重楼近缘种及商品药材的DNA条形码鉴定研究

重楼近缘种及商品药材的DNA条形码鉴定研究 泸州医学院硕士学位论文 中图分 类号:R89 ;R36 ;R39硕 士 学 位 论 文 重 楼 近缘 种 及商 品 药材 的 DNA 条形 码 鉴定 研究 院 (系 )、 所 药 学 院 研 究 生 姓 名 姜黎 学科、专 业 中 药 学 导 师 姓 名 孙琴 副教授 二 Ο 一 三 年四 月 1 泸州医学院硕士学位论文 目 录 摘 要. 1 Abstract. 2 1 前 言4 2 与方 法. 6 2.1 实验材料6 2.2 实验仪器 与 试剂8 2.3 样品总 DNA 的提取9 2.3.1 提取方法9 2.3.2 DNA 浓度及纯度的 检测11 2.4 PCR 扩增 12 2.5 纯化和测 序13 2.6 数据处理 15 2.6.1 遗传距离 . 15 2.6.2 Wilcoxon Signed Rank Tests 检验16 2.6.3 系统发育 关系分 析 鉴定 效率16 3 结果16 3.1 PCR 扩增效 率和测 序成功率. 16 3.2 候选片段 的序列 特 征. 17 3.3 不同 DNA 片段种内 种间差异 分析 18 3.3 DNA 条形码候选序 列的 barcoding gap19 3.4 两两序列 种内种 间 差异的 wilcoxon 秩 和检验23 3.5 系统发育 关系分 析 评价鉴定 效率. 27 4 讨论. 29 5 结论33 参考文献39 英汉缩略 词对照 表. 40 致 谢41 附 录41 综 述462 泸州医学院硕士学位论文 重 楼 近 缘 种 及 商品 药 材 的 DNA 条形码鉴定研究 摘要 目的:对4 条不 同 的 DNA 条 形码(matK 、trnL-trnF 、rpoC1 、IT S ) 和 组合进 行筛选 ,寻找能 够快速 、 有效、可 靠地鉴 别 重楼与其 常见 近缘种 及 市售商 品 重楼的 DNA 条形 码 或组合。 力图发 现 重楼这一 珍稀 药用植物 的替代 资 源,为 补 充和完 善 重楼属 DNA 条形 码 方面的研 究提 供方法的 参考。 方法:使用 matK 、trnL-trnF 、rpoC1 和核 ITS 的通用 引 物对采集 的 32 个样品 材料进 行 PCR 扩 增和测 序 ,比较各 序列扩 增 和测序效 率、 种内和种间变异,进行 barcoding gap 分 析, 以 此 评 价各序列对 采自 云南、四 川的重 楼 药材和购 自市场 的 商品重楼 的鉴别 能 力 。 结果: 1.ITS 、matK 、rpoC1 、trnL-trnF 序 列作 为鉴定重 楼 与常 见 混伪品 及其商品 药材 的DNA 条形码 候选序 列, 其扩增效 率都能 达 到 100% ,ITS 测序 成功 率达到了100% ,trnL-trnF 、matK 序列 的测序 成功 率分别为9 6% 、82% ,rpoC1 序 列的测序 成功率 能 达到 70% 。 2.ITS 序列 提供了 最大 种间变异且Wilcoxon 检验表 明其种 间最 小 变异明显 大于其 种 内最大变 异,较 有 利于物种 的鉴别 ;barcoding gap 与其他DNA 条形 码 候选序列 相比具 有 明显的优 势。 3. 在鉴定效 率方面 ,ITS 序列对重楼与 其 商品药材 的鉴别 效 率最 高,为96.2% 。ITS+trnL-trnF 组合 序列 在 对亲缘 关系很 近 的易混品 材 料 的鉴别 效率能达到100% 。3 泸州医学院硕士学位论文 4. 基于ITS 、ITS+trnL-trnF 构 建的树 中, 亲缘关系 近的都 各 聚一 支,且市 购的 10 个 商品重楼 样本中 , 商品药材3 与华 重 楼 首先聚 在一 起,提示 其与华 重 楼有较近 的亲缘 关 系,而商 品药材4 与云南重 楼亲 缘关系较 近,商 品 药材 1 与 花叶重 楼 的亲缘关 系较近 , 商品药材2 与 拳参一起 聚在重 楼 属物种的 外围, 据 此可鉴别 商品药材2 是伪品 。 结论:ITS 序列可 以作为 鉴 定重楼 与 其常见 近 缘种 及 市 售商品药 材 的 DNA 条 形码候 选 序列,同 时我们 推 荐 ITS+trnL-trnF 组合序列 作为 其补充序 列。 关键词 : 重 楼; 鉴 别;DNA 条形码 ; 筛选;matK ;trnL-trnF ;rpoC 1 ; ITS4 泸州医学院硕士学位论文 Paris relatives and the DNA bar code identification of comme rcial drugsAbstract :Objective: 4 different DNA bar code matK, trnL-trnF, rpoC1, ITS and combination were screened for DNA, bar code or a combination of fast, efficient, and reliable identifica tion of Rhizoma Paridis and common relatives and commercialTry to find alternative resources of the rare and endangered medicinal plants of Paris, to study the supplement and perfec tion of Paris DNA bar codes provide the method referenceMethods: PCR amplification and sequencing primers using matK, trnL-trnF, rpoC1 and ITS in 32 samples of the material colle cting, comparing the sequence amplification and sequencing ef ficiency, intraspecific and interspecific variation, barcodin g gap analysis, in order to evaluate the sequences collected from the differential ability of Yunnan, Paris polyphylla Sic huan and purchase since the market commodityResult: 1.ITS, matK, rpoC1, trnL-trnF sequence as the identification of Rhizoma Paridis and common mixed DNA barcoding to counterf eit and commercial medicinal materials, the amplification eff iciency can reach 100%, ITS sequencing success rate reached 1 00%, the success rate of trnL-trnF sequencing, matK sequence were 96%, 82%, sequencing of rpoC1 sequence of the success ra te can reach 70% 5 泸州医学院硕士学位论文 2.The ITS series provides imum interspecific variation and Wilcoxon test showed a minimum variance significantly greate r than the intraspecific variation, is beneficial for species identification; compared to barcoding gap and other DNA barc oding has obvious advantages3.In the identification efficiency, ITS sequence of Paris and commodity identification efficiency was the highest, 97.2%ITS+trnL-trnF sequence in a close phylogenetic relationship w ith identification rate of materials can reach 100%4.Based on the ITS, trnL-trnF to build the tree, close relati ve relationship are gathered one branch respectively, and pur chased four Rhizoma Paridis samples, commodity medicinal mate rial 3 and Paris polyphylla first together, suggesting its an d Paris polyphylla have close relationship, and 4 with the Yu nnan commercial crude drug Rhizoma Paridis closer genetic rel ationship, close relationship of commercial medicinal materia ls 1 and mosaic of Paris, commodity medicinal material 2 and Polygonum bistorta together at the periphery of Paris species, which can identify the commercial medicinal materials 2 are fakeConclusion: DNA barcoding ITS sequences can be used as identif ication of Rhizoma Paridis and common relatives and commercia l medicinal materials, at the same time, we recommend ITS+trn L-trnF sequence as its complement sequence 6 泸州医学院硕士学位论文 Keywords: Rhizoma Paridis; identification; DNA code; screening; mat K; trnL-trnF; rpoC1; ITS前 言 生物 多样性 是 人类和其 他生物 赖 以生存和 发展的 基 础,也是 我们 生存的地 球如此 丰 富多彩、 魅力永 存 的源泉, 对于维 持 生态平衡 、 稳 定环境具 有关键 作 用。但同 时,要 想 对数目众 多、 千 差 万别的生 物进 行研究, 首先就 要 对其分类 ,否则 便 无从入手 。对于 中 药材而言 , 其 来源、性 状、鉴 别 、检查、 浸出物 、 含量测定 属于质 量 或品质标 准 范 [1] 畴;但是 品种的 标 准化应是 质量标 准 化的前提 和关键 。 杨洪军等 通过 对药用植 物多年 的 科学研究 发现, 药 用植物在 漫长的 进 化过程中 形成 的或远或 近的亲 缘 关系与化 学成分 和 疗效之间 存在相 关 性,即系 统亲 缘关系较 近的物 种 ,在化学 成分分 布 、药理活 性和传 统 疗效方面 往往 具有很大 的相似 性 。特别是 当今新 资 源不断出 现,栽 培 品种不断 退 化,市场 上出现 了 越来越多 的混伪 品 ,它们在 形态、 性 状及化学 成分 等特征上 具有 高 度 相似性, 鉴别往 往 不易,具 有很大 的 主观性; 同 [2] 时,对于 加工后 的 中药饮片 、粉末 等 ,形态鉴 定已经 无 能为力 。 [3] 随着2007 年 世 界上第一 个DNA 条形码鉴定 中心在 加 拿大成立 , 基于DNA 生物条码 技术 进行 鉴定和 分 类的研究 得到了 科 技界和社 会的 积极响应 。在对 植 物的研究 中,因 其 线粒体基 因的进 化 速率较动 物的 慢,不少 学者尝 试 从叶绿体 基因组 和 核基因组 中寻找 理 想的DNA 条形 7 泸州医学院硕士学位论文 码。目前 ,研究 者 们已经提 出了10 多 条植物候 选DNA 条形码序列 (ITS 、matK 、trnL-trnF 、rpoC1 、rbcL 、rpoB 、psbA-trnH 、UPA 、 ycf5 、rps4 等 )及其 它们之间 的组合 (matK+rpoB、rpoC1+matK+psbA- [4-7] trnH等) 。因 此 ,在今后 的一段 时 间里,从 叶绿体 基 因组和核 基因 组中筛选 有效的DNA 条形码是一 项可行 并极具价 值的工 作 。截止目 [8] 前,Ji 等对重 楼属 的21 个物 种和4 个变 种的ITS 、trnL-trnF 、psbA-trnH 三个序列 进行研 究 ,得出这 三个序 列 能将重楼 属与另 外 两个属区 别 [9] 开。朱英 杰 等 对重 楼属6 条DNA 条形码 候选序列 (psbA-trnH 、rpoB 、 rpoC1 、rbcL 、matK 、ITS2 ) 进行了 扩 增和测序 ,根据 序 列种内种 间变 异程度和 鉴定能 力 等,得出ITS2 序 列 对重楼属 的鉴定 能 力是最强 的, 且复合序 列(rbcL+matK )在重楼属 的 鉴定能力 上没有 提 高。综上 ,在 植物条形 码研究 中 ,有些基 因序列 ( 如ITS 、matK 、psbA-trnH ) 及 其 组合受到 了关注 和 支持,另 一 些基 因 序列(如 :trnL-trnF 、rpoC1 )及 组合尚未 引起普 遍 重视。鉴于此,本文 在前人的 基础上 , 对重楼及 其混伪 品 的ITS 、matK 、 trnL-trnF 、rpoC1 序 列及它们 之间的 组 合进行PCR 扩增和 测序分析 ,比 较采自云 南 、四 川 的重楼药 材和购 自 市场的商 品重楼 以 及对照药 材重 楼的序列 差异, 筛 选出良好 有效的DNA 条形码或组 合,旨 在为重楼 属 物种及市 售商品 重 楼的鉴定 提供快 速 、可靠的 新方法 , 并补充和 完善 重楼属DNA 条形码 的研究。8 泸州医学院硕士学位论文 材料与方法 1 实验材料 1.1 重楼 样品采 集 实验材 料 26 份 重楼样品 分别采 自 云南、四 川等地 , 经泸州医 学院生 药教研室税丕先教 授鉴定为重楼属植 物 。 重 楼 对 照 药 材 购 自 中国药品 生物制品 鉴定所 ,4 份 商品药 材及重 楼伪品拳 参、白 附 子分别购 自 成都 药材市场 (见表1)。 1.2 标本 分类 表 1 样品名称及 来源 Table 1 sample name and origin 样品 样品名 称 拉丁名 来源 号 1 P.polyphylla var.yunnanensis 对照药材 中国药品 生物制 品 Franch Hand.-Mazz 鉴定所( 编号:121 157 ) 2 P.polyphylla var. yunnanensis 云南重楼 云南花甸 3 P.polyphylla var. yunnanensis 云南重楼 云南 4 P.polyphylla var. yunnanensis 云南重楼 四川 5 P.polyphylla var. yunnanensis 云南重楼 四川 6 P.polyphylla var.chinensisFra 七叶一枝 花 云南文山 nch7 P.polyphylla var.chinensisFra 七叶一枝 花 云南 nch 8 P.polyphylla var.chinensisFra 七叶一枝 花 四川 nch 9 P.polyphylla var.chinensisFra 七叶一枝 花 四川 nch9 泸州医学院硕士学位论文 10 P.marmomta 花叶重楼 云南洱源 11 P.marmomta 花叶重楼 云南 12 P.marmomta 花叶重楼 峨眉山 13 P.polyphylla var .chinensis华重楼 峨眉山九 里镇 14 P.polyphylla var .chinensis 华重楼 峨眉山 15 P.polyphylla var .chinensis 华重楼 峨眉山 16 P.polyphylla Smith var.polyp 多叶重楼 云南 hylla 17 P.polyphylla Smith var.polyp 多叶重楼 云南 hylla 18 P.polyphylla Smith var.polyp 多叶重楼 云南 hylla 19 P.pubescens 毛重楼 峨眉山富 友村 20 P.pubescens 毛重楼 峨眉山 21 P.pubescens 毛重楼 峨眉山 22 P.pubescens 毛重楼 峨眉山 23 P. fargesii var.fargesii 球药隔重 楼 峨眉山石 笋沟 24 P. fargesii var.fargesii 球药隔重 楼 云南 25 P. fargesii var.fargesii 球药隔重 楼 云南 26 P.polyphylla var.stenophylla 狭叶重楼 四川France 27 P.polyphylla var.stenophylla 狭叶重楼 云南 France 28 商品药材 1 不详 成都药材 市场 29 商品药材 2 不详 成都药材 市场 30 商品药材 3 不详 成都药材 市场10 泸州医学院硕士学位论文 31 商品药材 4 不详 成都药材 市场 32 商品药材 5 不详 成都药材 市场 33 商品药材 6 不详 成都药材 市场 34 商品药材 7 不详 成都药材 市场 35 商品药材 8 不详 成都药材 市场 36 商品药材 9 不 详 成都药材 市场 37 商品药材 10 不 详 成都药材 市场 38 Polygonum bistorta 拳参 成都药材 市场 39 Polygonum bistorta 拳参 成都药材 市场 40 Rhizoma Typhonii 白附子 成都药材 市场 2 实验仪 器 (1 )凝胶成 像系统 (型号:universal Hood ? ) (2 )高速冷 冻离心 机(型号 :Biofuge stratos ) (3 ) 电子天 枰(型 号:ES-120 ) (4 )XK96-A 快速 混匀器 北 京维欣 仪 奥科技发 展有限 公 司 (5 )PCR 仪( 美 国 Bio-Rad ,型 号: BS97MyCycler ) (6 ) 电泳仪 :(北 京六一仪 器,型 号 :76662GC114 ) (7 ) 电泳槽 :(北 京六一仪 器,型号 DYCP-31C ) (8 )1.5ml 离心管 上海 Sangon(9 )PCR EP 管 (美国 Axygen )(10 )数显 恒温水 浴锅(HH-2 国 华电 器有限公 司)(11 )微量 移液枪 (2.5μL ,10μ L ,200μL ,1000μL 德国 eppe-ndorf )(12 )超净 工作台 哈东联 DL -CJ -1ND ?11 泸州医学院硕士学位论文(13 )专用 纯化水 机 型号:LD-HL-8 (14 )微型 漩涡混 合仪(型号: WH-1 ) 3 实验试 剂 (1 ) 植物基因组 DNA 提 取试剂盒 (北京 天 根生化科 技有限 公 司,目录 号:DP305 ) (2 ) 琼脂糖凝胶 DNA 回 收试剂盒 (北京 天 根生化科 技有限 公 司,目录 号:DP209 ) (3 ) 引物(上 海英俊 公 司合成) (4 )PCR 用水 (高压 灭菌 双蒸水) (5 ) 琼脂糖( 产品货 号 :3002 ,规 格:100g ) (6 )5 × TBE 电泳缓 冲液 (规格:250ml ) (7 ) 核酸染料Goldview ( 货号:D0125 ,规 格 :1ml ) (8 )2 ×Tap PCR MasterMix ( 目录号 :KT201 ) 4 实验方法 4.1 样品 总DNA 的提 取 4.1.1 提 取方法 (1 )从装有 变 色硅胶的 塑封袋 中 取约 30mg 的样品 ,加入液 氮快速 碾磨成粉 末。 (2 ) 用药匙 将 样品粉末 迅速转 移 到预先装有 700 μL 缓冲液 GP1 (6 5 ? 预热,且在实验前先确定已加入了 巯基乙醇)的离心 管中,迅速颠 倒离心管使其混匀,再将离心管放在 65 ? 水浴 20min ,水 浴 过 程 中 尽 量多次颠 倒离心 管 ,增加样 品的混 合 数次。 (3 ) 加入 700 μL 氯 仿,充 分混 匀,12,000rpm (~13,400xg )离 心 5min 。12 泸州医学院硕士学位论文 (4 ) 小心将第 3 步 所得上层 水相转 至 一个新的 离心管 中 ,加入 70 0 μL 缓冲液GP2 , 充分混匀 。 (5 ) 将混匀 的液体 转入容积 为 700 μL 左右的吸 附柱 CB3 中,12, 000rpm (~13,400xg )离心 30sce , 弃掉 废 液 。 (若 液 体体 积 超 过 700 μL , 可以分 多次加 入。) (6 ) 向吸附 柱 CB3 中加 入 500 μL 事先加入 无水乙 醇 的缓冲液 G D ,12,000rpm (~13,400xg ) 离心 30sce ,倒 掉废液 ,将吸 附柱 CB3 放 入收集管 中。 (7 ) 向吸附 柱 CB3 中加入 700 μL 加入 了无水乙 醇的漂 洗 液 PW ,1 2,000rpm (~13,400xg )离 心 30sce , 倒掉废液 ,再次 将 吸附柱 CB3 放 入收集管 中。 (8 ) 再加入 500 μL 漂洗液 PW 到吸 附 柱 CB3 中,12,000rpm (~13, 400 ×g ) 离心30sce ,弃掉废 液。 (9 ) 将吸附 柱 CB3 放回 收集管 中,12,000rpm (~13,400xg )离心 2min , 倒掉 废 液 。将 吸 附 柱 CB3 置 于室 温 放 置 数 分 钟 , 以 彻 底 晾 干 吸 附材料中 残余漂 洗 液。 注 意 : 这 一 步 的 目 的 是 将 吸 附 柱 中 残 余 的 漂 洗 液 去 除 , 漂 洗 液 中 乙醇的残 留会影 响 后续的( 酶切、PCR 等)实验 。 (10 ) 将 吸 附 柱 CB3 转 入 一 个 干 净 的 离 心 管 中 , 向 吸 附 膜 的 中 间 部位悬滴加 50-200 μL 洗脱 缓冲液 TE ,室温放置 2-5min ,12,000rpm (~13,400xg )离心2min ,将 溶液收 集到离心 管中。 注意: 为增加 基因组 DNA 的 得率 ,可将离 心得到 的 溶液再加 入吸 附柱 CB3 中,室 温 放置 2min ,12,000rpm (~13,400xg ) 离心 2min 。 洗脱缓冲 液体积 不 应少于 50 μL ,体 积过小影 响回收 效 率。洗脱 液的 P 13 泸州医学院硕士学位论文 H 值 对于洗 脱效率 有很大影 响。若 用 水做洗脱 液应保 证 其 PH 值在 7.0- 8.5 范围内(可 以 用 NaOH 调节 水的 PH 值不 低于 7.0 ,否 则会使洗 脱效 率降低) ;得到的DNA 产 物于-20 ? 条件 下 保存 , 以防 DNA 降解。 4.1.2 DNA 浓度 及纯 度检测用琼脂糖凝胶电泳 法和紫外分光光度 计法检测回收所得 DNA 片段 的浓度和 纯度。 4.1.2.1 电泳法 检测 (1 ) 制备琼脂 糖凝胶 : 称取 0.3g 琼脂 糖 粉,加 20ml 的 1 xTBE 电泳 缓冲液, 即凝胶 浓 度为 1.5% , 置于微 波炉中中 火加热 2min 使 之完全 溶 解。将其拿出自然冷却至 50-60 ? ,加 入 Goldview , 混匀 后 , 倒 入 事 先插上梳 子的胶 槽 中,凝固 成形, 小 心拔出梳 子,待用。 (2 )上样与电泳:将制 备好的凝胶电泳槽 中,加入 1 xTBE 电泳缓冲 液,使其 超过胶 面 1cm 后,开 始点样 ,点样量 约为 6 ul 。立即盖 上盖 子(注意 正负极 别 盖反), 电压 120v ,30min 左右观 察结 果。 (3 ) 凝 胶 成 像 : 将 凝 胶 从 电 泳 槽 中 取 出 , 小 心 的 放 入 凝 胶 成 像 仪 中 , 打开凝胶 成像分 析 软件,在 紫外下 观 察,调整 焦距, 记 录清晰图 像。 4.1.2.2 紫外分 光光 度计检测 所得 DNA 的 显著吸 收峰应出现在 OD 处,OD 值为 1 相当于大约 4 260 260 0 μg/m 单链DNA 。 若 OD /OD 比值低于 1.7-1.9 (正 常值)时,并不一定表示 所得 260 280 DNA 的纯度 低,有 可能是因 为在洗 脱 时用去离 子水代 替 了缓冲液 ,影响 了光的吸 收值所 致 。 4.2 PCR 引物扩 增 本 实验使 用 ITS 、trnL-trnF 、matK 和 rpoC1 的 4 个 引物对进 行扩 14 泸州医学院硕士学位论文 [10-12] 增,引物 来自相 关 文献 ,各序列最 佳退火温 度采用 梯 度 PCR 仪进行 扩增 , 温度梯度设置为 50 ~61 ? , 筛选 得 到 各序列 最佳退火温度。 各 序列优化 的扩增 程 序 见表2 。 表 2 各引物 名称及 扩增程序 Table 2. List of universal primers and reaction conditions for the four loci used in this study Name Marker ofPrimer Sequences 5’-3’ Reaction conditions s Prime rs [13] 94 ?5min TCCTCCGCTTATTGATAT ITS-4 GC 94 ?1min ,52 ?1min , ITS 72 ?1min 30cycles ITS- TCGTAACAAGGTTTCCGT 72 ?8min L AGGTC [14] 94 ?3min CGAAATCGGTAGACGCT C: 94 ?30s ,56 ?30s ,72 ACG trnL-trn ?45sF ATTTGAACTGTGACACG 35cycles F: AG 72 ?8min [15-16] 94 ?5min CGATCTATTCATTCAATA 390F: TTTC 94 ?1min ,52 ?1min , matK 72 ?min 30cycles 1326 TCTAGCACACGAAAGTC 72 ?8min R: GAAGT [17] 94 ?5min GGCAAAGAGGGAAGATT 2F: TCG 94 ?1min ,52 ?1min , rpoC1 2 ?min ,30cycles CCATAAGCATATCTTGAG 4R: 72 ?8min TTGG PCR 反应体 系: Mixture 12.5ul DNA 模板 1ul 引物上游1ul15 泸州医学院硕士学位论文 引物下游1ul ddH2O 9.5ul总体积 25ul 4.3 纯化 和测序 PCR 扩增产 物用 1.5% 琼脂 糖凝胶 分离检 测,用 1 ×TBE 电泳 缓冲液 电泳,电压 120v ,30min 后 将 凝 胶 从电 泳 槽 中 取 出 , 置于 凝 胶 成 像 分 析系统下检测结果 ,并拍照。将明显 的 PCR 条带切下,置于离心管 中,按一定比例加 入 DNA 琼 脂 糖 凝 胶液 , 对 其 进 行 回 收 纯 化 后 , 送 上 海英俊测 序公司 进 行双向测 序。胶 回 收纯化步 骤如下 : 1. 将平衡液 BL (500 μl ) (吸附 柱放入 收集管中 )加在 吸 附柱 CA 2 中,12,000rpm (~13,400 ×g ) 离心 1min , 倒 掉 废液, 将 吸 附 柱又 重新置于 收集管 中 。 2. 从 琼 脂 糖 凝 胶 中 切 下 单 一 目 的 条 带 ( 尽 量 将 多 余 部 分 切 除 干 净),将 其称重 量 后放入到 干净离 心 管中。 3. 向胶块中 加溶胶 液 PN 时, 一般为 胶块 体积的 3 倍;如 果 要回收 的 DNA 片段 小于 150bp 或电 泳凝胶 浓 度大于 2% 时 ,一般 使用胶块 体积 的 6 倍 PN 溶胶液 。将其放 在水浴 锅 (50 ?)中 10min ,为了使 胶块能 完全溶解,需要不 断的上下缓慢的翻 转离心管。在还有 胶块没有溶解 的情况下,可以再 继续加入溶胶液后 轻轻晃动离心管, 也可以将胶块 切碎,分次溶胶。 由于 DNA 与 吸 附 柱的 结 合 能 力 会 随 温 度 的 增 加 而 减 [18] 弱,因此 在上柱 之 前,应将 胶液温 度 降到室温 。16 泸州医学院硕士学位论文 4. 将第 3 步 得到的 胶 液分次加 入配有 收 集管的吸 附柱 CA2 中,在 室温条件 下放置 2min 后,12,000rpm (~13,400 ×g )离 心 30 ~60s , 倒掉废液 ,将吸 附 柱重新放 入收集 管 中。 5. 向吸附柱 里加 600 μl 事先 加入了 无 水乙醇的 漂洗液 PW ,12,000 rpm (~13,400 ×g )离心 30 ~60s , 倒掉废液 ,又重 新 将吸附柱 CA2 置 于收集管 中。 6 、重 复第5 步 的工作内 容。 7 、 将 吸 附 柱 CA2 再 一 次 放 到 收 集 管 里 ,12,000rpm (~13,400 × g )离 心 2min ,目 的是为了 将漂洗 液 尽可能的 除干净 。 因为事先 加入到 漂洗液中的乙醇残 留会使下一步的酶 切或 PCR 等 试 验 受到 较 大 影 响 。 因此,要在室温条 件下,将吸附柱放 置几分钟,直至将 残留其中的漂 洗液完全 的晾干 。 9 、 将吸附 柱 CA2 转移 至另外 一个 干净的离 心管中 , 为了不污 染回收 的 DNA 目 的 片 段 ,在 滴 加 洗 脱 液 时 , 应 悬 空 于 吸 附 膜 的 上 空 中 间 位 置 滴加,并 且滴加 的 洗脱液 EB 应 适量 ,其体积和 PH 值 会影响回 收效率 和测序效 果,一 般 加入洗脱 液的体 积 应该大 于 30 μl , 若用去离 子水作 为洗脱液 ,则应 该 将 PH 值控制 在 7.0-8.5 之间 ,低于 7.0 将有 可能会 降低洗脱 效率。 ( 如果回收 的目的 片 段大于 10kb ,则洗 脱缓冲液 EB 应 [19] 置于 65-70 ?水 浴 预热) ,室温 条 件下放置 2min 后 。以 12,000rpm (~13,400 ×g )离 心 2min ,收集 DNA 溶 液,将其 放于-20 ?条件 下保 存,以避免DNA 降 解。若想 提高 DNA 产物量, 可重复 此 步骤。 4.4 数据 处理方 法 4.4.1 遗 传距离 分 析17 泸州医学院硕士学位论文 测序结果 根据GenBank 上已登 录的重 楼 属4 个 序列(ITS 、MatK 、tr nL-trnF 、rpoC1 ) ,对测定 的 各序 列 边界进行 划分。 将 获得的序 列用C lustal W 软件进 行 多重排定 。序列 排 好后辅以 手工校 正 。使用DNAMAN 软件包(Version 5.2.10 ;Lynnon Biosoft )进 行序列 长 度变异分 析 。比对 后的序 列 采用MEGA 4 统计ITS 序列碱基 组成。包括GC 含量 、保 守位点、 变异位 点 和信息位 点,其 次 计算K2P 值、 属间、 种间及种 内遗 传距离, 序列变 异 位点采用PAUP 4.0B10 进行统 计。[20] 4.4.2 Wilcoxon Signed Rank Tests 检验 为 了更加 准确的 反应出两 两序列 相 关样本的 差异程 度 ,我们使 用 SP SS13.0 统计 软件对 各基因片 段种间 遗 传距离进行 Wilcoxon 秩 和检验 , 统计各个 片段的 遗 传分化, 来作为 筛 选候选片 段的一 个 指标。 4.4.3 系 统发育 关系 分析评价 鉴定效 率 采用 PAUP4.0B10 软件包经 最大简 约 法(imum parsimony ,M P )构建序 列系统 发 育树。当 最优化 标 准(optimality criterion ) 设置为 简约法(parsimony )时,采 用启发 式 搜索(heuristic search ) ,分支交 换算法采 用树对 分 重接(tree bisection-reconnection ,TBR )法,100 次 随 机添加 替代。 所 有空位(gap )作 为 缺失处理 ,每个 特 征值作为 等权 处理。系 统发育 树 拓扑结构 的可靠 性 用 1000 次重 复抽样 (replicates ) [21] 的自展分 析(bootstrap ,BS )来 检验 。18 泸州医学院硕士学位论文 结果 1 、 PCR 扩增效 率和 测序成功 率 为了筛选 适合鉴 定 的重楼 DNA 条形 码 序列或组 合,首 先 需要比较 不同候选 序列的 扩 增效率和 测序成 功 率。本次 试验中 对 采集样本的4 条候选序列PCR 扩 增效率( 出现明显PCR 条 带)和 测序成 功率(测 序 获得高质 量的序 列 )统计结 果:4 条基 因序列的 扩增效 率 都能达到10 0% ,ITS 序列的 测序 成功率达 到了 100% ,matK 、trnL-trnF 序列的测 序 成功率分 别为 96% 、89% ,rpoC1 序列的 测序成功 率能达到71% ,图3 (见附录 )列出 了 重楼样品 各序列 峰 图,该图 反映了 序 列的测序 质 量。图 1 ITS 、matK 、rpoC1 和 trnL-trnF 序列 PCR 扩增电泳图 Figure1.Amplification of ITS, matK, rpoC1 agarose gel electrophoresis and trnL-trn F sequence of PCR19 泸州医学院硕士学位论文 图 3. PCR 测序成功率 图 2. PCR 扩增成功率 Figure3 PCR sequencing success rate Figure2.PCR amplification success rate 2 候选片 段的序 列 特征 本研究共对重楼 与常见混 伪品及 其 商品药材的 4 个 DNA 片段(IT S 、matK 、trnL-trnF 、rpoC1 )进 行测序 。所得序 列用 DNAMAN 软件 [22] 进行拼接 ,然后 使 用 Clustal W 软件 进 行多重 排定 , 序 列排好后 辅以 手工校正 。 序列对齐后用 Mega4.0 统 计序列 的 信息,包 括序列 长 度、多态 性位 点(变异 位点、 信 息位点)和 GC 含 量等,其 基本信 息 (见表 3 )。从 表中可知 ,4 个 基因 片段中,ITS 序列 有 100 个 变异位 点 ,49 个信息 位 点,且 变 异程度 最 高(15.6% ),rpoC1 的变异 程度最 小(2.81% ), 顺序为:ITS (15.6% )>trnL-trnF (3.52% ) >matK (3.34% )>rpoC1 (2.81% ) 。因此 , 我们选择 基于 ITS 基因对重 楼与近 缘 种、重楼 与伪 品进行比 对 (见 附 图) 。 从 ITS 序 列 的比对图 中可以 看 出,位点 (5 : C 和 13 :G )对 球 药隔重楼 有鉴别 意 义;位点 (12 :T ) 和位点(15 : G )的组合对 狭叶重 楼有鉴别 意义, (14 :A 和 214 :T ) 组合位点 对 多叶重楼 有鉴别 意 义。位点 (5 :C 和 81 :T )对毛 重楼有 鉴别意义 , 位点(14 :C )对 花 叶重楼有 鉴别意 义 。 在 重楼 与伪品 的 比对图中 , 重 楼伪品( 拳参、 白 附子)都 难于比 对 ,很容易 将其与 重 楼鉴别开 。 20 泸州医学院硕士学位论文 表 3 4 个基因片段 的序列特征 Table3 Sequence features of the 4 gene fragments G+C 基因名称 碱基数目 保守位点 变异位点 信息位点(% ) (% ) (% ) ITS 622-639 524 65.1 100(15.6 ) 49(7.67) matK 891-897 814 33.1 30(3.34 ) 19(2.18) rpoC1 483-497 482 43.7 14(2.81 ) 9(1.81) trnL-trnF 1042-1050 981 36.5 37(3.52 ) 24(2.29) 2. 不同DNA 片段种 内种间差 异分析 理想的 DNA 条形码序列应 当具有 明 显的种间 变异和 足 够小的种 内 变异, 对 本 实 验 获 得 的 各 条 形 码 序 列 的 种 内 、 种 间 变 异 及 种 间 最 小 变 异、种内 种内最 大 变异进 行 分析, 结 果表明(表 4 ): 在种间变 异上,ITS 序列的检 验值最 大 ,接着是 trnL-trnF 、mat K 、rpoC1 。在种 内 变异上, 同样是 ITS 序列的种 间变异 最 大,trnL-trn F 次之,rpoC1 序 列 的最小。 由此可 见 ,ITS 序列的种 间最 小变异明 显 大于其种 内最大 变 异,较有 利于物 种 的鉴别; 表 44 条 DNA 条形 码序列种内种间差异分析 Table4 Analysis of 4 DNA barcode sequence of interspecific and intraspecific dif ferences ITS trnL-trnF matK rpoC1 基因 0.019 0.017 0.0072 0.013 种间变异 0.0009 0.0013 0.0018 0.0095 种内变异 0 0.005 0.0017 0.004 种间最小变异 0.0035 0.004 0.0012 0.005 种内最大变异 3. DNA 条形码候选 序列的 barcoding gap 检验21 泸州医学院硕士学位论文 barcoding gap 为条 形码种间 遗传变 异 与种内遗 传变异 之 间由于存 [21-22] 在显著性 差异而 形 成的一个 明显的 间 隔区 , 其 种内 遗传变异 明显 小于种间 遗传变 异 被视为理 想状态 , 即 种内变 异应集 中 分布 在 barcodin g gap 图较 小数值 的 一侧(左 侧), 另 一侧(即 数值较 大 的一侧) 应集 [22] 中显示种 间变异 。TAXON DNA 软件 常被用于 序列的 计 算 ,本实 验 中,我们对 4 条 单 序列及组 合序列 分 别进行了 计算, 并 作出 barcoding gap 图,使用 Mega4.0 软件中 K2P (Kimura-2-parameter distance )模 型,基于 K2P 模型 计算的种 间、种 内 遗传距离 平均值 , 统计种间 和种 [22] 内遗传距 离分化 情 况 。以遗 传距离 为依据 , 评价每 一 个条形码 候选 片段的适 应性。 筛 选能鉴别 重楼与 常 见近缘种 及商品 药 材的 DNA 条形 码的片段 或片段 组 合。结果 见(表 4- 表 6 ,图 4- 图 6 ) 从图 4 中可知, 每一个候 选片段 分 布情况相 似,都 存 在种间和 种内 变异的最 高峰, 两 者之间都 存在重 叠 ,但每个 片段重 叠 程度不同 。ITS 序列的种 内变异 相 对更集中 于图的 左 端,更有 利于物 种 鉴定。trnL-trnF 序列种内变 异的幅 度和变异 样本数 的 比例明显 较小, 与 其种间变 异幅 度和变异 样本数 比 例较大形 成鲜明 的 对照,因此 trnL-trnF 序列的 barc oding gap 图相对 较 好。与 trnL-trnF 相 比,rpoC1 序列 的种 内和种间 变 异完全重 合,因 此 不适合用 于物种 鉴 别。单一 片段中 ITS 、trnL-trnF 的 重叠程度 较小 。 因 此,与其 他候选 条 形码相比 ,它们 对 重楼与常 见混 伪品及其 商品药 材 更具有鉴 别潜力 。 在两片段组合种 间和种内 遗传分 化 分布情况 (图 5 )中 ,ITS+trnL-t rnF 序列 种内变 异 的幅度和 变异样 本 数的比例 明显减 小 小,ITS+trnL-tr nF 序列组 合的 barcoding gap 图比单 序 列 ITS 、trnF-trnL 的稍好。其 次 是 ITS+matK 、matK+trnL-trnF 。22 泸州医学院硕士学位论文三片段组合的 种 间和种 内遗传 分 化分布情 况显示 ( 图 6 ), 增加片 段后, 种 内变异 的 幅度和变 异样本 数 的比例及 其种间 变 异幅度和 变异 样本数比 例 并没 有 明显的改 变。 从表 4 中 可 知 , 所 有 片 段 及 组 合 的 种 间 遗 传 距