OLP T淋巴细胞亚群
及T细胞分选和体外培养初步研究.pdf.doc
复旦大学
硕士学位论文
OLP T淋巴细胞亚群分析及T细胞分选和体外培养初步研究
姓名:赵黎 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:孙红英
20090320
胞 凋 亡 检测 显示, 传代培养第 , 欤 , δ芙 】 迪 赴 , , , , , , , ( , サ 腛 ,
, , , 颊 咄 庵 苎猅 细 胞 亚群分 析 表 明, , 颊 逤, , 细
胞 上 升, 即 , 种葡 赴 , ,
, 从 , , 庵 苎V蟹 掷氤龈叽 慷燃案 呋 盍Φ 腡 淋巴细 胞 ,
并可 成 功 进 行 体 外 培养
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缩写 词
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主要 组织 相 容 性 , , , , , , , , , 复 合 体
外 周 血单个核
细 胞
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和 ’苦
, , , , , , , , , 将 其 列 为 癌 前状态 ?, 。 口
腔扁 平 苔 藓 发病 率为
达 淋巴 细胞 功 能相
关 抗 原 研究。
,
本课 题 涉 及三
部分: 第 一 部分 :人 , , 庵 苎 猅
细胞 亚群 分 析
亚 群 变 化 情 况 的 研 究不 多 ,且 结论有不 同 之 处 ,为
此 ,本 研 究对 , , 颊咄庵 苎 V蠺 淋
,,研 究对
象
,,,患 者纳 入 标 准:
, , て 诠 媛 煞,? 钥刂撇 ?榈 南低承约膊, 自 身 免 疫 性疾
病 、糖 尿 病 、心 血 管疾
, , 个 月 内 使 用过抗生素 、
免 疫 制 剂 者;
,,主要 试
剂
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, 二 方
法
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,混
匀 ,, , , , , 尤 ,
, , , 流式 细 胞 仪数 据
获 取 和分 析
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蚮 , 尢 、 , , 著 ‘, , 差 片 , , ( , , ,, 表 , 及 流 式
枪测 图 , — ,
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淋巴 细 胞
,”,发 现 无 论是 早 期还 是
晚期病 变 ,
本 次实 验 发 现 ,,颊 咦 橥 庵苎V蠧 ,,与 正 常 对 照 组 外 周 血 相比有 明显升 高 ,
,,,,,現 ,,可 对 单 细 胞或 其 他 生 物颗
粒膜 表 面 以及 内部 的
,
众多研 究 表明, 馨 拖 赴 , 贠 , , 发病 中 发挥 重 要 作
用,关 于 口 腔 扁 平 苔 藓患者
, 赴 , 姆 掷 爰 芭嘌, 壳肮 , 谕 馍形 醇, 南妆 ǖ溃 , , 赥淋巴 细 胞 在扁 平 苔 藓发病 中
的 重 要 作用,我 们 认为,从 , , 颊哐 <白 橹 , 瓯 局 行 蠺淋巴 细 胞 分 选及 体外培养 和
免疫 分 析 具 有重 要 意义 ,有助于 进一 步了 解上 皮 及 免疫 细 胞 的 相互作用,明确疾病 的
发病 机 理 ,并 为后 期 进行 上 皮 一 淋巴 免疫 共建 打下基 础 。 三 蒸 水蒸
馏 器
,,培养
液
胎 牛 血
清
青霉 素 、
链 霉 素
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,,取 ,,离心 管 中 ,于 管 底加入 淋巴 细 胞分 离液, ,。
,,,磁珠 孵
育
, , 将分 离柱 从 分 离器 中 取 出,并 将其至 于 , , 离心 管 中 。
, , 匦 , 螅, , , ,
分 钟 。
, , 以 , , 培养 基 , 琁 , , , 胎 牛 血
清 , , 重 悬。
镜 下观 察 死 细 胞被 染成淡 蓝色 ,而 活 细 胞拒
染,根 据下式 计 算 细 胞活 力 :细 , , 观 察 其生长 情 况并 于 第 , , ,, , 天 行 倒 置 相差 显 微 镜 摄 像 。
, , , , 荧 光 抗体
, , 。
, , 吸 出 上 层 悬 液 后 再 重 复 操作 一
次 , 以 洗去多余抗体 。
, , 将, , , , ( , , 鱿 赴 , , 鲋 列
碌 , , 离 心 管 。 , 狥 , , ,
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实验 结
果
所下降 , 这是 由 于 分 离 和培养过程中一些细胞 失 去活力 并渐 渐 碎 裂 。 多数细胞 在第二
到 三天 发 生显著 变 化, 形 态上 表 现 为细胞 体 积 明显增 大 ,本 犊 稍 黾右槐 兑 陨 ,, 为圆
形 , 也 有 不规 则形 , 倒 置 显微镜 于 , 倍 下 可 见 小的 点 状深 色 团块 , , , 都 , , 倍 倒
置 显微镜 下 观 察 细胞 团块 , 可 见 细胞 成 聚 集 状态, 形 成 椭 圆 行 外 观 , , , , , 此时细
胞 具 贴壁 生 长 和 集 群 生 长 能 力 , 并随 时间 推 移 集 群 生 长 占优 , 形 成 肉 眼 可 见 的 由 几 十
一
:
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大
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,:增 加 。 附 凋 亡 检 测 数值 表 ; , 馨拖赴 , 蛲 黾 觳饬 魇酵, , , ,
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匹
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胞 的增 殖、 分化 和活 化 , 增 强 靶 细 胞 的功 能 。 , , ,
,
后 期 可 形 成 大 的细 胞 团。 传 代 后 细 胞 生 长 加 快, 后 期 细 胞 增 殖分裂 能 力下降 , 细 胞 团
块分解 散开细 胞 死 亡 , 传 代 目的主 要 为 搅 散大 的细 胞 集聚团块, 有利 于 细 胞 与 培养液
的充 分接 触 , 利 于 细 胞 生 长 , 避 免因营 养缺 乏 而导 致 的细 胞 死 亡 , 大 细 胞 团块经过 搅
动 后 变 为 分散的细 胞 或小 细 胞 团, 可 再 次 集聚生 长 , 但 是后 期 单 个 细 胞 不 易生 长 , 易
细 胞 碎 解 死 亡。
,
原 理 为 , 正 常细 胞 膜 磷 脂 的分布 是不 对 称 的, 膜 内 表 面含负电 的磷 脂 , 如 磷 脂 酰 丝氨酸
, , , , , , , , , , 琍 , , 而膜 外表 面绝 大 多数为 中 性磷 脂 。 在细 胞 凋亡 早 期 , , 从
细 胞 膜 内 侧翻 转 到 细 胞 膜 的表 面, 暴露 在细 胞 外环境 中 , 。 , , , , 是一种 分子 量 为
, , , , , 的, , 依 赖性磷 脂 结合蛋 白, 能 与 , 高 亲和力特 异 性结合。 将 , , , , 进
行 异 硫氰 酸荧 光 素 , , , , , ,
这样 就可 以将 早 、 晚期凋亡 细胞 和
死 细胞 区分不 来 。
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第 一 部 分
存待用 。 进 行病理 组 织 检 查 组 织 块 置 于 ,,福 尔马 林 中 待用 。
,,组 织 块 操 作方 法 :
实验 结
果
口 腔 组 织 块 经 过 中 性 蛋 白酶消化 去 除 上 皮 层 后,
再 经 过 机 械分 离 和 酶消化 后过 滤
,
讨 论
,掷 胍,?,。 肿 瘤组 织如 肺癌 中 淋 巴细 胞分 离常首 先 通过 机 械 剪 碎后,在胶 原酶消 化后,通过 滤 网 获得 单
分 离液 之 间收 集淋
巴细 胞?盯。 分 析, ,橹, ?砀 谋 淇芍 # 琌 ,为 基 底膜 区 角 化细 胞变
性,上 皮 基 底膜 崩 解 ,
上 皮 下 , 赴 , 秩 蟆 , 虼 艘 ;竦肨 淋 巴细 胞首 先 应 该除 去 上 皮 层 ,暴露上 皮 下 层 的淋
巴细 胞,再 通过 机 械 和 酶消 化 作 用游 离暴露的淋 巴细 胞。 除 去 上 皮 层 的优 点为 ,能减
少 后面 操 作 中 上 皮 细 胞混杂于 后续 细 胞悬 液 中 ,并 在较 保 留 上 皮 层 的直 接 剪 碎消 化 更利于 淋 巴细 胞提 取 。 揭去 上 皮 层 后增 大 消 化 酶和 剩 余 在这 一 部分 我们 运用中 性蛋 白 酶
上 皮 下 组 织 的接 触 面 积 ,有 利于 上 皮 下 淋 巴细 胞的游 离。 缺 点主要 是 在上 皮 层 内 有 浸
实验 中 发 现,经 过 酶消 化和 机 械 消 化后细 胞得
量 不 足 ,镜 下 观察 发 现细 胞杂乱
, , 颊 咄 庵苎猅 细 胞 亚群分析 表 明 , , 颊 咦橥 庵苎V
蠧, , 与 正 常对 照组 外
养 时间 过 长所 致 凋亡 增 加影 响
其特 异代 表性。
量 上 的 损 失 和细 胞 活力的 降 低 , 都 给 后 期实 验操 作和分析 带 来 很 大 困难 。 实 验条件还
本 研究的 特 色
与 创新
, 馨 拖 赴 , 逋 馀 嘌, 逑 担 , ? 诖舜 问笛
橹 卸 訲 淋 巴 细 胞 进 行相
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, 隣, 相关的 免
疫 细 胞
, , , 芴 錞
,
, 引 发角 化 细 胞凋 亡 , 当
然这一 凋 亡 过 , 趋化 因子 , , , 土 街諧, 趋化 因子 , , 虸, , 。 体外培 养 的 经 过 , , 激活 的 的 人口
发展 的 关系 仍有待进
一 步研究。 ,, , , 猋
的 含 量 , А, , , 可 通 过 上 调 , , , ,
编 码 免 疫 和 前 炎 症介质基因, 提示 , ,
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