Dmrt1基因敲除对罗非鱼精巢发育及减数分裂的影响

Dmrt1基因敲除对罗非鱼精巢发育及减数分裂的影响 Dmrt1 基因敲除对罗非鱼精巢发育及减数 分裂的影响 李明辉杨惠惠李梦茹孙运侣王婷茹石红娟王德寿 5 10 15 20 25 30 35 西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室重庆 400175 摘要转录激活因子样效应物核酸酶Transcription activator-like effector nucleasesTALEN 是目前最有发展前景的基因组修饰技术Dmrt1 是脊椎动物精巢分化和维持的关键基因本 文在养殖鱼类尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus建立了 TALEN 靶向基因敲除技术通过 对 Dmrt1 基因敲除结果发现TALEN 能高效约 37的对 Dmrt1 基因进行编辑包括删 除不同碱基数目7910 等的突变类型4 月龄 Dmrt1 敲除个体性腺组织学观察显示 精巢不能正常发育如不能正常起始减数分裂因此少有甚至没有对照组精巢中所见的精母 细胞精细胞和精子仅见大量精原细胞部分退化区域甚至出现卵母细胞同时未见曲 细精管免疫组化结果显示 Dmrt1 敲除个体精巢中检测到芳香化酶合成雌激素的关建酶 的表达而没有检测到胆固醇侧链裂解酶 P450scc 的表达以上结果表明像哺乳动物一样 Dmrt1 在硬骨鱼类精巢的正常分化发育以及精原细胞减数分裂起始中起重要作用 关键词水生生物学TALEN基因敲除Dmrt1减数分裂罗非鱼 中图分类号Q786 Dmrt1 knockout by TALENs on testicular development and meiosis in Nile tilapia Oreochromis niloticus LI Minghui YANG Huihui LI Mengru SUN Yunlv WANG Tingru SHI Hongjuan WANG Deshou Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development Ministry of Education School of Life Science Southwest University ChongQing 400715 Abstract Recent studies have demonstrated that transcription activator-like effector nuclease TALEN is the most promising genome modification technology Dmrt1 is the key factor involved in testicular differentiation and maintenance In the present study targeted gene disruption of Dmrt1 was performed in the Nile tilapia Oreochromis niloticus using TALENs The efficiency was about 37 including different bases deletions 7 9 10 etc Histological observations of the 4-month-old Dmrt1 knock-out tilapia testis showed that it was developed abnormally with all germ cells being spermatogonia with a few or even without any spermatocytes spermatids and sperms and without any seminiferous tubules In addition the central area of the testis was degraded to form a large cavity Furthermore some oocytes were appeared in the partially degraded area Immunohistochemistry analysis showed that on the contrary to the control testis aromatase the key enzyme responsible for the synthesis of estrogen was observed in the Dmrt1 knockout testis while P450scc expression was not observed Our results indicated that like in mammals Dmrt1 plays an important role in testicular differentiation and development and germ cell meiosis initiation in teleosts Keywords Hydrobiology TALEN Knockout Dmrt1 Meiosis Tilapia 40 0 引言 哺乳类基因功能的研究主要依赖于基因敲除和转基因技术从失去功能和获 得功能正反 两个方面来分析基因功能随着越来越多物种的基因组完成测序解读基因组 的功能显得日 基金项目教育部博士点基金20090182110008国家自然科学基金重点项目 31030063科技部973 项目2010CB134405和863项目2011AA100404 作者简介李明辉1986-男主要研究方向动物分子生物学 通信联系人王德寿1964-男教授主要从事鱼类性别决定和分化的分子机制 研究E-mail wdeshoucom -1- 益重要基因组靶向修饰是进行基因组改造与基因功能研究的一个重要手段 然而目前仅 45 50 55 60 65 在模式生物小鼠Mus musculus[1]和果蝇Drosophila melanogaster[2]等少数物种中建立 了较为成熟的基因敲除技术而绝大多数物种在这方面尚缺乏有效的技术手段因而严重阻 碍了这些物种基因功能研究的深入目前这些较为成熟的研究技术如同源重组大多依 赖于干细胞鱼类由于缺乏完善的干细胞技术尽管在模式动物斑马鱼通过同源重组[3]和转 座子技术[4]实现了基因敲除但效率极为低下在斑马鱼和青鳉比较盛行的是基因敲降 KnockdownAntisense Morpholino 和 Grip NA和 RNA 干扰RNAi技术但它们都存在 许多局限性模式生物尚且如此非模式生物如养殖鱼类基因功能的研究由于存在技术瓶颈 几乎都停留在克隆和表达谱的层面极少有基因功能的研究报道因此极大的限制了这些 经济物种的基因功能研究如何在养殖鱼类建立高效快速准确的基因组修饰技术成为水 产生物技术工作者面临的难题之一 锌指核糖核酸酶 Zinc finger nucleases ZFN和转录激活因子样效应物核酸酶 Transcription activator-like effector nucleasesTALEN介导的基因组 靶向修饰技术的出现 是对传统转基因技术的变革ZFN 已在小鼠[5]斑马鱼Danio rerio[6]黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco[7]等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中成功地实现了内源基因的定点突变然 而ZFN 的合成组装技术难度大易于对基因组进行非特异性切割而且对靶点切割效率 低与 ZFN 相比新出现的 TALEN 技术具有更广泛的 DNA 序列识别特性几乎不受 DNA 序列的影响并且具有更高的识别特异性[8]因此TALEN 成为最有发展前景的基因组修 饰技术已成功运用于斑马鱼[9]小鼠[10]家蚕Bombyx mori[11]果蝇Drosophila melanogaster[12]非洲爪蟾Xenopus lavies[13]和水稻Oryza sativa[14] 等多种动植物 近年来高等脊椎动物减数分裂调控机制研究取得较大进展研究表明 DMRT1 是调控 哺乳类雄性生殖细胞有丝分裂向减数分裂转变的关键因子[15]然而硬骨鱼类由于缺乏基因 功能研究手段这方面的研究还是一片空白TALEN 的出现为解决这一难题提供了新工具 Dmrt1 在脊椎动物性别决定中的作用非常保守的基因[16]在硬骨鱼类性别 决定和分化过程中 也扮演了关键角色[17 18] 本文一方面拟在养殖鱼类尼罗罗非鱼建立 TALEN 靶向基因敲除技术推动养 殖鱼类功能基 70 75 80 因组学的研究另一方面通过敲除 Dmrt1 基因探讨其在硬骨鱼类减数分裂和性别分化中 的作用 1 和方法 11 实验材料 本实验用尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus于 2007 年从日本国立基础生物学研究所 引进在西南大学重庆北碚培育建系性逆转假雄鱼XX?和性逆转雌鱼XY? 是分别通过芳香化酶抑制剂Fadrozole和雌激素17-estradiol从孵化后 3 天到 35 天处 理鱼苗得到XY?与 XY?受精获得超雄鱼YY?尼罗罗非鱼全雌XX?全雄XY? 受精卵由正常雌鱼XX?的卵子与超雄鱼YY?的精子分别受精后获得本实验室几 乎每天都能获得全雌或全雄受精卵 12 主要试剂和 TALEN 载体 限制性内切酶 Spe INhe INot IHind III 和 Cac8 ITaq 酶去磷酸化试剂盒CIAP 和 T4 DNA 连接酶试剂盒购自 Takara 公司日本大阪胶回收试剂盒无酶水和质粒提 -2- 取试剂盒购自 Qiagen 公司德国北威州体外合成注射用 mRNA SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit 购自 Ambion 公司美国加州胰蛋白胨酵母提取物NaCl琼脂粉 85 90 和苏木精等购自鼎国生物科技有限公司中国北京酚氯仿无水乙醇等为国产试剂 菌株 DH5 为本实验保存菌种本实验所用 PCR 特异性引物由上海英骏生物技术公司合成 中国上海免疫组化所用芳香化酶由 Cyp19a1a 编码和胆固醇侧链裂解酶 P450scc 抗体兔抗由日本国立基础生物学研究 Nagahama 教授惠赠[19]辣根过氧化酶标记的羊抗 兔二抗购自博士德生物科技有限公司中国武汉 构建 TALEN 载体所需的识别 4 种碱基ATC 和 G的载体和两个表达载体 pCS2-PEAS 和 pCS2-PERR由北京大学细胞增殖分化教育部重点实验室张博教授惠赠[9] 13 方法 com Dmrt1 基因敲除序列的设计 首 先 通 过 已 公 布 的 尼 罗 罗 非 鱼 Oreochromis niloticus 基 因 组 网 站 95 httpbroadinstituteorgftppubassembliesfish和 Dmrt1 开放阅读框序列AF203489 获得 Dmrt1 基因的全序列分离出外显子和内含子根据 TALEN 基因敲除靶序列设计原则 [20] 及 美 国 康 奈 尔 大 学 建 立 的 TALEN 设 计 网 站 httpbogcomateeduTALENTTALENT对 Dmrt1基因进行靶向识别序列的设计 找出合适的识别序列及靶序列 100 com TALEN 敲除载体的构建及注射用 mRNA 的合成 采用酶切-连接进行 2 -4 -8 -16 单元的连接构建 TALE 模块[9]载体采用 Hind III 和 Nhe I 进行酶切单元采用 Hind III 和 Nhe I 的同尾酶 Spe I 进行酶切37?酶切 3 h通过 12琼 脂糖凝胶电泳分离目的条带然后进行胶回收通过 T4 DNA 连接酶将载体和单元的回收产 物在 16连接 4 h42转化 DH5感受态细胞通过 pMD-18T 载体通用引物M13 105 110 115 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACM13- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行 PCR 验证筛选出阳性克隆提取的质粒送交上海生物工程技术服务有限公司中国上海 进行测序验证分别识别左臂和右臂识别序列的 TALE 模块构建完成后采用 Spe I 和 Nhe I 双酶切识别模块同时表达载体 pCS2-PEAS 和 pCS2-PERR 用 Nhe I 单酶切并去磷酸化 最后将识别模块和表达载体相连 首先利用 Not I 对表达载体 pCS2-PEAS-Dmrt1 和 pCS2-PERR-Dmrt1 进行线性化处理 加入终浓度为 5 SDS 和 80 μgμL 蛋白酶 K在 50下处理 30 min Qiagen PCR 胶回收 试剂盒进行纯化用无酶水将模板稀释至 500 ngμL注射用 mRNA 按照 Ambion 试剂盒步 骤进行合成并对其进行一些改进体系如下2×NTPCAP10 μL10×Reaction Buffer2 μLlinear template DNA1 μgSP6 Enzyme Mix2 μLRNase inhibitor05 μLNuclease-free Waterto 20 μL 总体积37孵育 2 h然后加 1 μL TURBO DNase 处理 DNA 模板 10 min 向反应体系中加入 30 μL LiCl 和 30 μL 无酶水置于-80中 20 min最后 4离心 30 min 吸去上清70乙醇洗涤一次加入 30 μL 无酶水进行溶解Nanodrop 2000 检测 RNA 浓度 及 OD 值同时对未构建识别序列的表达载体进行 mRNA 的合成用于对照实验 com 显微注射 120 将合成好的 mRNA 浓度稀释至 200 ngμLpCS2-PEAS-Dmrt1 和 pCS2-PERR-Dmrt1 按 -3- 照 11 的比例混合加入 1的酚红作为指示剂尼罗罗非鱼遗传全雄XY受精卵置于无 菌平皿中利用显微注射系统进行 1 细胞期注射注射剂量为每个受精卵约 400600 pg mRNA注射后的受精卵置于本实验室自制的 26恒温循环水孵化系统已申请发明专利 中进行孵化 125 com 基因组 DNA 的提取目的片段的扩增及酶切检测 待注射的受精卵孵化出膜后 7 天取 20 尾幼鱼进行 TALEN 活性的验证首先将 20 尾幼鱼混合并采用酚,氯仿法提取基因组 DNA通过在 Dmrt1 左右识别序列的上游和下游 分 别 设 计 基 因 特 异 性 引 物 Dmrt1-Forward GTTTCATCTCGCTCAGCAGCCAG Dmrt1-ReverseGGTCTGATGAGGTCGATGTAGCCG进行 PCR 扩增体系如下10×PCR 130 135 Buffer25 μLdNTP Mixture25 mM05 μLForward Primer10 μM05 μLReverse Primer10 μM05 μL基因组 DNA 模板1 μgTaq 酶025 μL加水至 25 μLPCR 循环参数如下94预变性 3 min9430 sec6230 sec7245 sec循环 30 圈 72延伸 10 min同时提取对照组和野生型个体的基因组 DNA扩增出目的条通过 12 琼脂糖凝胶电泳分离目的条带然后进行胶回收利用靶序列之间的酶切位点 Cac8 I 对回 收产物进行酶切电泳检测是否存在未切开的条带并加以测序确定构建的 TALEN 载体是否 具有活性 com Dmrt1 敲除阳性鱼的筛选 待受精卵孵化后 120 天取 18 尾鱼尾鳍无水乙醇脱水后采用酚,氯仿法分别提取 基因组 DNA扩增目的条带Cac8 I 酶切检测筛选出 Dmrt1 敲除阳性鱼并计算敲除效 140 率X 检测到的阳性敲除鱼尾数总检测鱼尾数 com 组织学检测 将解剖取得的性腺置于波恩氏液中固定过夜常规石蜡包埋切片厚度为 5 μm 苏木精和伊红显色二甲苯透明中性树胶封片光学显微镜下观察性腺组织学变化 com 免疫组化 145 150 155 取出阳性 Dmrt1 敲除个体性腺通过 Bouin 氏液饱和苦味酸 75 mL甲醛 25 mL冰醋酸 5 mL进行固定石蜡包埋连续切片厚度为 5 μm二甲苯脱蜡梯度酒精脱水至 75 乙醇后1×PBS 洗 5 次每次 5 min再用 3H2O280 mL 甲醇10 mL 1×PBS 缓冲液， 10 mL 30H2O2室温避光处理 10 min 以封闭内源性过氧化物酶然后再用 1×PBS 洗 5 次正常血清封闭 15 min滴加兔抗芳香化酶Aromtase由 Cyp19a1a 编码 抗体 37 孵育 30 min同时 PBS 洗 5 次滴加羊抗兔辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育 30 min PBS 洗 5 次DAB33N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride显色苏木精复染流水 冲洗 20 min 返蓝梯度酒精脱水二甲苯透明中性树脂封片奥林巴斯 BX51 显微成像 2 实验结果 21 Dmrt1 打靶序列的设计及突变后的序列检测 通过对 Dmrt1 基因进行靶向识别序列的设计结果显示 Dmrt1 基因在外显子上存在 18 对打靶序列由于 DM 家族存在多个成员Dmrt1Dmrt2abDmrt3Dmrt4 和 Dmrt5 且 DM 结构域非常保守约 80因此设计时避免了识别序列全部在 DM 结构 域上 -4- 以免造成脱靶效应我们选择第一个内含子和第二个外显子交界的地方14031456 图 1A左臂的识别序列长 17 bp序列为 CCCTTCCAGGTTGCTCT其中 CCCTTCCAG 160 165 170 175 180 位于第一个内含子右臂的识别序列长 17 bp序列为 CCCAAGCTCTTCTTCTT中 间间隔 17 bp 的打靶序列位于第二个外显子序列为 GAGGAGGCAGCAGGCCC其中有酶 切位 点 Cac8 I GCNNGC图 1ACac8 I 酶切结果显示对照组和野生型个体 DNA 条 带 452 bp完全被切开而实验组同时存在切开的条带199 bp 和 243 bp和未切 开的条带 425 bp图 1B未切开条带亚克隆测序得到的序列和对照组野生型比对结果显 示 位于打靶序列中存在缺失 791040132190 个碱基的突变体图 1C 图 1 罗非鱼 Dmrt1 打靶序列的设计及突变序列检测 Fig1 Schematic representation of tilapia Dmrt1 targeting sequence and detection of mutation sequences 注ADmrt1 基因结构打靶序列结合位点下划线部分以及酶切位点 Cac8 IB打靶位点突变 后不能被 Cac8 I 完全酶切野生型和没有构建识别序列的 FokI 对照鱼能 完全切开WT野生型FokI Flavobacterium okeanokoites type IIS 通过测序确定的突变序列C删除 A gene structure of Dmrt1 showing the binding sites underlined of the left and right TALENs and the restriction enzyme Cac8 I site in the spacer B the DNA fragments was partially digested after mutation in the spacer by TALENs while the wild type and the FokI fish can be completely digested by Cac8 I WT Wild type FokI Flavobacterium okeanokoites type IIS C Sequences of Dmrt1 mutations of the 20 fish Deletions are indicated by dashes FokI indicates the DD RR heterodimeric pair of FokI cleavage domains used as a control deletion 22 阳性敲除鱼的筛选和敲除效率统计 随机提取 18 尾鱼基因组 DNA通过基因特异性引物见方法 com分别扩增目 的条 带取等量1 μg回收产物用 Cac8 I 进行酶切结果发现 6 条鱼存在未切开 的条带图 2 -5- 进一步测序验证这 6 条鱼均为阳性敲除鱼其中 1 条鱼存在大量未切开的 条带仅少量条带 切开因此敲除效率约为 618 37 185 190 195 图 2 Cac8 I 酶切筛选 Dmrt1 敲除个体 Fig2 Detection of Dmrt1 mutations by Cac8 I digestion 注M分子量WT野生型M marker WT wild type 23 Dmrt1 敲除影响精巢的正常发育 对 4 月龄阳性 Dmrt1 基因敲除鱼精巢组织学观察HE 染色发现与正常 4 月龄对照 组精巢相比1 号鱼删除 10 个碱基精巢不能正常发育中间有一个大的空腔存在大 量精原细胞不能正常减数分裂基本上没有初级精母细胞次级精母细胞和精细胞Sertoli 细胞增生未见曲细精管图 3AB 和 C2 号鱼删除 7 个碱基精巢中也存在大量精 原细胞少量的次级精母细胞退化区域甚至观察到一些卵母细胞图 3DE 和 F4 月 龄正常鱼精巢中已具有精原细胞初级精母细胞次级精母细胞精细胞输精管等特征图 3GH 和 I -6- 图 3 4 月龄 Dmrt1 基因敲除个体的精巢组织学观察 Fig3 Histological observations of the 4-month-old control and Dmrt1 knock-out tilapia testis 注AB 和 C1 号鱼精巢组织学观察B 和 C 为 A 图局部放大DE 和 F2 号鱼 精巢组织组织学观 200 205 210 察E 和 F 为 D 图局部放大GH 和 I对照鱼精巢组织学观察H 和 I 为 G 图局部放大 Control对 照组SG精原细胞OC卵母细胞SO精母细胞SD曲细精管SP精细胞比例尺AD 和 G100mBH 和 I50mC25mE 和 F10m A-C sections from fish number 1 B and Chigh magnification of partial areas in A D E and F sections from fish number 2 E and F high magnification of partial areas in D G-I sections from control fish H and I high magnification of partial areas in G SG spermatogonia OC oocyte SC spermatocyte SD seminiferous duct SP spermatid Scale bar A D and G 100m B H and I 50m C 25m E and F 10m 24 Dmrt1 敲除上调芳香化酶下调 P450scc 的表达 免疫组织化学结果显示与对照组精巢相比图 4G4 月龄 Dmrt1 基因敲除的 精巢 中均检测到芳香化酶的阳性信号图 4ABD 和 E而芳香化酶是卵巢特异性表 达的类 固醇酶图 4H此外正常精巢中能检测到的胆固醇侧链裂解酶 P450scc图 4I 却 没有在 Dmrt1 敲除的精巢中检测到表达图 4C 和 F -7- 215 220 225 230 235 图 4 免疫组化检测芳香化酶和 P450scc 在 4 月龄 Dmrt1 基因敲除个体 的精巢中的表达情况 Fig4 Immunohistochemistry analysis of aromatase and P450scc expression in 4-month-old control and Dmrt1 knock out tilapia testis 注芳香化酶是卵巢特异表达的类固醇酶H而在对照组精巢中没有表达G但芳 香化酶信号出现在 Dmrt1 基因敲除的精巢中 ABD 和 E 相反类固醇酶 P450scc 主要在对照 组精巢中表达I在卵 巢中表达很低但在 Dmrt1 基因敲除的精巢中检测不到 P450scc C 和 F Control对照组比例尺A D 和 H50mCF 和 G25mB 和 I10mE35m Aromatase was detected in the Dmrt1 knock out testis A B D and E and the control ovary H while not in the control testis G In contrast P450scc was detected in the control testis I while not in the control ovary and Dmrt1 knock out testis C and F Control the control group Scale bar A D and H 50m C F and G 25m B and I 10m E 35m 3 讨论 精确的基因组修饰技术是功能基因组学研究的必备工具尽管基因打靶已在 模式生物如 小鼠等成熟运用但对非模式生物来说还是一大难题严重制约了基因功能的研究因此 如何建立高效精确的基因组修饰技术对非模式生物尤其经济物种如养殖鱼类来说显得 非常迫切我们早期通过转基因技术在雌性罗非鱼过表达雌性特异性基因 Foxl2 的显负性突 变体[21]取得了类似于丧失基因功能的初步结果但并非所有基因都能用此方法研究其功 能从总体上讲对养殖鱼类基因功能的研究遭遇技术瓶颈的制约因此亟待建立新的技 术平台ZFN 和 TALEN 是近年来新开发的基因组定点修饰技术通过在模式生物斑马鱼同 时采用 ZFN 和 TALEN 进行敲除结果表明 TALEN 具有更高的突变率和更高的 DNA 识别 特异性能够确保对基因组的任意位置靶点 DNA 的定点剪辑[22]虽然 ZFN 技术已在黄颡 鱼成功敲除 mstn 基因但对靶点 DNA 切割效率较低[7]因此目前未见 ZFN 应用于其他 养殖鱼类的基因功能研究最近TALEN 在模式生物斑马鱼取得成功[9]对研究基因功能 -8- 缺失具有重要意义TALEN 运用于养殖鱼类的研究还未见报道养殖鱼类尼罗罗非鱼的基 因组测序已完成当前急需对其中一些基因功能进行解读以便深入挖掘他们与性别决定和 240 分化的分子机制的关系从而为全雄罗非鱼苗种的生产提供理论依据和技术支持大大提高 罗非鱼水产养殖效益因此本研究首次在尼罗罗非鱼建立了 TALEN 靶向基因敲除技术 为进一步对其进行功能基因组学的研究奠定坚实的基础通过对 18 尾鱼的检测结果表明 Dmrt1 的敲除效率约为 37本实验室对 Foxl2Cyp19a1a 等基因的敲除效率均在 37左右 未发表数据说明 TALEN 应用于罗非鱼基因敲除具有高效性 245 因 Dmrt1 在硬骨鱼类精巢分化中起决定性作用是一个重要的精巢促进基因和 卵巢抑制基 [16-18] 和精细胞因此Dmrt1 缺失阻断了精巢的正常发育精原细胞不能正常进入减数分裂而 是维持在有丝分裂阶段表明 Dmrt1 可能对鱼类精巢减数分裂具有重要作用这与哺乳类 相似小鼠 Dmrt1 是精原细胞从有丝分裂向减数分裂转变的开关[15]这也反映出 Dmrt1 在 250 255 脊椎动物中对减数分裂起始的调控作用可能是保守的在脊椎动物包括鱼类雌性生殖细 胞减数分裂的启动时间通常早于雄性如雌性罗非鱼大约在孵化后dahdays after hatching 35 天进入减数分裂雄性大约在 75dah因此Dmrt1 也有可能通过控制减数分裂的时间来 影响鱼类性腺的分化 Dmrt1 敲除的精巢中出现类似卵母细胞样的细胞表明 Dmrt1 敲除可能会引起精巢向卵 巢的性逆转不能维持精巢的正常分化发育前期我们通过转基因在罗非鱼 XX 受精卵过 表达 Dmrt1 使其发生部分或完全性逆转[15]青鳉 Dmrt1 基因突变也会导致精巢向卵巢的性 逆转[23]此外高等脊椎动物人和鸡缺失 Dmrt1 也会造成性逆转[24 25] 不仅在脊椎动物精巢分化中起着重要作用同时也对维持精巢的发育具有重要功能雌激素 是鱼类卵巢分化的天然诱导剂[17 21 26]在性别决定的关键时期一旦性腺中有雌激素合成 260 265 270 275 不论其遗传性别如何都将发育为卵巢反之则发育为精巢雌激素水平又是受到其合成 酶-芳香化酶的表达水平所决定的在 XX 个体过表达 Dmrt1 可以直接抑制 Cyp19a1a 的转录 雌激素水平下降促使性腺向精巢分化[17]本研究通过免疫组化在 Dmrt1 敲除的精巢中检 测到芳香化酶的表达表明缺失 Dmrt1 可以上调芳香化酶的表达进一步说明 Dmrt1 是调 控 Cyp19a1a 表达的关键基因此外雌激素的出现也可能是导致出现部分性逆转的原因 P450scc 主要表达于精巢的类固醇酶卵巢中的表达量很低本研究在 Dmrt1 敲除的精巢中 没有检测到类固醇酶 P450scc 的表达说明性腺已经不是向雄性方向分化而是向雌性通路 转变 生殖细胞的分化是性别分化的一个重要方面生殖细胞的分化必然要经历减数分裂值 得注意的是由于生殖细胞的分化依赖于体细胞的分化Dmrt1 主要表达于罗非鱼精巢 Sertoli 细胞[27]Dmrt1 敲除的精巢使精原细胞不能正常的减数分裂说明生殖细胞的分化的确受到 体细胞Sertoli 细胞的影响此外Dmrt1 敲除的精巢中芳香化酶表达的升高 表明雌激素 可能影响生殖细胞的分化发育甚至可能是精原细胞不能正常减数分裂的原因之一暗示 鱼类减数分裂可能受到雌激素的调控 致谢 感谢北京大学细胞增殖分化教育部重点实验室张博教授提供本研究 Dmrt1 敲除所用 TALEN 载体 -9- [参考文献] References [1] Thomas KR Folger KR Capecchi MR High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian 280 285 290 295 300 305 310 315 320 325 330 335 340 genome [J] Cell 1986 44 3 419-428 [2] Rong YS Golic KG Gene targeting by homologous recombination in Drosophila [J] Science 2000 288 5473 7>2013-2018 [3] Fan L Moon J Crodian J Collodi P Homologous recombination in zebrafish ES cells [J] Transgenic Res 2006 15 1 21-30 [4] Wienholds E Schulte-Merker S Walderich B Plasterk RH Target selected inactivation of the zebrafish rag1 gene [J] Science 2002 297 5578 99-102 [5] Osiak A Radecke F Guhl E Radecke S Dannemann N Lütge F Glage S Rudolph C Cantz T Schwarz K Heilbronn R Cathomen T Selection-independent generation of gene knockout mouse embryonic stem cells using zinc-finger nucleases [J] PLoS One 2011 6 12 e28911 [6] Doyon Y McCammon JM Miller JC Faraji F Ngo C Katibah GE Amora R Hocking TD Zhang L Rebar EJ Gregory PD Urnov FD Amacher SL Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases [J] Nat Biotechnol 2008 26 6 702-708 [7] Dong Z Ge J Li K Xu Z Liang D Li J Li J Jia W Li Y Dong X Cao S Wang X Pan J Zhao Q Heritable targeted inactivation of myostati n gene in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco using engineered zinc finger nucleases [J] PLoS One 2011 6 12 e28897 [8] De Francesco L Move over zFNs [J] Nat Biotechnol 2011 29 8 681-684 [9] Huang P Xiao A Zhou M Zhu Z Lin S Zhang B Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs [J] Nat Biotechnol 2011 29 8 699-700 [10] Tesson L Usal C Ménoret S Leung E Niles BJ Remy S Santiago Y Vincent AI Meng X Zhang L Gregory PD Anegon I Cost GJ Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs [J] Nat Biotechnol 2011 29 8 695-696 [11] Ma S Zhang S Wang F Liu Y Liu Y Xu H Liu C Lin Y Zhao P Xia Q Highly Efficient and Specific Genome Editing in Silkworm Using Custom TALENs [J] PLoS One 2012 7 9 e45035 [12] Liu J Li C Yu Z Huang P Wu H Wei C Zhu N Shen Y Chen Y Zhang B Deng WM Jiao R Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy [J] J Genet Genomics 2012 39 5 209-215 [13] Lei Y Guo X Liu Y Cao Y Deng Y Chen X Cheng CH Dawid IB Chen Y Zhao H Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases TALENs [J] Proc Natl Acad Sci U S A 2012 109 43 17484-9 [14] Li T Liu B Spalding MH Weeks DP Yang B High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice [J] Nat Biotechnol 2012 30 5 390-392 [15] Matson CK Murphy MW Griswold MD Yoshida S Bardwell VJ Zarkower D The mammalian doublesex homolog DMRT1 is a transcriptional gatekeeper that controls the mitosis versus meiosis decision in male germ cells [J] Dev Cell 2010 19 4 612-624 [16] Raymond CS Shamu CE Shen MM Seifert KJ Hirsch B Hodgkin J and Zarkower D Evidence for evolutionary conservation of sex-determining genes [J] Nature 1998 391 6668 691-695 [17] Wang DS Zhou LY Kobayashi T Matsuda M Shibata Y Sakai F Nagahama Y Doublesex- and Mab-3-related transcription factor-1 repression of aromatase transcription a possible mechanism favoring the male pathway in tilapia [J] Endocrinology 2010 151 3 1331-1340 [18] Wu GC Chiu PC Lin CJ Lyu YS Lan DS Chang CF Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy [J] Biol Reprod 2012 86 2 41-51 [19] Nagahama Y Gonadal steroid hormones major regulators of gonadal sex differentiation and gametogenesis in fish In Norberg B Kjesbu OS Taranger GL AnderssonE Stefansson SO Nagahama Y Gonadal steroid hormones major regulators of gonadal sex differentiation and gametogenesis in fish [J] In Norberg B Kjesbu OS Taranger GL AnderssonE Stefansson SO eds Proceedings of the 6th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish Bergen Norway Institute of Marine Research and University of Bergen 2000 211-222 [20] Cermak T Doyle EL Christian M Wang L Zhang Y Schmidt C Baller JA Somia NV Bogdanove AJ Voytas DF Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting [J] Nucleic Acids Res 2011 39 12 e82 [21] Wang DS Kobayashi T Zhou LY Paul-Prasanth B Ijiri S Sakai F Okubo K Morohashi K Nagahama Y Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with ad4 binding proteinsteroidogenic factor 1 [J] Mol Endocrinol 2007 21 3 712-725 [22] Moore FE Reyon D Sander JD Martinez SA Blackburn JS Khayter C Ramirez CL Joung JK Langenau DM Improved somatic mutagenesis in zebrafish using transcription activator-like effector nucleases TALENs [J] PLoS One 2012 7 5 e37877 [23] Masuyama H Yamada M Kamei Y Fujiwara-Ishikawa T Todo T Nagahama Y Matsuda M Dmrt1 mutation causes a male-to-female sex reversal after the sex determination by Dmy in the medaka [J] Chromosome Res 2012 20 1 163-176 [24] Raymond CS Parker ED Kettlewell JR Brown LG Page DC Kusz K Jaruzelska J Reinberg Y Flejter WL Bardwell VJ Hirsch B Zarkower D A region of human chromosome 9p required for testis development contains two genes related to known sexual regulators [J] Hum Mol Genet 1999 8 6 989-996 [25] Smith CA Roeszler KN Ohnesorg T Cummins DM Farlie PG Doran TJ Sinclair AH The avian Z-linked - 10 - gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken [J] Nature 2009 461 7261 267-271 [26] Guiguen Y Fostier A Piferrer F Chang CF Ovarian aromatase and estrogens a pivotal role for gonadal sex 345 differentiation and sex change in fish [J] Gen Comp Endocrinol 2010 165 3 352-366 [27] Kobayashi T Kajiura-Kobayashi H Guan G Nagahama Y Sexual dimorphic expression of DMRT1 and Sox9a during gonadal differentiation and hormone-induced sex reversal in the teleost fish Nile tilapia Oreochromis niloticus [J] Dev Dyn 2008 237 1 297-306 - 11 - 因此是否 Dmrt1 同样参与了硬骨鱼类减数分裂值得深入研究 4 月龄敲除 Dmrt1 个体结果显示精巢观察到大量精原细胞少有甚至没有精 母细胞 这些都说明 Dmrt1