自主运动后BALBc和C57BL6小鼠学习记忆行为学指标的分析比较

中国组织工程研究 第20卷 第18期 2016–04–29出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 29, 2016 Vol.20, No.18 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2661 ·研究原著· www.CRTER .org 刘雪芹，女,1987年生，山西省吕梁市人，汉族, 2013年山西医科大学毕业，硕士，助教，主要从事中枢神经系统的损伤与修复相关研究。 通讯作者：赵云鹤，博士，讲师，山西医科大学人体解剖学教研室，山西省太原市 030001 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)18-02661-07 稿件接受:2016-03-10 自主运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠学习记忆行为学指标的分析比较 刘雪芹，李 睿，崔佳彬，陆 利，赵云鹤(山西医科大学人体解剖学教研室，山西省太原市 030001) 引用本文：刘雪芹，李睿，崔佳彬，陆利，赵云鹤. 自主运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠学习记忆行为学指标的分析比较[J].中国组织工程研究,2016,20(18):2661-2667. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.012 ORCID: 0000-0002-6971-0364(刘雪芹) 文章快速阅读: 文题释义: 学习记忆：学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能之一，是中枢神经系统功能的整合；海马是学习记忆的主要脑区，其结构受损会导致学习记忆功能障碍，产生相关的行为学改变；认知训练和自主运动能够促进海马神经发生，改善海马的结构和功能，提高学习记忆能力。 行为学研究：是指研究者通过科学和客观地研究自然条件下人或动物的沟通行为、情绪表达、社交行为、学习行为、繁殖行为等行为及其规律，从而判断人或动物的感觉和认知活动，是研究神经发生及其功能常用的方法之一。 摘要 背景:BALB/c 和C57BL/6小鼠是实验室常用的两种近交品系，但是自主运动后如何科学、合理选择行为学实验方法和指标，小鼠的学习记忆能力目前尚无相关报道。 目的：分析比较自主运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠与学习记忆相关的行为学指标差异，为探讨运动对学习记忆能力的影响，并选择合理的行为学指标提供参考。 方法：将2.5月龄BALB/c 和C57BL/6小鼠分别随机分为对照组和跑轮运动组，应用VitalView 软件记录小鼠自主跑轮运动。跑轮运动4周后，通过DCX 免疫荧光染色检测海马新生神经元；新异臂探索实验、新物体识别实验和水迷宫实验分析比较小鼠空间学习记忆和探索能力。 结果与结论:①BALB/c 小鼠平均每天运动量约是C57BL/6小鼠的2.56倍(P < 0.001)。②跑轮运动后两种品系小鼠海马DCX 阳性细胞数较对照组增多。③跑轮运动后两种品系小鼠探索新异臂和新物体的次数、围绕新异臂和新物体探索的时间和距离均较对照组增高(P < 0.001)，其中BALB/c 跑轮组的探索能力优于C57BL/6跑轮组(P < 0.05)。④Morris 水迷宫实验结果表明,C57BL/6跑轮组寻找平台的时间缩短，小鼠到达平台次数、在目标象限探寻的时间和距离均较对照组延长(P < 0.05)；但是,BALB/c 跑轮组和对照组间水迷宫实验各项指标无统计学差异。综上所述，运动能促进BALB/c 和C57BL/6小鼠海马神经发生；新异臂探索和新物体识别实验能够用于检测运动后两种小鼠的学习记忆能力，其中BALB/c 的学习记忆能力优于C57BL/6小鼠，但运动后BALB/c 小鼠不适合应用水迷宫实验检测其空间学习记忆能力的变化。 关键词: 实验动物；神经损伤与修复动物模型；自主运动;BALB/c 小鼠;C57BL/6小鼠；学习记忆 主题词: 运动活动；小鼠，近交C57BL ；小鼠，近交BALB C ；学习；记忆；组织工程 跑轮运动4周 Liu Xue-qin, Master, Teaching assistant, Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China Corresponding author: Zhao Yun-he, M.D., Lecturer, Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China 基金资助： 山西省基础研究—自然科学基金(2015011132)；国家级大学生创新创业训练项目(201510114005)；山西省研究生创新基金项目(20133075) Learning and memory abilities between BALB/c and C57BL/6 mice after voluntary movement Liu Xue-qin, Li Rui, Cui Jia-bin, Lu Li, Zhao Yun-he (Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China) Abstract BACKGROUND: BALB/c and C57BL/6 mice are two inbred strains, but after voluntary movement, there is no report on how to scientifically reasonably select behavioral experiment methods and indicators and to evaluate the learning and memory abilities of mice. OBJECTIVE: To analyze and compare the behavioral indicators between BALB/c and C57BL/6 mice following voluntary wheel running, to explore the effect of exercise on learning and memory, and to provide a reference for selecting reasonable behavioral indicators. METHODS: 2.5-month-old BALB/c and C57BL/6 mice were randomly divided into control and voluntary wheel running groups. Independent running wheel movement of mice was recorded with VitalView system. 4 weeks later, newborn neurons were labeled via DCX immunofluorescence. Spatial learning, memory and exploration abilities were compared through new arm test, new object recognition test and Morris water maze test. RESULTS AND CONCLUSION: (1) The mean spontaneous activity of BALB/c mice daily was 2.56 fold of that of C57BL/6 mice during wheel running (P < 0.001). (2) Hippocampal DCX-positive cells in exercised BALB/c and C57BL/6 mice were more than those in control group. (3) Meantime, exhibited by higher frequencies to explore new arm or object, and longer time and distance of moving around them, the learning and exploring capability was improved after exercising (P < 0.001), especially in BALB/c mice. (4) Wheel running C57BL/6 mice exhibited progressed spatial learning and memory abilities compared with control mice in Morris water maze test, characterized by decreased latency to target, elevated target crossings and longer time or distance in quadrant zone (P < 0.05). However, there was no significant difference between wheel running and control BALB/c mice. Taken these data together, voluntary wheel running contributed to hippocampal neurogenesis of BALB/c and C57BL/6 mice, accompanied by the change of learning and memory capability, which could be detected properly via both new arm test and new object recognition test, but for Morris water maze test, C57BL/6 mice might be superior to BALB/c mice. Subject headings: Motor Activity; Mice, Inbred C57BL; Mice, Inbred BALB C; Learning; Memory; Tissue Engineering Funding: the Shanxi Provincial Basic Research Program —Natural Science Foundation, No. 2015011132; the National College Students ’ Innovation and Entrepreneurship Training Program, No. 201510114005; the Postgraduate Student Innovation Foundation Project in Shanxi Province, No. 20133075 Cite this article: Liu XQ, Li R, Cui JB, Lu L, Zhao YH. Learning and memory abilities between BALB/c and C57BL/6 mice after voluntary movement. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(18):2661-2667. 0 引言 Introduction 海马是学习记忆的主要脑区，认知训练和自主运动能够促进海马神经发生，改善海马的结构和功能。自主跑轮运动能够上调海马神经营养因子的表达，促进海马神经干细胞增殖，增加新生神经元的数目 [1-4] 。因此，自 主运动成为研究神经发生的一种重要模式。 目前，关于神经发生的研究方法很多，动物行为学研究是常用的方法之一。它是指研究者通过科学和客观地研究自然条件下动物的沟通行为、情绪表达、社交行为、学习行为、繁殖行为等行为及其规律，从 而判断动物的感觉和认知活动[5-6] 。小鼠是广泛应用于 神经科学、心理学和神经精神药物学等研究领域的实验动物之一。但是，不同品系的小鼠由于其自身的生物学特性差异可能影响行为学指标分析。为此，作者选取实验室常用的两种近交品系BALB/c 和C57BL/6小鼠，利用免疫荧光染色法观察自主运动后海马神经发生情况，并通过新异臂探索、新物体识别以及水迷宫实验，观察自主运动后两种小鼠的学习记忆行为学指标差异，以期为客观评价自主运动对小鼠学习记忆能力的影响提供依据。 1材料和方法Materials and methods 1.1 设计随机对照动物实验。 1.2 实验动物及材料 实验动物：2.5月龄健康清洁级BALB/c和C57BL/6小鼠各60只，雄性，体质量23-25 g，均购自山西医科大学实验动物中心。动物质量合格证号BALB/c小鼠为SCXK(晋)2009-0001，C57BL/6小鼠为SCXK(晋)2015- 0001。小鼠饲养于实验室的清洁动物房，自由饮水摄食，自然12 h昼夜交替节律。 1.3 实验方法 1.3.1 自主跑轮运动实验 2.5月龄BALB/c和C57BL/6小鼠适应实验环境2周后随机分为对照组和跑轮运动组，每组各30只，其中20只用于行为学检测，10只用于组织切片染色。对照组按常规条件饲养，每笼放1只；运动组放于装有小鼠跑轮系统的专用鼠笼，每笼放1只。自由饮水摄食，自然12 h昼夜交替节律，4周后进行行为学实验。流程图见图1。 1.3.2 免疫荧光染色实验BALB/c和C57BL/6小鼠自主跑轮运动4周，灌注取脑，40 g/L多聚甲醛溶液固定，30%蔗糖溶液脱水，随后制作冰冻切片，进行DCX免疫荧光染色实验。一抗体使用浓度为1∶100，4 ℃过夜；二抗使用浓度为1∶200，37 ℃孵育2 h。抗荧光封片液封固，Olympus荧光显微镜计数、拍照。 1.3.3 新异臂探索实验Y迷宫由3个互为120°角的臂组成辐射式迷路箱，每个臂的尺寸均为30 cm×8 cm×15 cm (长×宽×高)，三臂交汇处各有一个可移动的隔板。三个臂被随机设为：起始臂(start arm)、其他臂(other arm)和新异臂(new arm)。整个实验在安静环境下进行，包括训练阶段和测试阶段2个过程，Y迷宫底部与地面的垂直距离为40 cm，与其上方摄像头的垂直距离为1.5 m。训练阶段用隔板遮挡新异臂，小鼠均由起始臂放入，在起始臂和其他臂之间自由活动10 min，每只小鼠放入前均用体积分数75%乙醇擦拭臂内壁并自然风干，训练结束后放回饲养笼，1 h后进行测试。测试阶段取掉新异臂的隔板，其他操作同训练阶段，让小鼠在3个臂中自由活动，录像并采集数据5 min。 1.3.4 新物体识别实验该实验中所用测试箱为2个40 cm×40 cm×40 cm的立方体空箱，旷场置于水平地面上，其上方垂直距离2 m处安装摄像头，整个实验在安静的环境下进行。旷场实验时将小鼠均按统一朝向和位置放入旷场(实验按小鼠背对作者放于旷场中央)，任其 BALB/c和C57BL/6小鼠学习记忆检测实验用主要试剂及仪器： 试剂及仪器来源 Rabbit anti DCX(Doublecortin) Cell signaling technology Goat anti rabbit Cy3 Sigma 山羊血清封闭液博士德生物工程有限公司 Vitalview小鼠跑轮系统，Vitalview 5.0数据采集系统 美国Philips公司 水迷宫，Y迷宫，旷场北京恒裕科技发展有限责 任公司 Smart 3.0小动物行为分析记录系统西班牙panlab公司 冰冻切片机德国Leica公司 荧光显微镜日本Olympus公司 自由活动，录像并采集数据10 min 。新异物体识别实验包括训练阶段和测试阶段2个过程，训练阶段将小鼠均按统一朝向和位置放入旷场，让其自由活动10 min ，训练结束后放回饲养笼，1次/d ，连续训练3 d 。 测试阶段预先在旷场底部距离相邻两边均为10 cm 处放置2个物体，将小鼠背对物体放入旷场，自由活动10 min 后放回饲养笼；1 h 后用一新物体取代旷场底部的两物体之一，同前放入小鼠，录像并记录其10 min 内的活动信息。 1.3.5 Morris 水迷宫实验 水迷宫宫体直径90 cm ，高45 cm 。内壁涂黑，宫体内充满自来水，水温保持在(23± 2) ℃。逃生平台直径6 cm ，高24 cm ，置于宫体内坐标位置的第四象限中央，且低于水面1 cm 。宫体水池正上方安装固定连于Smart 3.0分析系统的摄像头，进行图像和数据信息的采集。水迷宫被分为4个象限：Q 1、Q 2、Q 3和Q 4，其中Q 3为逃生平台Q 5所在的目标象限。 实验分为2个阶段：训练阶段和测试阶段。训练阶段将小鼠面向并靠近池壁随机从4个不同象限放入水下，软件记录小鼠从入水到爬上平台的游泳时间，此为逃避潜伏期。每只小鼠每天训练4次(分别从不同象限入水)，每次记录1 min ，连续训练5 d 。如果小鼠超过1 min 仍找不到平台，可人为引导其找到平台并休息1 min 。测试阶段所有待测小鼠都从某一固定象限(目标象限除外)面壁靠壁放入水中，软件记录1 min ，观察其逃生寻找安全平台的过程。 1.4 主要观察指标 ① BALB/c 和C57BL/6小鼠的平均自主运动量。②运动后海马DCX 阳性细胞数。③运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠探索新异臂和识别新物体的能力变化。④运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠在Morris 水迷宫内的空间学习记忆能力变化。 1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据以x _ ±s 表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 2.5月龄BALB/c 和C57BL/6小鼠各60只，全部完成实验进入结果分析，无脱落。 2.2 模型稳定性 此课题重点借助自主跑轮运动这种方法来说明运动与不运动对BALB/c 和C57BL/6小鼠海马神经发生的影响，实验采用的方法是神经科学领域相对成熟的方法[7] 。 2.3 BALB/c 和C57BL/6小鼠自主运动能力和海马DCX 表达变化 小鼠自主运动能力检测：VitalView 数据采集结果显 示，BALB/c 小鼠平均每天运动量为(12.16±0.52) km ，是C57BL/6小鼠的2.56倍(P < 0.001，图2A )，提示BALB/c 小鼠自主运动能力优于C57BL/6小鼠。 海马DCX 表达：新生神经元标志物DCX 免疫荧光染 色结果表明，跑轮运动4周后，BALB/c 和C57BL/6小鼠海马颗粒下层(subgranular zone ，SGZ)阳性细胞较对照组增多(图2B )，提示自主跑轮运动能够促进BALB/c 和C57BL/6小鼠海马神经发生。 2.4 BALB/c 和C57BL/6小鼠新异臂探索实验分析结果 BALB/c 和C57BL/6小鼠跑轮组探索新异臂的次数增多，在新异臂内自由探索的时间和距离均明显高于对照组小鼠(P < 0.001)，其中BALB/c 小鼠自主运动后在新异臂内自由探索的时间和距离分别较对照组增高1.03和1.21倍，C57BL/6小鼠自主运动后在新异臂内自由探索的时间和距离分别较对照组增高0.66和0.22倍(表1)，提 A BALB/c C57BL/6 平均运动量(k m /d ) 对照组 跑轮组 图2 BALB/c 和C57BL/6小鼠运动能力和海马DCX 表达变化 Figure 2 Changes of motor ability and hippocampal DCX expression in BALB/c and C57BL/6 mice 图注：图中A 为BALB/c 和C57BL/6小鼠平均运动量比较，与BALB/c 小鼠比较，a P < 0.001；B 为运动和不运动的BALB/c 和C57BL/6 小鼠海马新生神经元标志物DCX 免疫荧光染色，结果显示两种品系小鼠跑轮组海马颗粒下层阳性细胞均较对照组增多。 B 示自主运动可以提高小鼠空间学习探索能力，新异臂探索实验适于判定BALB/c 和C57BL/6小鼠的空间学习探索能力。 2.5 BALB/c 和C57BL/6小鼠新物体识别实验分析结果 BALB/c 和C57BL/6小鼠跑轮组探索新物体的次数及在新物体周围自由探索的时间和距离均明显高于对照组小鼠(P < 0.05)，且运动后BALB/c 小鼠探索新物体次数及围绕新物体探索的距离约是C57BL/6小鼠的3倍(P < 0.05)，见表2。表明自主运动促使BALB/c 和C57BL/6小鼠学习探索能力提高，新物体识别实验适用于自主运动后BALB/c 和C57BL/6小鼠学习探索能力的行为学研究，其中BALB/c 小鼠的效果更好。 2.6 BALB/c 和C57BL/6小鼠水迷宫实验分析结果 水迷宫训练学习5 d 后，C57BL/6跑轮组寻找平台的潜伏期较对照组明显缩短(P < 0.05)，到达平台次数、在目标象限探寻的时间和距离较对照组均明显增加(P < 0.05)。 但是，BALB/c 跑轮组寻找平台的潜伏期、到达平台次数以及在目标象限和平台区探索的距离与对照组相比差异均无显著性意义(表3)。提示自主运动后BALB/c 小鼠可能不适合应用水迷宫实验检测其空间学习记忆能力的变化。 3 讨论 Discussion 海马是学习记忆的主要脑区，其结构受损会导致学习记忆功能障碍，产生相关的行为学改变。从整体水平上研究学习记忆的常用手段是制备动物模型。大动物模型(如猴子)最能反应人类的真实状态，但价格昂贵，饲养条件要求较高，难以实现；小动物(如小鼠)较容易获得和饲养，常被用作学习记忆相关行为学研究的模型。然而，在人类长期培育过程中实验小鼠已分化为具有不同的生理特性的诸多品系(如C57BL 、BALB/c 、DBA 、ICR 和昆明小鼠等)，需要根据研究目的进行品系选择。 表1 两种品系小鼠自主运动后新异臂探索实验结果 (x _ ±s ，n =10) Table 1 New arm test results between two kinds of mice after voluntary movement 表注：与各自对照组比较，a P < 0.01；与BALB/c 小鼠跑轮组比较，b P < 0.05，c P < 0.01。 观察指标 BALB/c 小鼠 C57BL/6小鼠 对照组 跑轮组 对照组 跑轮组 新异臂内探索距离(cm) 462.62±37.30 1 022.70±29.35a 346.84±46.03 423.98±32.46ac 新异臂内探索时间(s) 63.20±6.79 128.49±7.10a 57.31±7.79 95.35±7.08a 进入新异臂的次数(次) 26.00±3.18 47.50±4.05 8.75±1.40 12.75±1.88b 表2 两种品系小鼠自主运动后新物体识别实验结果 (x _ ±s ，n =10) Table 2 New object recognition test results between two kinds of mice after voluntary movement 表注：与各自对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01；与BALB/c 小鼠跑轮组比较，c P < 0.05。 观察指标 BALB/c 小鼠 C57BL/6小鼠 对照组 跑轮组 对照组 跑轮组 新物体周围探索的距离(cm) 18.42±8.00 168.56±22.30a 22.58±8.49 46.25±4.72ac 新物体周围探索的时间(s) 2.89±0.75 1 3.85±1.42a 3.97±0.68 10.35±0.69b 识别新物体的次数(次) 6.5±1.35 21.4±2.08a 4.20±1.07 7.75±1.11ac 表3 两种品系小鼠自主运动后水迷宫实验结果 (x _ ±s ，n =10) Table 3 Morris water maze test results between two kinds of mice after voluntary movement 表注：与各自对照组比较，a P < 0.05，b P < 0.01。 观察指标 BALB/c 小鼠 C57BL/6小鼠 对照组 跑轮组 对照组 跑轮组 到达平台的潜伏期(s) 29.88±2.24 32.17±2.19 36.12±3.11 26.25±2.34a 到达平台的次数(次) 2.83±0.75 2.50±0.56 1.60±0.34 2.80±0.33a 在目标象限的时间(s) 15.09±1.79 15.61±1.91 12.30±0.36 17.40±0.79a 在目标象限的距离(cm) 236.73±24.66 206.02±56.70 208.26±20.17 243.51±10.79 经过平台的距离(cm) 15.14±1.70 13.66±1.51 10.65±0.65 22.67±0.96b 温馨推荐 您可前往百度文库小程序 享受更优阅读体验 不去了 立即体验 因此，在制备学习记忆相关行为学研究的动物模型时，小鼠品系的选择成为影响实验结果可信度的关键因素。目前，关于学习记忆行为学研究的小鼠模型报道很多[8-11]，但是自主跑轮运动后小鼠学习记忆的行为学指标变化在不同品系间是否存在差异及其程度仍需进一步研究证实。BALB/c和C57BL/6小鼠是基础研究中常用的、遗传背景差异较大的两类近交系小鼠[12]，且每种品系内部遗传特性稳定，个体间比较均匀相似，实验反应比较规则、整齐，重复性较好[13]，此次实验以目前实验室常用的BALB/c和C57BL/6小鼠为实验动物，研究自主运动对小鼠海马神经发生的影响及其学习记忆相关行为学指标的差异。 VitalView数据采集系统记录小鼠自主跑轮运动4周，分析结果得知BALB/c小鼠平均每天运动量为(12.16±0.52) km，是C57BL/6小鼠的2.56倍，这与Fernandes等[14]的研究结果一致，说明C57BL/6小鼠的自主运动量本身较低。诸多研究表明自主运动能够促进成年小鼠海马齿状回(Dentate gyrus, DG)区神经干细胞增殖，增加新生神经元的数目[15-19]。免疫荧光染色结果显示，自主运动后BALB/c和C57BL/6小鼠海马新生神经元标记物DCX阳性细胞较对照组增多，提示自主跑轮运动能够促进BALB/c和C57BL/6小鼠海马神经发生。神经发生是海马发挥学习记忆功能的重要事件，关于海马功能的研究方法很多，行为学实验是常用方法之一。于是，作者借助实验室常用的新异臂探索实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验检测自主运动后BALB/c和C57BL/6小鼠学习记忆行为学指标的变化。结果发现，运动后BALB/c和C57BL/6小鼠探索新异臂和新物体的次数、在新异臂内和围绕新物体探索的时间和距离均较对照组增多；但是BALB/c小鼠的探索能力优于C57BL/6小鼠，说明提示自主运动促进小鼠海马神经发生，提高其空间学习探索能力，新异臂探索实验和新物体识别实验适用于判定运动后BALB/c和C57BL/6小鼠空间学习探索能力，且BALB/c小鼠的效果更好，这可能与BALB/c小鼠自主活动量高有关。Morris水迷宫实验结果发现，C57BL/6跑轮组寻找平台的潜伏期较对照组明显缩短，到达平台次数、在目标象限探寻的时间和距离较对照组均明显增加；而BALB/c 跑轮组寻找平台的潜伏期、到达平台次数以及在目标象限和平台区探索的距离与对照组相比均无统计学差异。同样，有学者研究证明BALB/c小鼠在Morris水迷宫训练过程中学习记忆能力没有明显提高，游泳距离和速度均很低，基本处于一种无探索状态[13，20-22]；而C57BL/6小鼠训练后寻找逃生平台的潜伏期明显缩短，到达平台的次数增多[23-26]。这说明自主运动促进BALB/c和C57BL/6小鼠海马神经发生，提高其空间学习记忆能力，但要利用Morris水迷宫实验检测运动后学习记忆行为学指标的变化选择C57BL/6小鼠比较科学、合理。 综上所述，自主跑轮运动能够促进BALB/c和C57BL/6小鼠海马神经发生，二者均可作为自主运动后学习记忆行为学研究的动物模型，但在不同的行为学实验中其行为学指标并不完全一致。新异臂探索和新物体识别实验能够用于检测运动后BALB/c和C57BL/6小鼠学习记忆能力，其中BALB/c探索学习能力优于C57BL/ 6小鼠，但利用Morris水迷宫实验检测运动后小鼠空间学习记忆能力的变化优先选择C57BL/6小鼠。因此，在实际研究中选择动物模型和实验方法时需要取其优避其弊，以确保实验数据的可信度和结论的科学性。 致谢：非常感谢山西医科大学人体解剖教研室提供科研平台，感谢各位老师在课题研究过程中给予的指导和帮助。 作者贡献：第一、五作者负责课题设计，第四作者评估、审校课题、提供实验平台，第二、三作者收集资料，第一、二、五作者执行课题实施，第一作者成文，第五作者审校并对文章负责。 利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。 伦理问题：实验过程中对动物的处置符合我国相关动物伦理学的要求。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。 作者声明：文章第一作者对研究和撰写的中出现的不端行为承担。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。 文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 4 参考文献References [1] Ji JF, Ji SJ, Sun R, et al. 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