6／sIL-6R融合蛋白诱导红系祖细胞分化成熟的影响

6／sIL-6R融合蛋白诱导红系祖细胞分化成熟的影响 6,sIL-6R融合蛋白诱导红系祖细胞分化成 熟的影响 2007年6月第28卷第6期ChinJHematol,』Q:!: Notch配体—1对IL一6/slL一6R融合蛋白 诱导红系祖细胞分化成熟的影响 喻召才刘文超刘都户范黎 【摘要】目的探讨Notch配体8-1在红系造血细胞分化过程中对可溶性IL-6受体(slL-6R)生 物效应的影响.方法用CD34免疫磁珠和FACSVantage流式细胞仪筛选脐血单个核细胞中的 CD34CD38一细胞;将CD34CD38一细胞用含SCF,Fh3L,TPO和IL-3四种生长因子组合(4GFs)的培 养基培养7d,然后用CD36免疫磁珠分离CD36红系祖细胞,用流式细胞术检测IL-6R和血型糖蛋白 (GPA)的达,并分选CD36GPA—IL-6R和CD36GPA—IL-6R一细胞,将这两种表型的细胞分别进 行集落分析;将CD36GPA—IL-6R一细胞用含有4GFs,4GFs+IL-6或4GFs+IL-6/slL-6R融合蛋白 (FP6)培养基并在加与不加Notch配体8-1的情况下培养14d,并对CD36GPA成熟红细胞进行计 数.结果CD36GPA细胞中IL-6R一细胞占95%;CD36GPA一细胞可分为IL-6R和IL-6R一两部 分,分别占46%和54%;IL-6R细胞形成的粒一单核细胞集落形成单位(CFU—GM)数为2.1?1.8, IL-6R一细胞形成的红系祖细胞爆式集落形成单位(BFU—E)数为58.2?18.1,明显高于IL-6R细胞形 成的CFU—GM数(P<0.05);在含有FP6的培养体系中,CD36GPA细胞计数为 (1.400?0.180)× 10;在含FP6和Notch配体8-1的培养体系中,CD36GPA细胞计数为(2.460?0.190) ×10,明显 高于单独含有FP6的培养体系(P<0.05).结论Notch配体5-1可增强IL-6一红系 细胞分化过程中 slL-6R所介导的生物学效应. 【关键词】受体,IL-6;配体,Notch;红系祖细胞;细胞分化 EffectofNoahligandDelta-1oilthe蛐 renfiafionandmaturationoferythroidprogenitorsinhu. mallsYUZluw—cai,n—chao,Du一",肘? Li.DepartmentofOncology,XijingHospital.the Fourth肘itar~MedialUniversity.Xi'帆71O032.China Correspondingauthor:LIUWen—chao,Email:liuch@fmmu.edu.orb 【Abstract】ObjectiveToexplorethebiologicaleffectofNotchligandDelta一 1(NotchL8-1)onthe slL-6Rduringthedifferentiationoferythroidhematopoiesis.MethodsMononuclearcells( MNCs)wasiso. 1atedfromthenormalcordbloodusingFicollgraduationsolution.MNCswereenrichedforC D34CD38一 cellsbyCD34immunomagneticbeadsandaFACSVantage.CD34CD38一 cellswasculturedfor7daysin thepresenceofSCF,Fh3L,TPOandIL-3(4GFs).rheculturedcellswasdetectedfortheexpres sionofIL一 6RandGPA.ThesubsequentlyenrichedCD36erythroidprogenitorsweresortedforcellswit hIL-6Rand II,6R—usingFACSVantage.TheCD36GPA—IL.6R— cellswererespectivelyculturedinthe4GFs,4GFs+ IL-6or4GFs+n)6containingmediuminthepresenceorabsenceofNotchL8— 1for14daysandCD36 GPAredcellswerecounted.ResultsIL-6Rcellsaccoutedfor95%ofCD36GPAcells.TheCD 36 GPA—cellswasclearlydividedintoIL-6R(46%)andIL-6R一(54%)subpopulations.theIL-6Rcellsub. populationformedonlyafewGMcolonies(2.1?1.8)andagreaternumberofBFU—Ecoloniesweregenera. tedfromtheIL-6R—subpopulation(58.2?18.1)(P<0.05).rhenumberofCD36GPAcellwas (1.4OO?0.180)×1inthepresenceofFP6,lowerthanthat【(2.460?0.190)×10]inthepresenceof n)6+NotchL8-1(P<0.05).ConclusionNotchL8-1enhancestheslL-6R—mediatedeffectsofIL-6on thegenerationoferythiodcells. 【Keys】Receptors,I;Ligand,Notch;Erythroidprogenitor;Celldifferentiation IL-6是一种具有广泛生物学活性的多功能生长 作者单位:710032西安,第四军医大学西京医院肿瘤科(喻召 才,刘文超,刘都户,范黎) 通信作者:刘文超,Email:liuch@fmmu.edu.cn ? 401? ? 论着? 因子,其生物学效应主要是通过激活细胞膜上的 gpl30信号通路来实现的.IL-6可直接与膜结合型 IL-6受体(mlL-6R)结合,从而激活gpl30信号通路; 也可先与可溶性IL-6R(slL-6R)结合形成IL-6/slL一 6R融合蛋白再与gpl30结合,最终活化gpl30信号 血液学杂志2007午鱼旦箜垫鲞箜塑』旦!:』堕!型!: 通路.Notch信号在进化上高度保守并参与机体多 系统的细胞发育.已有研究表明Notch受体及配体 在造血干细胞和基质细胞上均有表达,受体及配体 相互作用所介导的Notch信号在造血中起着重要作 用,如Notch配体8—1介导的Notch信号可调节淋巴 细胞的分化.但Notch信号在红系造血过程中的作 用目前尚不清楚.我们旨在探讨Notch配体8—1介 导的Notch信号能否影响红系造血细胞分化中 slL-6R所介导的生物学效应. 材料和方法 1.主要试剂:SCF,TPO,IL-3,GM—CSF,G—CSF, EPO,IL-6,IL-6/slL-6R融合蛋白(简称FP6,将IL-6 的Ala和IL-6R的333位Ala相连而得)均购自美国 BD公司.重组Fit3配体(Flt3L)购自R&D公司. 细胞因子使用浓度:SCF50ng/ml,TPO20ng/ml, IL_310ng/n~,GM—CSF10ng/ml,G—CSF10ng/ml, EPO2U/ml,IL-610ng/ml,FP6100ng/ml,F1t3L50 ng/ml.重组Notch配体8—1(由Notch配体8—1的 胞外结构域和6个氨基酸的myc标签组成),抗myc 单抗9El0F(ab),片段由Bemstein博士惠赠(Fred HutchinsonCancerResearchCenter,Seattle,WA, USA),CD34免疫磁珠(MACS)为美国Mihenyi Biotec公司产品,FITC—CD38和PE—CD34单抗为美 国BD公司产品,无血清培养基为加拿大SereTech— nologies公司产品,重组人纤维黏结素片段CH-296 为TaKaRa公司产品.Notch配体8—1使用浓度为1 ml,PE标记的抗血型糖蛋白(GPA)抗体,生物素 标记的IL-6R抗体及PE标记的链亲合素均为BD PharMingen公司产品. 2.CD34CD38一细胞的分离:在获得患者知情 同意后,采集50m1正常足月分娩脐血.利用Ficoll 淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞,然后按操作 说明,利用CD34免疫磁珠试剂盒从单个核细胞中 分离CD34细胞.将分离所获细胞用FITC—CD38 单抗和PE—CD34单抗标记,然后用流式细胞仪 (FACSVantage,BD公司产品)分选CD34CD38一 细胞. 3.细胞培养:将细胞用含有4种细胞因子组合 (SCF,Fh3L,TPO和IL-3,简述为4GFs)的无血清培 养基在加与不加Notch配体8—1的情况下进行悬浮 培养.为了固定Notch配体8—1,我们利用5g/m1 的抗myc抗体9El0F(ab)2片段和2.5g/ml的重 组人纤维黏结素片段CH-296包被培养皿.行锥虫 蓝染色对细胞进行计数. 4.半固体集落培养:将1×10细胞接种于1ml 含30%胎牛血清,4GFs和EPO的改良eagle培养基 中;在倒置显微镜下对形成的细胞集落进行原位观 察并计数;培养7d后,进行集落分析. 5.流式细胞术分析红系造血祖细胞表型:利用 抗体进行免疫染色:PE—GPA,生物素标记的抗IL-6R 抗体.PE标记的链亲合素作为二抗.FITC一鼠 IgGl,FITC—IgG2,PE—IgGl,FITC—IgM,FITC—IgG2b, PE—IgGb或APC—IgGb作为同型对照.通过生物素标 记的抗IL-6R单抗和给定的单抗染色分析IL-6R的 表达.用FACSCaHbur流式细胞仪进行细胞表型分 析.利用碘化丙锭(PI)染色排除死细胞. 6.统计学处理:数据结果以均数4-差表 示,采用方差分析. 结果 1.CD36细胞表面IL-6R和GPA的表达:我 们检测了红系祖细胞中IL-6R的表达,发现CD34 细胞经用含有4GFs组合的培养基培养7d后可分 化生成CD36细胞,对CD36细胞再用流式细胞术 分析IL-6R和GPA的表达,结果95%的CD36 GPA细胞IL-6R表达阴性;而CD36GPA一细胞则 可分为IL-6R表达阳性和阴性两群,分别各占46% 和54%. 2.CD36GPA—IL.15R和CD36GPA—IL.15R一 细胞集落形成分析:用流式细胞仪将CD36GPA一 细胞分为CD36GPA—IL-6R和CD36GPA—IL一 6R一细胞群并进行集落形成分析,发现IL-6R细胞 形成的粒一单核细胞集落形成单位(CFU—GM)数为 2.14-1.8,而IL-6R一细胞形成的红系祖细胞爆式集 落形成单位(BFU—E)数为58.24-18.1,明显高于 IL-6R细胞形成的CFU—GM数(P<0.05).因此 CD34CD38一细胞来源的CD36GPA—IL-6R一细胞 群中含有大量的早期红系祖细胞. 3.Notch配体8—1对CD36GPA细胞生成的 影响:我们将CD36GPA—IL-6R一细胞用含有 4GFs,4GFs+IL-6或4GFs+FP6的培养基在加与不 加Notch配体8—1的情况下培养14d,对CD36 GPAhigh成熟红细胞进行计数,FP6+Notch配体8—1 培养体系中CD36GPAhiSh细胞计数明显高于FP6培 养体系(P<0.05)(表1),4GFs培养体系及4GFs+ IL-6培养体系中CD36GPA细胞计数明显低于 FP6+Notch配体8—1培养体系和FP6培养体系. 血液学杂志2007年6月第28卷第塑chIn!里:堕!: 4.Notch配体8-1对CD36GPA晚期红系祖 细胞分化为CD36GPA细胞的影响:为了更明确 地了解Notch配体8-1促进CD36GPA—IL-6R一细 胞分化为CD36GPA曲细胞,我们将CD34CD38一 细胞用含有4GFs的培养基培养14d,然后分离 CD36GPA细胞.将细胞用含有4GFs,4GFs+ IL-6或4GFs+FP6的培养基在有或无Notch配体8-1 存在的条件下培养7d,对CD36GPAhigh细胞进行计 数,发现FP6+Notch配体8-1培养体系中CD36 GPAhigh细胞计数与FP6培养体系中CD36'GPAhigh细 胞计数差异无统计学意义(P>0.05)(表1),而其 他培养体系中无细胞生长. 讨论 Notch是一种高度保守的跨膜受体蛋白家族,广 泛存在于果蝇,线虫以及脊椎动物体内,并通过与表 达其配体的细胞相互作用调节多种谱系细胞的分 化;因此,Notch在个体系统发育,模式形成,肿瘤发 生以及神经退行性疾病等生理病理过程中具有重要 作用.在脊椎动物中,Notch蛋白的同源体共有4 个,分别是Notchl,Notch2,Notch3和Notch4.其中 Notchl,Notch2,Notch3可以在多种组织器官中表 达,包括中枢神经系统,中胚层,胰腺,造血细胞,毛 发,牙齿和肾脏等.除此之外,Notch也可在各种免 疫细胞中存在,如T淋巴细胞,巨噬细胞和树突细 胞.目前已发现Notch的配体蛋白在哺乳动物中共 有5种,分别是Jaggedl,Jagged2,Deltalikel,Delta like3和Deltalike4.目前业已发现Notch配体8-1 介导的Notch信号对多种免疫细胞的发育,分化及 功能具有决定性的调节作用. 本研究结果显示,Notch配体8-1可通过增强 slL-6R介导的IL-6的生物学效应,诱导IL-6R一早期 红系祖细胞分化为CD36GPAhigh成熟红细胞.早期 红系祖细胞包含在CD36GPA一细胞的IL-6R一细胞 群中,由CD34CD38一细胞分化而来.本研究结果 证实,CD36GPA红细胞不表达IL-6R,提示从 CD36一早期红系祖细胞到CD36GPA成熟红细胞 阶段的红系细胞并不表达.以前有文献报道在 GPA不成熟红细胞中Notch1低水平表达,但在GPAhigh成熟红细胞中Notchl无表达….另有文献 报道Notch信号对人原始造血细胞向红系祖细胞分 化有促进作用.通过将人原始造血细胞在含有 Notch配体8-1和4GFs的无血清培养基中培养,我 们发现Notch配体8-1可协同FP6促进早期红系祖 细胞分化为成熟的红细胞,而Notch配体8-1单独存 在时对成熟红细胞的生成无明显影响,提示Notch 配体8-1可能通过和IL-6/slL-6R融合蛋白相互作 用在人红系造血中起着重要作用. FP6可诱导IL-6R一红系祖细胞分化为成熟红细 胞,IL-6则不具备该作用,提示slL-6R在IL-6对 IL-6R一造血细胞分化的调节作用中起重要作用]. slL-6R是由mlL-6R的mRNA通过特异性剪接产生 的.在多种疾病中slL-6R的产生会增加,血清中 slL-6R的水平是调节IL-6R一造血细胞中slL-6R介 导IL-6生物学效应的重要因素J.而本研究结果 则提示Notch是调节slL-6R介导IL-6生物学效应 的另一因素. 参考文献 1OhishiK,Varnum—FinneyB,FlowersD,eta1.Monocytesexpress highamountsofNotchandundergocytokinespecificapoptosisfollow— inginteractionwiththeNotchligand,Delta一1.Blood, 2000,95: 2847-2854. 2DandoJS,TavianM,CatelainC,eta1.Notch/Deha4interactionin humanemb~onieliverCD34CD38一cells:positiveinfluenceon BFU—EproductionandLTC—ICpotentialmaintenance.StemCells. 2005,23:550-560. 3JonesSA,Rose—JohnA.Theroleofsolublereceptorsincytokinehiol— ogy:theagonisticpropertiesoftheslL-6R/IL-6complex. Biochim BiophysActa,2002,1592:251-263. 表1CD36GPA—IL-6R一细胞和CD36GPA细胞在含不同生长因子组合的情况下 分化成CD36GPA细胞的情况(?) 注:两组比较,P<0.05:P>0.05 (收稿日期:2006-05-29)