔凹槽培养板。 3( 蒽母液。 4( 电泳仪、荧光显微镜等 四(实验方法 1. 将藻液接种在装有60ml培养液的100mL三角瓶中，设置4个试验组，每组三个平行。 其中A组:对照组;B组:添加蒽溶液，使终浓度为0.05mg/L蒽两组;C组:使用紫 2外灯以12.5uW的辐射强度每天取代日光灯管处理4h(辐射剂量为1.4J/m);D组:添 加蒽溶液，使终浓度为0.05mg/L蒽两组，同时，使用紫外灯以12.5uW的辐射强度每天 2取代日光灯管处理4h(辐射剂量为1.4J/m)。 2. 分别于试验的第0，3，6，9d取样，进行单细胞凝胶电泳试验，将混有待测细胞的琼脂 糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗 涤后用 DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像。 3. 实验结束后，用荧光显微镜将“慧星”图像放大后拍摄下来进行分析。典型的 DNA 损 伤细胞荧光图像象慧星一样头尾分明。 五、试验结果 1(计算DNA细胞的迁移率和DNA迁移长度 2(对数据进行比较，分析毒物的联合作用 六、思考题 1(UV-B辐射和多环芳烃的遗传毒性联合与单污染是有何差异, 实验七 典型污染物复合污染对微生物的生态毒理效应试验 一、实验目的: 1( 了解复合污染与单一污染毒性的区别 2( 掌握各项生态毒理学指标的测定方法( 二、实验原理: 重金属和多环芳烃是土壤环境中两类重要污染物，往往同时或先后进入土壤环境形成复合污染，本试验以多环芳烃菲和重金属镉为目标污染物，通过室内模拟试验，探讨了两者复合污染对土壤生态毒理学指标——土壤酶活性和微生物数量的影响， 三、实验材料和方法: 1( 供试土壤 2( 0.5%的菲的二氯甲烷溶液，0.1%的醋酸镉溶液 四、实验步骤: 1(设置四个组别，每组将800克土壤装入培养容器。1组:对照组;2组:菲的二氯甲烷溶液处理组;3组:醋酸镉处理组;4组:菲的二氯甲烷溶液和醋酸镉复合污染处理组。其中1组不添加任何物质，2组添加菲的二氯甲烷溶液，使终浓度达到50mg/kg，2组添加醋酸镉溶液，使终浓度达到10mg/kg，4组同时加入菲的二氯甲烷溶液和醋酸镉溶液，使浓度分别达到50mg/kg和10mg/kg。 2(将各处理组的土样充分混匀，分装于土壤培养容器中室温培养。 2(整个试验过程中使土壤湿度保持在最大持水量的60,左右(于培养的第0，7，14，28， ,)( 49d分别测定土壤的各项生态毒理学指标，并与对照组相比，计算其抑制率(3(生态毒理学指标测定方法 土壤蔗糖酶活性:3，5一二硝基水杨酸法 土壤脲酶活性:苯酸钠比色法 土壤脱氢酶活性:三苯基四唑氮氯化物法 土壤磷酸酶活性:对硝基酚比色法 土壤微生物数量:平板稀释计数法 五、实验结果: 1(50mg/kg菲的二氯甲烷溶液对土壤酶活性和微生物数量的影响。 污染物质 测定指标 1组 2组 3组 4组 酶活性 蔗糖酶活性 脲酶活性 菲的二氯 磷酸酶活性 甲烷溶液 磷酸酶活性 微生物数量 2(10mg/kg醋酸镉溶液对土壤酶活性和微生物数量的影响。 污染物质 测定指标 1组 2组 3组 4组 酶活性 蔗糖酶活性 脲酶活性 醋酸镉溶 磷酸酶活性 液 磷酸酶活性 微生物数量 3(50mg/kg菲的二氯甲烷溶液和10mg/kg醋酸镉溶液复合污染对土壤酶活性和微生物数量的影响。 污染物质 测定指标 1组 2组 3组 4组 酶活性 蔗糖酶活性 菲的二氯 脲酶活性 甲烷溶液 磷酸酶活性 ，醋酸镉 溶液 磷酸酶活性 微生物数量 六、思考题: 菲的二氯甲烷溶液和醋酸镉溶液这两种污染物质之间的复