细菌基因组DNA提取

细菌基因组DNA提取 细菌基因组 DNA 提取快速微量提取法1.取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Eppendorf 管中，13000rpm 离心 1min 弃上清液，收集菌体。2.加入 400ul 裂解液(40mMTris-醋酸，20mM 醋酸钠 1mMEDTA， 1SDSpH7.8)混匀置于 37?水浴 1h。3.然后加入 200ul 5mol/L 的氯化钠溶液，混匀后于 13000rpm 离心 15min。4.取上清液，用苯酚抽提 2 次，氯仿抽提 1 次。5.加两倍体积无水乙醇，1/10 体积醋酸钾 3M pH8.0，-20 度保存 1 小时后，13000rpm 离心 15min，弃上清液，沉淀用 70乙醇洗 2 次;置于室温干燥后，溶于 50ul TE 溶液中，置4?保存备用。蛋白酶/SDS 法制备1.取 10ml 菌体(如:Delftia sp)过夜培养物于一灭菌 Eppendorf 管中，4000rpm 离心 10min收集菌体。2.用 Washing TE(50mmol/L Tris-HCl pH8.0 10mmol/L EDTA pH8.0)洗菌体 2 次。3.将菌体充分悬浮在 5ml 1×TE 缓冲液中， 先后加入 0.5ml 5mg/L 的蛋白酶、0.5ml 10 SDS，轻轻混匀后 50?放置 3h5h。4.接着用等体积的 Tris 饱和苯酚抽提 2 次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次。5.氯仿抽提一次后，乙醇沉淀 DNA，用吸管头将絮状 DNA 沉淀块吸附到 Ep 管中，70乙醇洗 2 次，干燥后溶于适当 1×TE 或 ddH2O 中。酚氯仿1.细菌收集:取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温 8000rpm 离心 5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 1ml TE(pH8.0)中(用 ddH2O 也行。2.菌体裂解:加入 6μl 50mg/ml 的溶菌酶，37?作用 2h。再加 2mol/L NaCl50μl，10 SDS110μl，20mg/ml 的蛋白酶 K 3μl，50?作用 3h 或 37?过夜。 (此时菌液应为透明粘稠液体)3.抽提:菌液均分到两个 1.5ml EP 管，加等体积的酚? 24?1，混匀，室温放置 5-10min。12000rpm 离心 10min。抽提氯仿?异戊醇25? 两次。 (上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)4.沉淀:加 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10min。1 2000rpm 离心 10min。5.洗涤:沉淀用 75的 离心乙醇洗涤。6.抽(凉)干后，溶于 50μl ddH2O 中通用方法1.过夜培养细菌。2.后收集菌体，并悬浮在 5 ml 50 mM Tris pH 8.0 50 mM EDTA.中。3.重悬菌体放入-20?保存。4.在冰冻的悬浮物重加入 0.5 ml 250 mM Tris pH 8.0 10 mg/ml 溶菌酶，室温解冻菌体，解冻后置冰上 45 分钟。5.加入 1 ml 0.5 SDS 50 mM Tris pH 7.5 0.4 M EDTA 1 mg/ml 蛋白酶 K，50?水浴 60 分钟。6.用 6ml Tris-苯酚(1:1)抽提，然后 10000g 离心 15 分钟，将上清转移到新的 Ep 管中，必要时再重复此步骤。7.加入 1/10 体积 3M 醋酸钠，轻柔混匀。再加入 2 倍体积 95乙醇，颠倒混匀。8.将絮状 DNA 转移到 5 ml 50 mM Tris pH 7.5 1 mM EDTA 200 g/ml RNase.溶液中，4?摇动溶解过夜。9.加入等体积氯仿抽提，颠倒混匀，10000g 离心 5 分钟，将上清转移到新的 Ep 管中。10.加入 1/10 体积 3M 醋酸钠，轻柔混匀。再加入 2 倍体积 95乙醇，颠倒混匀。11.将絮状 DNA 转移到 5 ml 50 mM Tris pH 7.5 1 mM EDTA。12.Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.13. 电泳和分光光度计检测基因组 DNA 纯度。方法五1.100ml 细菌过夜培养液 5000rpm 离心 10 分钟 去上清液。2.加 9.5ml TE 悬浮沉淀 并加 0.5ml 10 SDS(裂解细胞) 50μl 20mg/ml或 1mg 干粉蛋白酶 K(降解蛋白) 混匀 37?保温 1 小时。3.加 1.5ml 5mol/L NaCl 混匀。4.加 1.5ml CTAB(去除多糖成分)/NaCl 溶液 混匀 65?保温 20 分钟。5.用等体积酚:氯仿:异戊醇25:24:1抽提 5000rpm 离心 10 分钟 将上清液移至干净离心管。6.用等体积氯仿:异戊醇24:1抽提 取上清液移至干净管中。7.加 1 倍体积异丙醇 颠倒混合 室温下静止 10 分钟，沉淀 DNA。8.用玻棒捞出 DNA 沉淀 70乙醇漂洗后 吸干溶解于 1ml TE -20?保存。如 DNA 沉淀无 法捞出可 5000rpm 离心 使 DNA 沉淀。9.如要除去其中的 RNA 可以按本章第三节中操作步骤处理。注:1.CTAB/NaCl 溶液:4.1g NaCl 溶解于 80ml H2O缓慢加入 10g CTAB加水至100ml。2.氯仿:异戊醇24:1，酚:氯仿:异戊醇25:24:1，异丙醇，70 乙醇，TE，10SDS，蛋白酶 K 20mg/ml 或粉剂，5mol/L NaCl。血液基因组 DNA 提取方法 11.取 0(5ml 抗凝全血放人一支 1(5ml 离心管中，加入二倍体积的红细胞裂解液(0(155mol,L NH4Cl，0.01mol/L NaHCO3，0.127mol/L EDTA) ，混匀。2.室温下静置 20min，以溶解红细胞，10000r/min 离心 10min，使血细胞沉淀下来，弃上清。3.重复上述操作 2-3 次，以彻底除去血红蛋白。直至在离心管底出现白色的白细胞沉淀。4.加入 DNA 抽提液 (10mmol/L Tris.Cl pH8.0) 0.1mmol EDTA ( ， (pH8.0) 1.0 SDS) ， 0.5ml，悬起沉淀的白细胞。5.37?水浴保温 1h 后，高速振荡 10-15s，再沸水浴 10min 后，10000r/min 离心 10min，使细胞碎片及变性蛋白质沉淀，6.在上清液中加入 2 倍体积的 95的冰冻乙醇，静置沉淀 20min，12000r/min 离心 15min，弃上清，自然晾干，加入 30ulTE 备用。改良 CTAB 法1.在装有血液的 2 ml 离心管中加入 500 ul 预热的 4xCTAB 提取液和 2ul β一巯基乙醇，使完全分散在提取液中，65?温浴约 1.5 h(2.待冷却至室温后加入等体积的氯仿—异戊醇24:1，上下颠倒离心管，温和混匀 5 min。3.然后离心 5 min 1 000 rad,min(将上清液转管，反复抽提 3 次(最后一次离心 10 min(4.吸取上清液，加入 70 体积的异丙醇，沉降 DNA，轻轻颠倒 2-3 次，可见白色絮状沉淀，室温下静置 30 min 以上。5.然后 10 000 rad,min 离心 7 min，弃上清(用 200 uL 70的乙醇和无水乙醇各洗 2 次，每次离心 2 min 后，弃上清。6.然后将离心管放在 37? 烘箱中或室温下使乙醇挥发( 待总 DNA 干燥后加 50ul TE 溶液和 1.5ul RNase 于 37?水浴中温浴 2 h，然后于-20?或 4?冰箱中保存备用(饱和氯化钠抽提法1.取 0.5ml 抗凝全血，加入 0.8ml TEpH 8.0混匀;2.室温离心，10000rpm ，1 分钟;3.弃上清，加入 0.4ml TEpH 8.0，混匀，悬浮细胞;4.加入 10mg/ml 蛋白酶 K 5μl(终浓度 100μg/ml)10 SDS 25μl终浓度 0.5，混匀;5.37?水浴消化过夜，或 50?消化 4 小时;6.加入 1/3 体积的饱和氯化钠，充分混匀，4?静置 10 分钟;7.10000rpm 离心 10 分钟，取上清于另一新管中;8.加入等体积氯仿，混匀，10000rpm 离心 10 分钟;9.取上清于另一新管中，加入 1/20 体积的 3M NaAcpH 5.2混匀;10.加入 2 倍体积无水乙醇轻轻混合，10000rpm 离心 1 分钟;11.弃上清，加入 70乙醇 0.5ml，充分洗涤;12.10000rpm 离心 1 分钟，弃上清，自然干燥 DNA 约 5 分钟;13.加入 200-250μl TE，-20?保存;14.检测浓度及纯度。酚氯仿抽提法1.外周血反复冻溶破坏红细胞，取 0.5ml 外周血，加入 0.5ml PBS 混匀后，10000rpm 离心10 分钟;2.弃上清，加入 180μl TEpH 8.0，20μl 10 SDS 10mg/ml 蛋白酶 K 5μl(终浓度 100μg/ml)混匀;3.37?水浴消化过夜，或 50?消化 4 小时;4.加入等体积的饱和酚并充分混匀，10000rpm 离心 10 分钟;5.吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次;6.吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀，10000rpm 离心 10 分钟;7.吸取上清液于另一新管中，加入 1/20 体积的 3M NaAcpH 5.2 混匀后，加入 2 倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色 DNA 团块，10000rpm 离心 10 分钟;8.弃上清，加入 70乙醇 0.5ml，充分洗涤;9.10000rpm 离心 1 分钟，弃上清，自然凉干后加入 TE 液，-20?保存;10.检测浓度及纯度动物组织基因组 DNA 提取材料1.生理盐水2.十二烷基硫 酸钠(SDS)3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)4.乙二胺四乙酸(EDTA)5.饱和酚6.氯仿7.异戊醇8.无水乙醇9.75乙醇10.蛋白酶 K11.RNase 酶12.手术剪刀、镊子、吸水纸13.微量取液器14.研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL 离心管架、记号笔试剂配制Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法: 40ml 双蒸水，6.057g 固体 Tris 放入烧杯中溶解，用浓盐酸调 PH 值到 8.0，转移到 50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。生理盐水: 0.85NaCL 100ml配制方法:在 20ml 双蒸水中溶解 0.85g 固体 NaCL，加水定容至 100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法:将 9.08g 的 EDTANa22H2O 溶解于 40ml 双蒸水，用 1g 的 NaOH 颗粒(慢慢逐步加入)调 PH 值到 8.0，用 50ml 容量瓶定容，如果 EDTA 难溶，先加 NaOH 溶解，然后逐步加 EDTANa22H2O。TES 缓冲液(释放 DNA) 100ml配制方法: 0.5844g 的 5 mol/lNaCl 溶解于 80ml 双蒸水， 将 在分别加入 1ml 的 0.5 mol/l EDTA、0.2ml 的 Tris-HCl pH8.0，加定容至 100ml 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。10 SDS(变性剂 破细胞壁)100ml配制方法:将 10g 的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于 80ml 双蒸水于 68?加热溶解，用浓HCl 调至 PH7.2，定容至 100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4?保存备用。蛋白酶 K(降解蛋白质) :20mg/mL 无菌三蒸水溶解。RNA 酶 (降解 RNA)配制方法:将胰 RNA 酶(RNA 酶 A)溶于 10mmol/L 的 TrisCL(PH7.5) 、15mmol/LNaCL中，配成 10mg/ml 的浓度，于 100?加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20?。氯仿:异戊醇24:1 100ml按 24:1 的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4?保存备用。TE 缓冲液(溶解 DNA) PH8.0 50ml配制方法:将 0.5ml 的 10mmol Tris-HClPH8.0 、0.1ml 的 0.5mol/l EDTAPH8.0 加入到50ml 的容量瓶中，调 PH8.0 定容至 50ml 摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。实验操作方法1.1.组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约 0.5g 组织，放入 1.5ml 离心管中，剪碎。2.加入 0.45ml TES 混匀，再加入 50ul SDS(10) ，5.0ul 蛋白酶 K(20mg/ml)，充分混匀后，于 56?C 保温 4-6h，每 2h 摇 1 次。3.放置到室温，加入等体积饱和酚(500ul) ，颠倒混匀，10000r/m，离心 10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的 1.5ml 离心管。4.加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) ，颠倒混匀，10000r/m，离心 10 分钟，取上层转移到新的 1.5ml 离心管中。5.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1) ，颠倒混匀，10000r/m，离心 10 分钟，取上层清液到一个新的 1.5ml 离心管。6.加入 2.5 倍体积的-20?C 预冷的无水乙醇沉淀 DNA，观察现象。7.12000 r/m，离心 10 分钟，弃乙醇。8.-20?C 保存的 75乙醇洗涤，10000 r/m，离心 5 分钟，去乙醇，55?C 干燥 DNA。9.加入适量 TE 溶解 DNA(具体依 DNA 的多少而定) ，-20?C 保存备用。1.1.取新鲜或冰冻动物组织块 0.1g(0.5cm3) ，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入 1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶 K (500ug/ml)20μl，混匀。在 65?恒温水浴锅中水浴 30min，也可转入 37?水浴 12,24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以 12000 rpm 离心 5min，取上清液入另一离心管中。2.加 2 倍体积异丙醇， 倒转混匀后，可以看见丝状物， 100ul 吸 头挑出， 用 凉干， 200ul TE 用重新溶解。 (可进行 PCR 反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行)3.加等量的酚-氯仿-异戊醇振荡混匀，离心 12000 rpm，5min。4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿异戊醇，振荡混匀，离心 12000 rpm，5min。5.取上层溶液至另一管，加入 1/2 体积的 7.5mol/L 乙酸氨加入 2 倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀 2min ，离心 12000 rpm 10min。6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。7.用 1ml 70乙醇洗涤沉淀物 1 次，离心 12000 rpm ， 5min。8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。9.加 200ul TE 重新溶解沉淀物，然后置于 4?或C20?保存备用。植物组织基因组 DNA 提取1.2CTAB 抽提缓冲液在 65?水浴中预热;2.取少量植物组织置于试管中，用小杵磨至粉状;3.加入 700ul 的 2CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀;4.置于 65?的水浴槽或恒温箱中，每隔 10 min 轻轻摇动，40 min 后取出;5.冷却 2 min 后，加入氯仿-异戊醇24:1 至满管，振荡 23 min，使两者混合均匀;6.10000 rpm 离心 10 min，与此同时，将 600 μl 的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;7.10000 rpm 离心 1 min 后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA 絮状物;8.10000 rpm 离心 1 min 后，立即倒掉液体，注意勿将白色 DNA 沉淀倒出9.加入 800 μl 75的乙醇，将 DNA 洗涤 30 min;10.10000 rpm 离心 30s 后，立即倒掉液体，干燥 DNA(自然风干或用风筒吹干) ;11.加入 50 μl 0.5 × TE 缓冲液，使 DNA 溶解;12.置于-20?保存、备用。较为常用的细菌 DNA 提取方法:实验步骤:1、将菌株接种于液体 LB 培养基，37?震荡培养过夜。2、取 1.5ml 培养物 12000rpm 离心 2min。3、沉淀中加入 567ul 的 TE 缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入 30ul10SDS 和 15ul 的蛋白酶 K，混匀，于 37?温育 1h.4、 再加入 80ulCTAB/NaCl 溶液， 加入 100ul5mol/LNaCl充分混匀， 混匀后再 65?温育 10min。5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心 4-5min将上清转入一只新管中，加入 0.6-0.8 倍体积的异丙醇，轻轻混合直到 DNA 沉淀下来，沉淀可稍加离心。6、沉淀用 1ml 的 70乙醇洗涤后，离心弃乙醇(细菌基因组 DNA 提取取出 10ml 培养好的细菌培养液，5000rpm10min用 TE 洗涤后，再离心，菌体重悬于 4mlTE溶液。1(加入 50mg/ml 溶菌酶溶液 8μl(终浓度为 100μg/ml)，37?保温 20min。2(加入 RNase(10mg/ml)10μl至终浓度为 25μg/ml，然后加入 10,SDS 溶液 0.5ml，37?保温 30min。3(加入蛋白酶 K(20mg/ml)10μl，至终浓度为 50μg/ml) ，然后加入，37?保温 60,90min。4(加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) ，混匀，8000rpm×5min取上清液转入另一离心管中。如此 2,3 次，即可。5(将上清液中加入 1,5 体积的醋酸钠，2 倍体积的冷的无水乙醇，旋转离心管，会出现沉淀物 DNA。6(70,乙醇洗涤一次，室温下干燥，但勿使 DNA 完全干燥，以便使其易溶。7(加入 0.5mlTE 或双蒸水溶解 DNA，测定值 OD260 和 OD280，确定 DNA 含量和纯度。8(,20?保藏。