气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量1(祁彪)(精)

气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量 1. 方法原理 中性糖和氨基糖在吡啶 -甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸 酐发生糖腈乙酰酯反应, 所得衍生物可利用气相色谱测定。由于土壤样品成分较复杂, 需要较多的 处理过程,本试验采用内标法(内标为戊五醇,可以有效地消除系统误差和样品损失所带来的误 差,增加实验的精密度和准确度。 2. 主要仪器 ?BEIFEN SP-3420A气相色谱仪, 配火焰离子化检测器 (FID, 北京北分瑞利仪器 (集团 有限公司; ?AT. SE-30型石英毛细管气相色谱柱(30m ×0.25mm ×0.25um 〔 100%二甲基聚硅氧烷;通 用型非极性固定相;热稳定性达到 350℃;化学键合交联柱,可用溶剂清洗;极性相似于 DB-1, SPB-1, HP-1等固定相;符合 USP G1, G2, G38指定固定相 〕,中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术 研究开发中心; ?RE-2000型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂; ?HP-5016SY 型氮吹仪,上海济成分析仪器有限公司; ?FreeZone 6 plus cascsdo型冷冻干燥仪,美国 LABCONCO 公司; ?DK-98-J 型电子恒温水浴锅,天津泰斯特仪器有限公司 ?Allegra 64R TD5A型台式高速离心机,美国 Beckman COULTER公司; ?DHG-9240型烘箱,上海一恒科学仪器有限公司; ?雷磁 PHS-3C 型 pH 计,上海精密科学仪器有限公司。 3. 主要试剂 8种中性糖标准 :核糖 (RIB、鼠李糖 (RHA、阿拉伯糖 (ARA、木糖 (XYL、葡萄糖 (GLU、半 乳糖 (GAL、甘露糖 (MAN和岩藻糖 (FUC ;均购自 Sigma-Aldrich 公司; 4种氨基糖标准 :氨基葡萄糖 (GLU-N、氨基半乳糖 (GAL-N、氨基甘露糖 (MAN-N和胞壁酸 (MUR,均购自 Sigma-Aldrich 公司; 内标:戊五醇(Adonitol ,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司; 其它试剂 :盐酸羟胺(Hydroxylamine hydrochloride,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司; 4-二甲氨基吡啶〔 4-(Dimethylamino pyridine〕,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司; 二氯甲烷(Dichloromethane ,色谱纯,天津市凯信化学工业有限公司; 乙酸乙酯(Acetic ether、正己烷(n-hexane ,均为色谱纯,山东省禹王实业总 公司化学试剂厂; 无水甲醇(Methanol ,色谱纯,天津光复精细化工有限公司; 吡啶、三氟乙酸(TFA ,均为分析纯,上海中秦化学试剂有限公司; 乙酸酐,分析纯,天津市化学试剂三厂; 盐酸,分析纯,白银西区银环化学制剂厂。 4. 溶液的配制 4. 1标准溶液和内标的配制: 8种中性糖和戊五醇的浓度均为 1 mg·mL -1, 水溶液配制 ; 四种氨基糖中除 胞壁酸 用无水甲醇配制 浓度为 0.5 mg·mL -1外, 其它均为 1 mg·mL -1水溶液 。 4. 2衍生试剂的配制: 4∶ 1的吡啶 -甲醇溶液,含有 32 mg·mL -1的盐酸羟胺和 40 mg·mL -1的 4-二甲基氨基吡啶。 5. 标液衍生: 氨基糖 :吸取 用无水甲醇配制的胞壁酸 溶液 150 ml,用氮吹吹干,各吸取其它三种氨基酸溶液 150 ml,加入到吹干的胞壁酸中溶解摇匀后,进行冷冻干燥,按照 6. 2所述方法衍生。 中性糖 :将配置好的上述水溶液,吸取 150ml ,直接进行冷冻干燥后,按照 6. 2所述方法衍生。 同时,对各标样单标按同法进行衍生。 6. 土壤样品的处理和衍生 6. 1中性糖和氨基糖水解及土壤样品前处理 (1 氨基糖。 将含有约 4 mg有机碳 (不少于 0.3 mg氮 的土壤样品置于水解瓶中, 加入 6 mol·L -1的 HCl 溶液 10 mL,加盖密封水解瓶,在 105 ℃下水解 8 h。冷却至室温后,加入 100 μg 戊五醇溶液 (内标 , 振荡摇匀后过滤。 滤液用旋转蒸发仪蒸干, 残余物溶解于 20 mL蒸馏水中, 并用 0.4 mol·L -1的 KOH 溶液调节 pH 值至中性(pH 6.6~6.8,然后以 3000 r/min离心 10 min去除沉淀。上清液用冷 冻干燥仪冻干,残留的固体物质用 3 mL无水甲醇溶解,再次离心 10 min以除去盐分。将上清液转移 到 5 mL衍生瓶中,用 N 2在 45 ℃下吹干,加入 1 mL水。然后再次进行冷冻干燥(8 h 以上。实验 中凡是盐酸参与的水解都采用此前处理方法。 (2 中性糖。 将含有约 4 mg有机碳的土壤样品置于水解瓶中, 加入 4 mol·L -1 的 TFA 溶液 10 mL, 加盖密封水解瓶,在 105 ℃下水解 4 h。冷却至室温后,加入 100 μg 戊五醇溶液(内标,振荡摇匀 后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干,残余物溶解于 20 mL蒸馏水中,并用 0.4 mol·L -1的 KOH 溶液调节 pH 值为 6.6~6.8, 然后以 3000 r/min离心 10 min去除沉淀。 取出上清液再次旋转蒸发干燥, 固体物质 用 4 mL蒸馏水溶解,然后转移到 5 mL衍生瓶中,进行冷冻干燥(8 h 以上。 6. 2衍生方法 向上述衍生瓶中加入 300 μL衍生试剂 〔前述 4.2〕 , 加盖密封, 在 75~80 ℃条件下加热 30 min, 其间振荡数次。冷却至室温后,加入 1 mL乙酸酐,密封再次加热 20 min。冷却后加入 1.5 mL的二 氯甲烷。 过量的衍生试剂通过以下两步来去除: 首先,加入 1 mol·L -1 d的 HCl 溶液 1 mL,激烈振摇 30 s后,移走上层液体。 其次,与上面步骤相同,用 1 mL的蒸馏水至少洗涤 3次,在最后一次洗涤过程中尽可能去除 水相。 剩余的有机相在 45 ℃下用 N 2吹干后,用 400 μL的乙酸乙酯 -正己烷混合溶剂(V /V =1∶ 1溶 解后转移至进样瓶中,即可进行气相色谱测定。 7. 气相色谱分析 载气为 N 2,流速 1.2 mL·min -1;进样量为 2.0 μL ,分流比为 30∶ 1; GC 进样口温度为 250 ℃,火 焰离子化检测器(FID 温度为 300 ℃。以峰面积内标法定量。 中性糖 分析色谱柱梯度升温程序为:柱温 175 ℃, 保持 4 min; 以 4℃ ·min -1的速度升温至 225 ℃, 保持 4.5 min;再以 30 ℃ ·min -1升温至 270 ℃,保持 2 min;最后以 30 ℃ ·min -1的速度升温至 300 ℃,保 持 2 min。 氨基糖 分析色谱柱梯度升温程序为:柱温 175 ℃,保持 4 min ;以 3.5℃·min -1的速度升温至 225 ℃,保持 5 min,再以 10 ℃·min -1升温至 270 ℃,保持 3 min;最后以 30 ℃·min -1的速度升温至 300 ℃,保持 2 min。 主要参考文献: [1]张 威,何红波,等 . 不同水解方法对土壤中性糖和氨基糖含量测定的影响 [J]. 生态环境, 15(5: 1067-1071. [2]ZHANG X, AMELUNG W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine,mannosamine, and galactosamine in soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28(9: 1201-1206. [3]Wei Zhang, Hongbo He, Xudong Zhang. Determination of neutral sugars in soil by capillary gas chromatography after derivatization to aldononitrile acetates[J]. Soil Biology & Biochemistry 39, 2007, 2665-2669. [4]WULF AMELUNG, MARTIN V. CHESHIRE and GEORG GUGGENBERGER. Determination of neutral and acidic sugars in soil by capillary gas-liquid chromatography after trifluoroacetic acid hydrolysis [J]. Soil Biol. Biochem. 1996, 28(12: 1631-1639. [5]张威 , 何红波 , 张明 , 张旭东 . 糖腈乙酰酯衍生气相色谱法测定土壤水解性单糖 [J]. 土壤通 报 , 2008, 39(4:913-916. [6]Guerrant G.O. and Moss C.W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetates derivatives by gas chromatography [J]. Analytical Chemistry 56 ,1984, 633-638.