木聚糖酶检测方法木聚糖酶活力的测定
分光光度法
1 原理
木聚糖酶能将底物木聚糖(本实验采用Xylan from oat spelt,燕麦木聚糖,Sigma NO. :X0627)降解成寡糖和单糖,具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算待测木聚糖酶的活力。
2 木聚糖酶活力单位(U)的定义
在40℃、pH值为5.0的条件下,1.0 min从浓度为5 mg/mL...
木聚糖酶活力的测定
分光光度法
1 原理
木聚糖酶能将底物木聚糖(本实验采用Xylan from oat spelt,燕麦木聚糖,Sigma NO. :X0627)降解成寡糖和单糖,具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算待测木聚糖酶的活力。
2 木聚糖酶活力单位(U)的定义
在40℃、pH值为5.0的条件下,1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 µmol还原糖(以木糖表示)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。其中样品的酶活力以 U / g(固体酶)或U / mL(液体酶)表示。
桦木木聚糖(Xylan from birch wood)山毛榉木聚糖(Xylan from beechwood)
3 主要仪器
3.1 分光光度计
3.2 精密电子天平
精确至0.0001 g。
3.3 恒温水浴锅
30-60℃可调,精度为0.1℃。
3.4 酸度计
精确至0.01。
3.5 秒表
每小时误差不超过5s。
3.6 刻度试管(15mL)
带玻璃塞,10支以上。
3.7 移液管(0.5、1、2、5、10mL)
3.8 分样筛
孔径为0.25 mm(60目)。
3.9 分析天平
精确至0.001 g。
3.10 磁力搅拌器
附加热功能。
3.11 电磁振荡器
3.12 烧结玻璃过滤器
孔径为0.45 μm。
3.13 离心机
3000 r/min
3.14 冰箱
4 试剂与溶液配制
除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
4.1 氢氧化钠(NaOH)溶液(浓度为200 g/L)
称取氢氧化钠20.0g,加水溶解,定容至100mL。
4.2 乙酸(CH3COOH)溶液(浓度为0.1 mol/L)
吸取冰乙酸0.60mL,加水溶解,定容至100mL。
4.3 乙酸钠溶液(CH3COONa)(浓度为0.1 mol/L)
称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100mL。
4.4 乙酸——乙酸钠(CH3COOH — CH3COONa)缓冲溶液(浓度为0.1 mol/L,pH为5.0)
称取三水乙酸钠19.17 g,加入冰乙酸3.60 mL。再加水溶解,定容至2000 mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0。用精密pH试纸检定。
4.5 木糖(C5H10O5)溶液(浓度为10.0 mg/mL)
称取无水木糖1.000 g,加乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)溶解,定容至100 mL。
4.6 木聚糖溶液(浓度为10.0g/L)
称取木聚糖(Sigma X0627)1.00 g,加入0.32g氢氧化钠,再加入90 mL水,磁力搅拌,同时缓慢加热,直至木聚糖完全溶解。然后停止加热,继续搅拌30 min,加入0.8 mL冰乙酸。继续磁力搅拌,测定其pH值。如果pH值为5.0,用乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100 mL。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0,然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100 mL。木聚糖溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3天。
4.7 DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g(化学纯),加水500 mL,搅拌5 s,水浴至45℃。然后逐步加入100 mL氢氧化钠溶液(4.1),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45℃水浴加热,同时补加水300 mL,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。
4.8 乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液
量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液,加入0.15gTriton X-100(曲拉通100),0.15g牛血清白蛋白(BSA)混合均匀。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0。
5 标准曲线的绘制
吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)2.0 mL,加入DNS试剂(4.7)3.0 mL,沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温,用水定容至15.0 mL,制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液(4.5)3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL,分别用缓冲溶液(4.4)定容至100 mL,配制成浓度为300、400、500、600、700、800 μg/mL木糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00 mL(做三个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入1.0 mL缓冲液(4.4)(终浓度分别为:0,150,200,250,300,350和400µg/mL)和3.0 mL DNS试剂(4.7)。振荡3 s,沸水浴加热5 min。然后用自来水冷却到室温,再用蒸馏水定容至15 mL。以标准空白样为对照调零,在540 nm处测定吸光度OD值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新
表一:木糖标准曲线制作数据
木糖系列浓度(µg/mL)
150
200
250
300
350
400
OD540nm
1号管
2号管
3号管
平均
用EXCEL 线性回归,得到回归方程,用于后续酶活力的计算:
y(µg/mL)=a·OD540nm + b --------------------------------------------------(2)
得: a= ; b= .
6 试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25 mm),称取1.000g样品,精确至0.001 g。加入40 mL乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)。高速磁力搅拌30 min,再用缓冲溶液(4.4)定容至100 mL。上离心机(3.13)4000r离心3min,取上清液,再用缓冲溶液(4.4)做适当稀释(吸光度OD540nm值应控制在0.2-0.6之间,否则需重新稀释再做)。
(注:当以麸皮或玉米芯份做载体的样品时,应使用乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液(4.8)抽提,但应使用乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液(4.4)稀释。)
液体样品可以直接用乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)进行稀释、定容(稀释后吸光度在0.2-0.6之间)。如果稀释后酶液的pH值偏离5.0,需要用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节校正至5.0,然后再用缓冲溶液(5.4)做适当稀释定容。
7 测定步骤
吸取10.0 mL木聚糖溶液(5.6),40℃平衡10 min。
吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液,40℃平衡10 min。
酶空白样制作:
吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡),加入到刻度试管中,再加入3mL DNS试剂(4.7),电磁振荡3 s。然后加入1.0 mL木聚糖溶液(4.6),40℃反应20 min,沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温,加水定容至15 mL,电磁振荡3 s。以此作为反应空白调零。
酶反应样制作(需作3个平行):
吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡),加入到刻度试管中,再加入1.0 mL木聚糖(4.6)(已经过40℃平衡),电磁振荡3 s,40℃精确保温20 min。加入3.0 mL DNS试剂(4.7),电磁振荡3 s,以终止酶解反应。沸水浴加热5 min,用自来水冷却至室温,加水定容至15 mL,电磁振荡3 s。以酶空白样为调零,在540 nm处测定吸光度A。跟据回归方程计算出还原糖量,即y值。
8 试样酶活的计算
Y × N × 2
XD = (2)
20 × 150
XD — 试样稀释液中木聚糖酶的活力,U/mL或者U/g;
Y — 根据样品吸光度OD540nm,用回归方程计算出的还原糖量(即y值),单位为:µg/mL;
N — 从固体样品到测定前最终液的总稀释倍数;
2 — 酶促反应体积为2.0 mL。
150 —木糖分子量,转化为μmol;
20 — 酶解反应效时间20,min;
酶活力的计算值保留三位有数字。
表二:样品活力测定结果数据记录
酶样
OD540nm
木聚糖酶活力
(U/g酶样)
样品1
样品2
样品3
平均
注:由公式2的回归方程求出结果。
9 重复性
每个试样应取二份平行样进行分析测定,相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)。
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