卵细胞的发生和调控

卵细胞的发生和调控 第27卷第1期 VoI.27No.1 农业科学研究 JournalofAgriculturalSciences 2006年3月 Mar.2006 0747(2005)04—0087—06 文章编号:1673— 卵细胞的发生和调控 张珠明,汪仁莉 (宁夏大学农学院,银川750021) 摘要:卵细胞在卵巢中进行减数分裂的过程1作卵的发生,这个过程包括增殖期,生长期以厦成熟期3个阶段. 卵泡的发生包括卵泡的募集,选择和优势化,对于卵泡在发育的过程中出现这3个阶段的机理研究尚不是很清楚. 卵泡发生的调节机制非常复杂,在此重点研究卵巢局部因子对卵母细胞发育的影响以厦卵泡各结构间的相互影 响,卵母细胞发育的过程中也出现了超微结构的改变. 关键词:卵细胞;发生;调控 中图分类号:Q954.4文献标志码:A Oogenesisandadjustmentsofoocyte ZhangZhuming,WangRenli (SchoolofAgriculture.NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China) Abstract:Oocytesdevelopintheovariesbyaformofmeiosiscalledoogenesis.Therearethree stages:proliferation period,growthperiodandmaturationperiodinoogenesis.Recruitment,selectionanddomin anceareincludedin folliculardevelopment,butthemechanismoftheirappearanceisnotclear.Theadjustmentme chanismofthe folliculardevelopmentisverycomplex.Theinfluenceofovarianlocalfactorsandtheinfluen cefromfollicleitself weremainlydiscussed.Duringtheoogenesis.manyultramicrostructurechanged. Keywords;oocyte;development;adjustments 卵细胞作为机体细胞中特殊的一种,在生产实 践和科学研究中的重要地位受到科学工作者越来越 多的关注,但由于试验材料的较难获得和试验条件 较高的要求,对卵母细胞的研究远没有对精子的研 究广泛和深入.另外,就现有的对卵母细胞的研究的 叙述而言也比较凌乱,不方便研究,现就卵母细胞的 发生及其调控方面的研究进展作一综述. 1卵细胞和卵泡的发生,发育 1.1卵细胞发生(Oogenesis) 动物卵细胞发生就是卵细胞的发育和成熟的过 程.卵细胞发生是在卵巢内进行的,经过增殖期,生 长期及成熟期3个发育期. 1.1.1增殖期哺乳动物在胚胎时期由卵黄囊内 胚层经过变形运动沿后肠系膜迁移到生殖腺的原始 生殖细胞.'],在性别分化后形成卵原细胞,经过一 定次数的有丝分裂以增加同类型细胞的数量,卵原 细胞问存在细胞间桥.当卵原细胞形成初级卵母细 胞时,细胞间桥消失,卵原细胞分开.哺乳动物卵巢 内卵原细胞增殖及形成卵母细胞都是在胎儿出生前 或出生后不久完成的.哺乳动物卵巢内含有大量的 原始卵泡,其数量因物种和发育阶段的不同而异.如 出生时小鼠约为1万个,人和家畜约为几百万个.到 初情期时,小鼠约为4000个,绵羊,牛约为10万多 个,猪约为4O多万个.人胎儿发育到5个月时,卵巢 中含有200万个卵原细胞和500万个初级卵母细 胞,此后,大多数卵原细胞死亡,到胎儿出生时卵巢 含有初级卵母细胞约1O0万个,其中绝大多数已进 入第1次减数分裂前期的双线期.出生后初级卵母 细胞继续退化,死亡,至青春期时,初级卵母细胞只 有3,4万个. 1.1.2生长期初级卵母细胞进行生长发育,积 收稿日期:2005—08—03 作者简介:张珠明(1975一),男,宁夏盐池人,讲师.硕士研究生,主要从事动物解剖学 和组织学研究 88农业科学研究第27卷 累各种营养物质,进行卵质分化及结构建造,合成和 贮存胚胎早期发育所需的各类信息.由卵原细胞形 成初级卵母细胞.首先是细胞核开始发生减数分裂 前期染色体的变化,大多数脊椎动物初级卵母细胞 的第1次成熟分裂进行到前期的双线期即停止,进 入延长的双线期.生长期的卵母细胞核内核仁增大 增多,合成活跃,细胞核膨大,称为生发泡(Germinal vesicle,GV).胞质中合成并贮存核糖体及各种核糖 核酸,它们结合转译各种不同的结构蛋白,在高尔基 体合成皮质颗粒,线粒体大量增加,初级卵母细胞体 积增大,在多黄卵中营养物质的积累使得细胞体积 可增加200倍. 1.1.3成熟期初级卵母细胞完成生长后,要进行 两次成熟分裂.第1次成熟分裂为减数分裂,形成1 个次级卵母细胞和1个体积很小的第1极体.第2 次成熟分裂为有丝分裂方式,形成1个卵细胞和1 个第2极体.脊椎动物在整个减数分裂过程中有两 次停滞现象.第1次是在第1次成熟分裂的前期 (ProphaseI,MI)的双线期(哺乳动物多出现在出 生前后,形成卵泡贮库),该期卵母细胞有一大的生 发泡,通常是由激素的作用而解除.在脑垂体分泌的 促性腺激素的作用下,分裂恢复,卵泡分泌的类固醇 激素(雌激素)活化了卵母细胞中的促成熟因子 (MaturationPromotingFactor,MPF),它是M期 蛋白激酶,能促使染色质浓缩,核膜崩解和纺锤体形 成,是有丝分裂的促进因子.完成减数分裂后,MPF 活性消失.卵母细胞质中含有一种蛋白质,称为细胞 静止因子(Cytostoticfactor,CSF),它能维持周期素 (cyclin)的磷酸化,使它不被降解,从而维持M期蛋 白酶的活性,使细胞出现第2次停滞,停顿在第2次 减数分裂中期(MetaphaseII,MII)等待受精.卵 受精或孤雌激活后恢复有丝分裂,细胞内Ca抖浓度 迅速增加,致使CSF活性消失,周期素被降解,MPF 活性消失,细胞离开M期形成成熟的卵子参与受 精.各类动物的受精是在卵子发生的不同时期进行 的:?初级卵母细胞,如扁形动物,部分环节动物及 软体动物等;?第1次成熟分裂中期,如部分环节动 物,软体动物,多数昆虫等;?第2次成熟分裂中期, 如文昌鱼,脊椎动物等;?第2次成熟分裂完成,如 腔肠动物,棘皮动物等. 1.2卵泡的发育 卵巢中的卵母细胞在发育的过程中并非是独立 的发育,而是和包在其外周的卵泡细胞共同形成卵 泡,以各期卵泡的形式共同发育,伴随着卵泡的变化 卵母细胞得到发育. 1.2.1卵泡的类型在卵泡的发育过程中,根据卵 母细胞的状态,卵泡细胞的形态及数目,透明带的有 无以及卵泡腔的有无,可以将卵泡分为原始卵泡,初 级卵泡,次级卵泡(腔前卵泡),3级卵泡(有腔卵 泡),成熟卵泡.排卵发生后会出现血体,黄体及白 体,卵泡发育过程中则会出现许多闭锁的卵泡. 1.2.2卵泡波胎儿出生前后(灵长类,反刍类在 胎儿时期,啮齿类在新生期)形成的大量的原始卵泡 均匀分布于卵巢的白膜之下,形成卵泡贮库.原始卵 泡发育至排卵前,直径可以增长400,600倍,每次 发情周期中有5001000个原始卵泡生长,但只有 数个优势卵泡发育.动物一生中99.9的原始卵泡 注定在开始发育后闭锁,只有数百个发育至成熟]. 卵泡的发育与发情周期类似,但也有周期性变化,在 每个周期中,卵泡发生的过程由下列3个阶段构成: ?补充或募集(recruitment):一群卵泡获得了对 促性腺激素发生反应的能力,并严格依赖于这些激 素以维持其继续生长;?选择(selection):仅有数 个补充卵泡被选择上并继续存活,该卵泡通常称作 优势卵泡,多余的补充卵泡则闭锁,以保持该动物品 种典型的排卵数目;?优势化(dominance):排卵(或 优势)卵泡在抑制其他卵泡生长的基质中存活,发育 及成熟.我们将每一组卵泡的这种周期性的发育过 程叫作卵泡波,牛的每个发情周期中卵巢上会出现 2个或3个卵泡波,对某头牛来讲,其卵泡波是以2 波为主还是以3波为主,以及这两种周期是否会交 替发生,还没有研究报道.2波周期的长度为20(0, 10)d,3波周期的长度为23(O,9,16)d. 2卵泡发育的调控 对于卵泡在发育的过程中为什么会出现3个阶 段,机理研究的不是很透彻,影响因素在各个阶段又 有所不同.卵泡发生的调节机制非常复杂. 卵巢内还存在着大量激素的或非激素的调节因 子,通过旁分泌或自分泌,对卵泡的生长,发育,成熟 也起着重要的调控作用. 2.1卵泡募集的调控 以往的研究表明,虽然腔前卵泡的生长并不完 全依赖于促性腺激素的作用.但垂体分泌的促性腺 激素对原始卵泡的生长启动具有促进作用口].FSH 可使颗粒细胞和卵丘细胞的有丝分裂指数增加,使 颗粒细胞问的间隙连接增加,从而促进腔前卵泡的 发育.此外,雌激素对该过程也有促进作用甚至是决 定性作用.一组原始卵泡,如果其中有1个卵泡分泌 比其他卵泡较多的雌激素,这个卵泡将进入良性循 第1期张珠明等:卵细胞的发生和调控89 环状态,最终成为优势卵泡].目前,有关原始卵泡 初次募集调控机制的研究主要集中在卵巢局部生长 因子和细胞连接等方面.目前发现的卵巢局部因子 有:血管形成因子,类肾素活性物,黄体化抑制因子, 促性腺激素分泌波抑制因子,FSH结合抑制因子, lH结合抑制因子,卵母细胞成熟抑制因子,卵泡调 节蛋白,GnRH类似物,类FSH抑制素,FSH释放 蛋白,纤维蛋白酶原活性物,葡糖胺聚糖,P物质,胎 盘蛋白,胰岛素,前肾素,松弛素,催产素,抑制素,蛋 白多糖,周期蛋白前体,抗缨勒氏激素,促乳素,成纤 维细胞生长因子,转移生长因子,表皮生长因子,胰 岛素类生长因子等]. 上述大部分调节因子可能是每个卵泡分泌的代 谢产物,也可能是闭锁卵泡退化的副产物,它们起着 抑制卵泡机能,引起闭锁的作用.显然,闭锁在卵巢 中占主导地位.而且卵泡可以合成分泌调节因子以 促进该作用.针对作用于原始卵泡的发育而言,卵巢 局部生长因子大致可以分为两类:原始卵泡生长促 进因子和生长抑制因子I6j. 2.1.1原始卵泡生长促进因子包括干细胞因子 (SCF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),白血病 抑制因子(LIF),生长分化因子一9(GDF一9),神经生 长因子(NGF,即促神经生长素,NT)等. 2.1.2原始卵泡生长抑制因子抗苗勒氏管激素 (AMH)属于转化生长因子超家族成员,在出生后 小鼠和人卵巢的颗粒细胞内产生,是目前发现的唯 一 原始卵泡生长抑制因子.AMH基因缺失小鼠出 生前原始卵泡形成无明显异常,但是出生后大量原 始卵泡迅速开始生长转化,明显多于AMH基因正 常小鼠.到出生后13个月时,AMH基因缺失小鼠 卵巢内已经见不到原始卵泡,与此同时出现大量发 育到晚期阶段的腔前卵泡和窦状卵泡.Durlirlger等 在体外培养新生小鼠卵巢发现,加入AMH后原始 卵泡生长减少,卵泡募集受阻,与此同时卵巢内抑制 素产生增加l7].因此推测,AMH通过调节卵巢局部 抑制素产生来阻止原始卵泡生长启动,从而作为原 始卵泡生长的抑制因子. 2.1.3原始卵泡细胞连接和信息间的传递组成 原始卵泡的细胞(卵母细胞和颗粒细胞)之间建立了 非常广泛的细胞连接,这些细胞问的连接参与卵泡 细胞之间的信息传递和原始卵泡募集的调控.细胞 黏附对于细胞的生长分化起着非常重要的调节作 用.研究发现,黏附分子E一钙黏素(E—cadherin)在原 始卵泡和早期初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞表 达.随着原始卵泡生长发动,E一钙黏素首先在卵细 胞,随后在颗粒细胞表达消失.同样P一钙黏素(P— cadherin)表达于原始卵泡的颗粒细胞和卵细胞,但 是在腔前卵泡的卵细胞减少或者消失,钙黏素蛋白 在原始卵泡的表达及其变化提示E一钙黏素和P一钙 黏素可能参与早期卵泡生长始动的调节.连接素 (connexin,CX)蛋白是构成细胞间缝隙连接的主要 成分和标志物.研究报道,CX43在原始卵泡不表 达,但是在初级,次级以及腔前卵泡的颗粒细胞表 达.CX26出现在原始卵泡,初级和次级卵泡以及健 康腔前卵泡的颗粒细胞及卵泡膜细胞.进一步观察 发现,连接素亚单位在幼年以及成年小鼠卵巢内的 表达,发现从原始卵泡到排卵前卵泡各个阶段均有 表达,而且不同亚单位出现在卵泡的不同部位,并与 卵泡生长阶段有关.因此,多者认为缝隙连接有 可能对原始卵泡生长转化起调节作用j.原始卵泡 的细胞(卵母细胞和颗粒细胞)之间存在多种信息传 递途径.一类是以卵巢局部的活性因子为介质,通过 旁分泌机制调节卵泡细胞之间相互作用,从而启动 原始卵泡持续分批从静止状态进入生长成熟周期. 另外,原始卵泡细胞之间建立了多种类型的细胞连 接,也是细胞之间相互传递信息的途径,同样参与调 节原始卵泡的生长发动.原始卵泡的细胞之间信息 传递和调节是双向的.卵细胞通过产生细胞因子(如 转化生长因子超家族成员GDF一9,BMP等)调节颗 粒细胞生长分化.同样,颗粒细胞通过SCF等作用 于卵细胞,启动原始卵泡募集.在卵泡生长发育过程 中,卵细胞不断生长,体细胞不断增殖和分化,卵泡 内各细胞分化和它们之间的相互作用越来越成为研 究卵泡生长启动的焦点]. 2.2卵泡选择和优势化的调控 经过募集的卵泡会在一些因素的影响下被进一 步地选择进而优势化,这一过程的进行和下列因素 有关. 2.2.1腔前卵泡对促性腺激素固有的反应能力在 各类动物腔前阶段均可观察到闭锁,所以,优势卵泡 的选择可能始于腔前阶段.卵泡开始生长大概不是 同期进行的,因此,所有生长卵泡在补充期间可能不 是处于同一个发育阶段.虽然理论上讲,每个卵泡在 补充期间获得等量的促性腺激素刺激,但是正在生 长的腔前卵泡不能继续生长的一个原因可能是每个 卵泡中颗粒细胞或内膜细胞数量或促性腺激素受体 数量细微梯度差异的结果.对促性腺激素反应的卵 泡的数量可能取决于募集时刺激的强度(即促性腺 激素的量)和每个卵泡反应的固有能力. 2.2.2大卵泡的抑制作用募集卵泡群中,正在成 90农业科学研究第27卷 熟的最大卵泡干扰了较小的,较不成熟的卵泡获得 足够促性腺激素支持的能力.目前认为有两条作用 途径[10]:?主动途径——分泌抑制因子:正在成熟 的最大卵泡分泌抑制素和雌二醇(E.),优势卵泡中 高浓度的E与FSH相互作用刺激IGFI产生,后 者放大了FSH对优势卵泡的作用,通过降低其他卵 泡对FSH的敏感性,抑制颗粒细胞中类固醇的发 生,从而抑制了其他卵泡的生长.此外,尚存在着另 一 种可能性,即在卵泡发生期间,由于微血管结构的 差异,有腔卵泡接受了不等量的促性腺激素,导致大 卵泡选择性生长.有试验表明,该途径不存在于绵 羊,所以在实践过程中,这可能是绵羊的排卵率较牛 难以提高的原因之一.再有,优势卵泡的颗粒细胞上 存在LH受体,由于FSH和LH均通过cAMP发 挥作用,所以在LH分泌高的周期阶段,IH受体的 发育可能有助于维持优势卵泡中cAMP的较高水 平,从而补充了FSH浓度下降所引起的cAMP浓 度的下降;?被动途径——反馈系统:正在成熟的 最大卵泡往往较早出现颗粒细胞,且数量较多,从而 较其他卵泡分泌更多的抑制素和Ez,它们通过长的 负反馈调节抑制垂体分泌FSH,使后者的浓度降到 维持其他卵泡所必需的阈值以下,抑制了较不成熟 卵泡的生长,间接达到了选择优势卵泡的目的?. 3卵母细胞发育过程中的结构变化 家畜的卵细胞属于少黄均黄卵,极性不明显,从 卵巢排出的卵(次级卵母细胞)呈球形,直径是牛约 100tim,绵羊约120tim.细胞核为球形泡状,染色质 少,核仁清楚.胞质内有少量分布均匀的卵黄颗粒, 还有内质网,线粒体,高尔基复合体等细胞器.卵细 胞质的表层呈凝胶状,特称皮质.在哺乳动物的皮质 中含有一种特殊的皮质颗粒.卵细胞外周为透明带, 放射冠.电子显微镜下,卵泡细胞伸出胞突与卵母细 胞的微绒毛状的突起联系.卵母细胞的进一步发育 的过程,实际上更多的是在体外培养的条件下研究 的,再次发育的结构变化综述如下. 3.1细胞核的变化 3.1.1生发泡破裂体外培养数小时后,成熟期的 卵母细胞在外来信号的刺激下,恢复减数分裂,在光 镜下可见细胞核膜破裂,核仁消失,核内物质与核质 混合,此过程即为生发泡破裂(GerminalVesicle BreakDown,GVBD).不同动物卵母细胞发生 GVBD的时间并不一致,例如大鼠需2,4h,猪需 18"~24h,山羊8h,牛一般需要8h{_引. 3.1.2染色体凝集减数分裂期间,卵母细胞染色 体(双倍体)经历中期I,后期I和末期I,排出第1极 体后停滞于中期I1.双线期染色体扩散,进而显着凝 集在核膜内缘,与核膜分解同步进行.在此期间,染 色质变为异染色质并包含很致密的颗粒,加剧了染 色体凝集【.在对山羊的研究中发现,从单层颗粒细 胞包围的卵母细胞到早期有腔卵泡的卵母细胞,其 核仁为由颗粒性染色质丝不规则缠绕而形成的网状 结构,其间有许多空泡.当卵泡直径为0.5,1.6mm 时,核仁中出现很多电子致密度较低的纤维中心,随 后,空泡消失,核仁发生致密化[1J.核仁致密化的时 间随动物不同而不同j.小鼠在卵泡腔形成之前发 生核仁致密化,猪发生在早期有腔卵泡.核仁的致密 化伴随着rRNA合成的急剧下降,使核仁由RNA 的合成场所转变为RNA的贮存场所.在卵母细胞 发育过程中,核孔越来越明显,密度增加,而核周隙 越来越难以分辨. 3.1.3卵母细胞质膜和透明带的变化单层扁平 颗粒细胞包围的卵母细胞,其质膜表面光滑,质膜与 颗粒细胞相贴没有桥粒连接.由立方颗粒细胞包围 时,卵质膜上开始出现短小的微绒毛.当颗粒细胞变 成两层时,开始出现透明带,微绒毛伸入透明带内.卵 泡腔出现时,透明带增厚,微绒毛多且长,垂直插入透 明带内.颗粒细胞的突起穿过透明带,到达卵细胞,其 末端膨大部分嵌入与之相对的卵质膜的凹陷内,并形 成桥粒.直径为2mm的牛卵泡和0.5,1mm的山羊 卵泡中的卵母细胞,透明带内的微绒毛开始变短变 粗,并逐渐从透明带退出.卵母细胞成熟后,微绒毛全 部倒伏在卵表面上,极体释放部位的微绒毛密度降 低[2.].随着卵母细胞的体外成熟,透明带上精子受体 (ZP.,ZP,ZP.)发生重排,透明带外层呈网状,其内层 附着有已断裂的微绒毛和卵丘细胞的胞质的突起,同 时透明带变软L4]. 3.2细胞器的变化 在卵母细胞生长发育过程中,细胞质成分经历 了一系列变化,特别是细胞器发生了许多变化.总的 变化规律为:随着卵母细胞的发育,各种细胞器向皮 质区迁移.细胞成熟后,除皮质颗粒外,其他细胞器 又向卵子中央迁移. 3.2.1线粒体体内成熟卵中,线粒体聚合体分布 于整个胞质,而在大多数体外成熟卵中,在卵的中央 质未出现线粒体,因此体外成熟条件可能导致线粒 体不能完全移至中央,从而影响卵的胞质成熟l】引. 山羊初级卵母细胞中[】],线粒体多为圆形,峭较少, 多为环形.随着卵母细胞的增长,卵母细胞内的线粒 体数目增加,线粒体基质电子密度也增大,以后线粒 第1期张珠明等:卵细胞的发生和调控9l 体开始向带帽线粒体转变,所有的线粒体都转变为 带帽线粒体,这种线粒体电子密度很大,大小和形态 各异,在一端形成帽状腔,内有内质网泡伸入.这时, 线粒体与其他细胞器大多分布在卵母细胞的皮质 区,中央区细胞器很少,但卵母细胞成熟以后,线粒 体等细胞器从皮质区向中央区扩散,三五成群分布 于整个细胞质中.牛卵母细胞的线粒体也发生类似 的变化L1引.猪卵母细胞的线粒体也由最初的位于核 周围逐渐移向皮质,成熟时分散于细胞质中,但并没 有发现帽状线粒体的存在[1. 3.2.2内质网在卵母细胞发生过程中,早期的卵 母细胞胞质中,有少量的粗面内质网分布,以后随着 发育,滑面内质网和一些囊泡不断增加.接着,粗面内 质网的数量也不断增加,并且常常与线粒体有联系. 当卵母细胞接近成熟时,粗面内质网的数量显着减 少,最终消失.而滑面内质网及囊泡则比较多.滑面内 质网同样在皮质区先集中,再向中央区扩散E17,1a]. 3.2.3高尔基复合体在山羊的卵母细胞发育过 程中,高尔基复合体层也是分布于核周围的区域,比 较发达,由扁平囊和小泡组成,以后高尔基复合体向 皮质区迁移,当卵母细胞成熟以后,高尔基复合体也 逐渐消失. 3.2.4皮质颗粒的形成,迁移在大多数动物中, 皮质颗粒(CG)在精卵融合后发生胞吐,其内容物释 放,从而创造一个可以阻断多精入卵的胞外基 质H.在不同的动物中,皮质颗粒的数量,形态和内 含物都有差异.在猪的卵母细胞发育过程中,皮质颗 粒首先是在卵母细胞近核旁形成的.核旁有高尔基 复合体存在,高尔基复合体首先分泌产生皮质颗粒, 随后皮质颗粒开始向四周扩散.最后到达卵母细胞 的皮质区,并在质膜下排列成一排.在山羊的卵母细 胞发育过程中,也发现皮质颗粒首先在生长卵泡卵 母细胞出现并增多,开始时在卵母细胞皮质中成团, 然后逐渐向质膜下移动,最后,皮质颗粒均匀地在质 膜下成行排列. 3.3卵母细胞核质成熟 3.3.1卵母细胞成熟抑制卵泡的生长发育是一 个长期的过程,在体内由于卵泡液中抑制因素的作 用,在整个过程中卵母细胞核保持减数分裂停滞状 态,而胞浆则持续进行相关物质的合成与积累,如 RNA的转录,蛋白质的合成及摄取.这些物质将用 来支持卵母细胞成熟,受精,原核形成及胚胎生长发 育等的正常进行.随着卵母细胞体积的逐渐增大,胞 浆内合成和储备的物质也越来越多,直到卵母细胞 及卵泡体积达到峰值,胞浆内积累了足够的RNA 及蛋白质等物质.此时在性激素的刺激下,卵母细胞 恢复减数分裂,迅速进入第2次减数分裂中期 (M?).因此体内的卵母细胞胞质及核同步成熟, 具备完全的发育潜力.在体外,腔前卵泡的未成熟 卵不能自发恢复减数分裂,而有腔卵泡的卵母细胞 大多能自发恢复减数分裂,但由于缺乏抑制因素,成 熟过程加快,一般在培养的36,48h内达到M? 期,成熟后受精,卵裂,着床等能力明显降低.对小鼠 未成熟卵的研究显示,当卵母细胞达到最大直径 (75~80m)的8O9,6(6O,65m)时,在体外能完成 成熟过程,但受精后难以正常发育.直径从65"m到 75m递增时,其发育潜力逐步增强,着床及产仔率 逐渐增高.可见,卵母细胞生长的最后阶段的发育变 化对获得完全的发育能力是关键.此外,诱导小鼠精 子核解聚及雌雄原核形成的因子均在GV期形成和 积累.因此,体外成熟的卵母细胞发育潜力下降,可 能是因为其核成熟加快,GV期缩短,胞浆内物质合 成积累减少,因而胞浆内缺少一种或多种胞质,核及 胚胎发育所必需的因子. 3.3.2抑制剂对核质成熟的作用成熟抑制剂包 括次黄嘌呤,联丁酰基一cAMP(dbcAMP),3异丁基 甲基黄嘌呤(IBMX),环己酰亚胺,6一二甲基氨基嘌 呤(6-DMAP)等.次黄嘌呤,联丁酰基一cAMP, 3异丁基甲基黄嘌呤抑制cAMP的水解,三者均系 通过提高细胞内的cAMP水平,使MPF超磷酸化 而失活,抑制卵母细胞减数分裂的恢复.1993年, Kitagawa等在曲霉菌属的F25799的培养基中用酶 筛选出一种选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)抑制剂,命名为丁内酯I(butyrolactoneI, BI一I).BlI是嘌呤类的衍生物,主要抑制CDKs中 的cdc2,cdk2和cdk5三种激酶.BI一I和ATP竞争 性结合cdc2,阻止cdc2的去磷酸化过程,使MPF不 能激活,导致卵母细胞不能恢复减数分裂,保持在停 滞状态,因此可作为成熟抑制剂.同时,由于BI一I对 细胞内其他的激酶如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK),蛋白激酶C,蛋白激酶A等发生抑制的 浓度高于cdc2100倍以上,所以,在BI一I抑制MPF 活性时,不会抑制细胞内其他的激酶,理论上不影响 卵母细胞GV期的生理过程,是一种良好的研究卵 母细胞成熟抑制与发育潜能关系的工具. 3.4卵母细胞与卵泡细胞联系的变化 在原始卵泡时,卵泡细胞是一层扁平的细胞,随 着卵泡的生长,卵泡细胞迅速增殖,由单层变为多 层.卵泡细胞和卵母细胞通过伸出的突起穿过透明 带相互联系.到有腔卵泡时,卵泡液也是由卵泡细胞 1_I 92农业科学研究第27卷 产生的.卵泡细胞分为两部分:?为壁层颗粒细胞, 与基膜相连;?为包围卵母细胞的卵丘细胞.壁层颗粒 细胞与卵丘细胞之间,卵丘细胞与卵丘细胞之间以及 卵丘细胞与卵母细胞之间,存在着广泛的缝隙连接.卵 泡中的缝隙连接使壁层颗粒细胞,卵丘细胞和卵母细 胞共同形成一个结构和功能上的合胞体.卵丘细胞扩 展常用作判断卵母细胞体外成熟的特征,在人,猪,小 鼠,大鼠和绵羊等动物中,一般也把卵丘细胞扩展和黏 液化作为卵母细胞体外成熟的形态指标之一.卵丘细 胞扩展的原因可能是FSH和EGF刺激其产生并分泌 透明质酸,后者使得卵丘细胞扩展并黏液化.但也有人 认为,卵母细胞的成熟和卵丘细胞的扩展是两种无 关的生理现象,即使卵母细胞未成熟,卵丘细胞有时 也可能扩展口.根据卵丘细胞扩展情况可以制定牛卵 母细胞体外成熟的判断标准:1级成熟卵卵丘细胞完 全扩展,卵丘细胞团至少向外扩展3倍于裸卵直径 (300m).2级成熟卵为卵丘细胞中等扩展,卵丘细胞 向外扩展约2倍裸卵直径(200m).3级成熟卵为卵 丘细胞轻度扩展,卵丘细胞仍紧紧地粘贴在透明带 上[22,23].一般来说,绝大多数的1级成熟卵和多数的 2级成熟卵均已达到成熟状态排出第1极体. 4小结 对于卵母细胞发育及成熟的研究不仅具有重要的 理论意义,而且具有较强的实践意义.无论是在推进畜 牧业生产产业化方面还是在辅助生殖生物学中,对体 外成熟(IVM)+体外受精(IVF)+胚胎移植(ET)技术 的运用越来越显现出其重要性.可是卵母细胞及卵泡 在体内发育过程中的一些调节机制仍不明确,对卵母 细胞和卵泡发育起调节作用的因素仍然是研究的热 点.除上述提及的因素之外,多种生长因子和细胞因 子,以及卵母细胞体外培养方式,培养时间等与卵母细 胞发育及成熟有着直接或间接的重要关系.目前,在卵 母细胞的发育及成熟过程中,体外试验的结果如何更 好地应用于生产实践,仍然有待于进一步加强研究. 参考文献: [1]李宝仁.家畜组织胚胎学[M].北京:农业出版社, 1994:191. 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