B16黑色素瘤皮内移植瘤模型的建立

B16黑色素瘤皮内移植瘤模型的建立 牛青霞/周艳春/许燕璇/谢燕飞/陈少英/郑晓璇 (汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041) Intradermal Model of B16 Melanoma in Mice NIU Qing_xia, ZHOU Yan_chun, XU Yan_xuan,XIE Yan_fei, CHEN Shao_ying, ZHENG Xiao_xuan (Institute of Inflammation and Immune Disease, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong, China) 【摘要】背景与目的:建立B16黑色素瘤细胞(简称B16细胞)皮内移植瘤模型。材料与方法:制备商品源B16细胞悬液,按每只C57BL鼠接种0.1 ml (3×105个)B16细胞于后肢外侧皮内;分离、培养移植瘤源B16细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。结果:移植瘤出现时间为(9.6±1.2)d,致瘤率为100%;皮内注射B16细胞18 d内,肿瘤形态呈圆形或类圆形,边缘清楚;移植瘤源原代B16细胞多为圆形、类圆形或短梭形,商品源B16细胞为梭形或不规则形;HE染色表明移植瘤内有大量B16细胞。结论: B16细胞皮内移植瘤模型易于对肿瘤生长的观察和测量,是早、中期肿瘤研究的合适模型之一。 【关键词】 C57BL小鼠; B16黑色素瘤细胞;移植瘤模型 中图分类号: R73_35 文献标识码: A 文章编号: 1004-616X(2009)03-0238 -03 【ABSTRACT】BACKGROUND AND AIM: To establish an intradermal model with transplanting melanoma B16 cells in C57BL mice.MATERIALS AND METHODS: commercially_acquired 3×106 B16 cells in 0.1 ml were inoculated intradermally in the right hindlimb in C57BL mice.B16 cells from tumors were isolated, cultured and examined. RESULTS: Tumor formation time was found to be (9.6±1.2)d and tumor formation rate was 100%. Within 18 d, tumors was round or round_like shape with distinct borders. Commercially_acquired B16 cells were mostly spindle or irregular whilst B16 cells from tumors were round or round_like or short_spindle. HE staining showed that there were a large number of B16 cells in the transplanted tumors. CONCLUSION: Intradermal tumor model of B16 cells in C57BL mice is helpful to monitor tumor growth in early and middle stages and is one of ideal models in tumor studies. 【KEY WORDS】 C57BL mice; B16 melanoma cells; transplanted tumor models B16黑色素瘤细胞(简称B16细胞)是来源于C57BL黑小鼠皮肤的自发性肿瘤。皮内注射是将药液注入表皮与真皮之间[1]。表皮主要为排列密集的复层上皮,真皮由致密结缔组织组成。表皮与真皮交界面凹凸不平,有利于两者牢固连接[2]。基于其组织结构特点,我们推测皮内组织对移植瘤生长的局限性较强,有利于形成较规则的移植瘤形态。因此本文采用同系移植,建立黑色C57BL小鼠的皮内移植瘤模型,以期易于对肿瘤生长进行观察和测量。 1 材料与方法 1.1 实验材料 SPF级C57BL小鼠5只,广东省实验动物监测所提供,雌鼠3只、雄鼠2只(实验动物合格证号:0027969),6~8周龄,体重20~25 g (21.6±2.43 g),饲养于汕头大学医学院SPF级动物中心。Heraeus CO2培养箱(Hera Cell公司),倒置相差荧光显微镜IX70 (Olympus 公司),70 μm细胞网筛(Falcon公司),B16小鼠黑色素瘤细胞株购自中国科学院细胞库。 1.2 商品源B16细胞株和肿瘤模型源B16细胞的培养 1.2.1 商品源B16细胞培养B16细胞培养均采用含10%新生牛血清和青霉素(100 U/ml)及链霉素 (100 μg/ml)的RPMI_1640培养液(简称生长培养液)。0.25%胰蛋白酶消化对数生长期B16细胞,传代比例约1∶5。 1.2.2 移植瘤源B16细胞分离和培养脱颈处死荷瘤小鼠,75%酒精浸泡小鼠1 min。眼科剪剪取肿瘤组织块,置于70 μm细胞网筛内,一次性注射器芯研磨肿瘤组织数次,PBS 冲洗研磨物。转移冲洗液于离心管中,PBS洗涤细胞3次,以1 000 min/r离心5 min。用生长培养液悬浮沉淀细胞,37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养。次日,换生长培养液,以去除非贴壁细胞,继续培养,于细胞融合约75%后,0.25%胰蛋白酶消化、传代。按传代次数确定细胞代龄,即传代1次的B16细胞定为第1代B16细胞。 1.3 皮内移植瘤模型建立 1.3.1 细胞悬液准备0.25%胰蛋白酶消化对数生长期B16细胞,PBS洗涤细胞3次,以1 000 min/r 离心 5 min。0.4%苔盼蓝拒染法检测细胞存活率(存活率>90%),PBS调整细胞浓度为3×106/ml。 1.3.2 皮内肿瘤模型建立眼科剪小心剪去小鼠右后肢外侧鼠毛,勿剪破皮肤。75%酒精消毒皮肤,按每只鼠0.1 ml 的B16细胞悬液(3×105个细胞)皮内注射。 1.3.3 观察指标包括肿瘤出现时间、成瘤率和肿瘤平均直径。B16细胞注射后,以出现肿瘤的长径约为5 mm时记为肿瘤出现时间。游标卡尺测量肿瘤3个互相垂直的直径,按下式计算肿瘤直径平均值[3]。 肿瘤直径平均值=(A+B+C)/ 3 式中A、B、C分别为实体肿瘤3个互相垂直的直径。 1.4 肿瘤组织的HE染色 4%多聚甲醛固定肿瘤组织12 h,常规制备5 μm石蜡切片。二甲苯脱蜡每次10 min,脱蜡2次,100%,100%、90%、80%及70%酒精,逐级脱水,每次5 min。常规HE染色。 2 结果 2.1 肿瘤生长情况 皮内注射B16细胞后,5只小鼠肿瘤出现的时间为(9.6±1.2) d,致瘤率为100%。皮内注射B16细胞18 d 内,肿瘤形态为呈圆形或类圆形,边缘清楚(图1)。皮内移植瘤生长速度见图2。 2.2 B16细胞的形态特点 倒置相差显微镜下,对数生长期商品源B16细胞形态为梭形或不规则形。移植瘤B16细胞原代培养12 h 时,细胞团较多,细胞为圆形、类圆形或短梭形。原代培养3 d 时, 梭形细胞比例增加。第1代细胞形态类似于原代细胞,但细胞分布较原代细胞均匀(图3)。 2.3 肿瘤组织的观察 可见肿瘤组织内存在大量肿瘤细胞(图4)、炎症细胞及新生血管。 3 讨论 近年来,B16细胞肿瘤模型仍被广泛用于肿瘤生长、肿瘤血管新生、肿瘤免疫和抗肿瘤治疗等的研究。Koga等报道MCP_1通过诱导TNF_α、IL_1α和VEGF(vascular endothelial growth factor),能够促进肿瘤血管新生和肿瘤生长[4]。Li 等[5]报道阻断VEGF能够延长荷瘤小鼠的生存期。Ugen等[6]发现表达IL_15的裸质粒能够显著抑制B16移植瘤生长。 C57BL小鼠的皮下B16细胞移植瘤模型具有容易建立、成瘤率高等特点,是肿瘤研究的常用模型[4-7]。C57BL小鼠本身为黑色小鼠,给观察带来不便,影响早期肿瘤观察和测量的准确性,促使某些作者采用异系移植,建立白色ICR小鼠或BALB/C小鼠的B16细胞移植瘤模型[8-9]。研究表明B16细胞异系移植能够引起昆明小鼠或BALB/C小鼠的抗肿瘤反应,抑制肿瘤生长[10-11]。皮下组织含丰富的疏松结缔组织,其内移植瘤形态可呈扁平状、不规则状等,不利于对肿瘤的测量。因此,我们建立了皮内移植瘤模型。我们采用体重为20~25 g的小鼠用于皮内注射建模,因体重低于20 g的小鼠体积较小,不利于小鼠右后肢外侧皮内注射。如体重高于25 g,则鼠龄偏大,不利于荷瘤小鼠功能指标的观察。皮内注射后皮肤出现小隆起,应即刻用眼科镊夹针孔数秒,防止注射液渗出。本研究结果显示,皮内移植瘤生长局限,肿瘤边界清楚,提示皮内肿瘤模型易于肿瘤的观察和测量。 用于复制模型的B16细胞应为生长状态良好、对数生长期细胞。若细胞生长状态不良,肿瘤细胞表面的抗原性可能改变,刺激机体的免疫系统,使肿瘤细胞受到机体抗肿瘤免疫的作用而不易在动物体内存活。王淑瑞等行前肢腋部皮下注射B16细胞于C57BL小鼠, 2.5 ×106/ml,致瘤率为100%,肿瘤出现时间为(10.0±0.0) d[4]。本实验中采用生长状态良好、存活率大于90%的B16细胞,每只鼠皮内注射0.1 ml 约3×105 个B16细胞,致瘤率为100%,移植瘤出现时间为(9.6±1.2) d,与王淑瑞等报道一致[7]。复制B16细胞移植瘤模型时,应选择适当的细胞数量。在细胞数量为5×106~5×104范围内,B16细胞的接种数量与肿瘤出现时间(5.3~15.0 d)成反比关系[7]。若注射细胞数量过多,肿瘤生长过快,则不利于肿瘤生长、也不利于研究荷瘤机体功能的变化。若注射细胞数量过少,致瘤率低或肿瘤生长过慢,亦不利于肿瘤生长的研究。因此,研究中尚需根据B16细胞功能状态的差异和实验目的而进行细胞用量的适当调整。 参考文献: [1] 马文元,李长贵,宋洪礼. 护理学辞典[M]. 长春:吉林科学技术出版社,1991:458. 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