【doc】解淀粉芽孢杆菌BF7658中性蛋白酶的生理作用

【doc】解淀粉芽孢杆菌BF7658中性蛋白酶的生理作用 解淀粉芽孢杆菌BF7658中性蛋白酶的生理 作用 ' 一一析叶磕 解淀粉芽孢杆菌BF7658中性 蛋白酶的生理作用 耿运琪蒋如璋——一———一 (南开大学生物系,天津)-?7 ThePhysiologicalRoleofNeutralProtease inB.amyloliquefaciensBF7658 GengYunqi,JiangRuzhang (Department0fBiology.NankaiUnvlersity,Tianjin) Ab$tract Aneutralproteasedefectivestrain(Npr一),B.amyloliquefaciensBF7658npr:: Tn917,wasanisogeneicstrainofB.amyloliquefaclensBF7658(Npr),anoverpro— ducerof一amylase.TheproductivityofNpr—stralnwasonlyonethirdofNpr strain.whentheyweregrowninthemediuminwhichthenativeproteinmaterial (suchassoybeancakepowderortryptone)wasusedasnitrogensource.Buttwo strainsproducethesameamountof一amylaseaftersoybeancakepowderwas partiallysubstitutedbycasaminoacid.Thisresultsuggestedthattheroleofneutral proteasebeonlyasascavenger. B.amyloliquefaciens能产生两种主要 的胞外蛋白酶——中性蛋白酶(Npr)和碱性 蛋白酶(Apr).长期以来对它们的生理功能 看法不一.有人认为与芽孢形成有关, 因为一些芽孢形成突变型往往同时也表现为 蛋白酶缺陷型.然而近年来通过基因工程方 法由B.amyloliquefaciens得到的实验结 果,表明这两种胞外蛋白酶的主要功能与芽 孢形成无关. 一 0一 B.amyloliquefaciensBF7658是我国 工业上生产一淀粉酶的菌种,具有利用天然 有机氨源过量产生oz一淀粉酶的能力,因而是 检验其胞外蛋白酶生理功能的理想菌株.本 文报道了利用转座予Tn917插入诱变方法 获得的B.amyloliquefaciensBF7658中性 蛋白酶缺陷型菌株研究中性蛋白酶的作用, 结果表明该酶对细菌利用天然有机氮源过量 产生一淀粉酶是必需的. 材料和方法 一 ,菌探,质粒和噬菌体 B.amyloliquefaciensBF7658由天津 酶制剂厂提供|B.amyloliquefaciensBF 7658npr::Tn917系本实验所分离的中性蛋 白酶缺陷型菌株|携带转座子Tn917的质粒 pTV32由南开大学分子生物研究所马生 武提供,噬菌体PBS1由中科院遗传研究所 提供. 二,培养基及其他试剂 PB培养基…用于噬菌体裂解液制备及 质粒转导j含4脱脂鲜牛奶的LB培养基… 用于蛋白酶缺陷型菌株的筛选,一淀粉酶发 酵基本堵养基成分为.豆饼粉4%,玉米粉 7%,Na2HPO4-12H2O0_8,(NH4)2SO4 0.4,CaCI20.2,pH自然. 蛋白胨为日本多胨j酪蛋白氮基酸 (Casaminoacid)和酪胨(Casitone)购自 美国Difco公司,胰胨(Tryptone)为英国 产品. 三,供体裂解液的{钶备和质粒转导 按Brainucci【及笔者改进的方法is 进行. 四,插入突变型的分离 按Youngman【.方法进行. 五,蛋白酶和一淀粉酶活力测定 按文献方法进行. 结果 一 ,转座子Tng17的转座作用 有关pTV32通过噬菌体PBS1转导引入 B.amyloliquefaciensBF7658及转座作用, 另文发表I.随机挑取经温度诱导后得到的 500个红霉素抗性(Em)菌落点接合Cm (Sug/m1)的LB平板,其中493个菌落表型 为cm,对其中3个cmEm菌落进行质粒 检测【",均束发现质粒带,而在以同样方法 检测对照菌株时质粒带清晰可见(资料未列 出).这表明大约98的菌落的质粒已被消 除,转座子Tn917已整台到宿主染色体上. 转座频率约为l0,. 二,中性蛋白酶缺陷型的分离和鉴定 1.蛋白酶缺艏型的分离 将2140个高温诱导后产生的Em菌落 点接到含脱*鲜牛奶的LB平板上,37.C堵 养一定时问后观察蛋白水解圄.在培养l0小 时后观察,发现其中一个菌落周圄无水解圈. 继续培养至20zb时,该菌落周围亦出现小的 水解圈,而其他菌落则产生犬的水解圈.推 测该菌落为二种蛋白酶之一的缺陷型菌株. 2.蛋白酶缺陷型的鉴定 将蛋白酶缺陷型菌株接种LB液体培养 基,37.C摇床培养40/b时,离心,取上清液, 分别在加有中性蛋白酶抑制剂(EDTA)和碱 性蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的条 件下测定蛋白酶活力结果见表1. 表l蛋白酶缺陷型菌株的鉴定 中性蛋白酶活力碱性蛋白酵活力菌 株总酶括(u/m1)(u/m1)(u/m1) (PMSF)?(EDTA)@ ?lPMSF终浓度为5raM. ?EDTA终浓度为50raM. 上述结果表明,蛋白酶缺陷型菌株为中 性蛋白酶缺陷型(Npr一),定名为amyloli— q~efacienaBF7658npr:;Tn917由于完全 无中性蛋白酶活性,而且碱性蛋白酶的活性 也只有野生型菌株的大约1/3,因而预期会 影响该菌株对天然有机氮源的利用而在表现 型上与野生型有区别. 三,不同有机氮源对B.amylolique— faciensBF7658npr::Tn917一淀粉酶发 酵的影响 分别将B.amy1o1iquefaciensBF7658 的等基因菌株Npr和Npr一接种不同有机 氮源发酵培养基,37.c往复摇床培养52小时, 测定一淀粉酶活力,结果见表2. 表2B.amyloliquefaciensBF7658等基最菌株Npr和Npr一 在不同有机氮源条件下一淀粉酶的发酵水平 l豆饼粉4288lO3 2豆饼粉2 酪胨(Casitone)2288l64 328895豆饼粉2 胰胨(Tryptone)2 4288288豆饼粉2 酪蛋白氮基酸(Casaminoacid)2 ?除有机氮诱【外基础培养基成分相同. @t表中数据为两次重复结果. 结果表明,当以豆饼粉为有机氨源或以 豆饼粉加骧胨为混合氮源时Npr一菌株的一 淀粉酶产量只有Npr菌株的J/3,但Npr- 菌株的一淀粉酶产量下降并不是一因多效现 象.因为当以酪蛋白氨基酸代替部分豆饼粉 作为有机氮源时,Npr一菌株的产酶能力便 与Npr菌株无区别.而酪蛋白氮基酸正是 酪蛋白的完全水解产物.由此可见,在发酵 中期以前胞外蛋白酶对菌体正常生长是很重 要的.只有在细菌细胞能有效地分解和利用 天然有机氨源并生长正常的情况下,一淀粉 酶的发酵过程才能正常. 讨论 B.amylollquefaciensBF7658能产生 中性蛋白酶和碱性蛋白酶并分泌到胞外.前 者主要是在营养生长期产生的,因而使我们 一 8一 有可能在乎板上分离得到Npr一单一蛋白酶 缺陷型菌株 B.amyloliqueiaclensBF7658nprl: Tn917是非渗漏型中性蛋白酶缺路型菌株. 有趣的是该菌株碱性蛋白酶水平也同时下降 了74.这应当是一种一因多效现象据文 献报道碱性蛋白酶基因表达是由a37因子促 成的[11,因而应在芽孢形成期开始表达.而 由牛奶平板上蛋白质水解圈出现的时间判 断,中性蛋白酶属于营养期表达的胞外酶. 由此看来,如果确有多教性的话,那/厶它必 定是由一种未知的中间因子介导实现的. 如果两种胞外蛋白酶都与细胞形态和孢 子形成无关】,那么它们的生理功能就只 能是起水解胞外多肽类物质为菌体生长提供 营养的作用.本研究为这一推测提供了证 据.Npr,菌体尽管能产生碱性蛋白酶,但 因其合成时间太晚不能及时为菌体生长提供 营养,最终影响了一淀粉酶的产量.酪蛋白 氮基酸的作用就在于补充了生长中前期可利 用氮源的不足,弥补了中性蛋白酶缺陷而使 发酵趋于正常本文结果至少说明在以天然 有机氮源作培养基时,Npr一菌株不能作为 一 淀粉酶生产菌,至于NprApr一菌株能否 有效地利用有机氮源,有待于实验证明. 参考文献 [1]Hoch,J-.eta1.IAdv.Genet,,18l69 —— 98(1976) [2]PJggot.P.J, —— 962(1976) [3]Yang.M.Y 一 2l(1984) etal,;Bact.Rev..40I908 [4]KawKmura.F.andDoi.R.H.,J.Bact. ,/, 甚i蚺如4 i消息}}' 160I442——44{(1g84) [5]Perkins,J.B,andP.J.Youngman Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A..83l140 —— 144(1986) [6]Bramucci.M,G,eta1}J.Bact.,127t 829——831(1976) 7]Maniatis,T,eta1.1MolecularCloning, ALaboratoryManfl~ll,,?oldSpringHarbor Laboratory.(1982) [8]耿运琪等.南开大学(自然科学版),3tg5 —— 99(19g0) [e]Y~ungmKa,P.J,eta1.;Proc.Nail? Acad.Sci,U,S.A.,80I2305——2309 (1983) [1O]张树政;酶制剂工业,科学出版社(1984) [11]Wong,S.L.eta1.:Proc.Nat1.Acad- Sci.U.S.A..81l1184——1188(1984) 大型牧场粪便处理和沼气集中供气工程通过验收 由上海市工业微生物研究所提供技术工 艺,负责调试,上海市农场局建筑设计所负 责工程设计的国内最大的大型奶牛场粪便处 理和沼气集中供气工程,于1992年9月29日 在上海星火农场,通过由市农委主持的工程 验收. 工程占地226亩,厌氧塔总容积2700m., 单体窑积450m.(为上海之最).工程采用了 先进的二步发酵工艺,厌氧发酵塔内配有良 好的滥流,排污及防堵塞系统,运行稳定, 安全,可靠.日处理2000余头奶牛粪便约90 吨,经30N35.C中温发释,产气率高达1.5m /m..d月平均达1.2m./m.d以上.较普通 厌氧装置提高产气率一倍以上.所产沼气已 供2800余户居民的生活用气.各项技术,工 程,经济指标均达到或超过了设计要求. 针对沼气废液造成的二次污染,工程增 加了独特的后处理工艺装置,经离心分离的 稆渣制成人工土壤介质,用于花术,果蔬的 种植,清液经过l8亩水生植物的漫流处理, COD可在350mg/L以下,最低为58mg/L, 达到排放标准.(李是) 一 9一