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2015年版中国药典微生物限度检查方法考证(DOC)2015年版中国药典微生物限度检查方法考证方案(DOC)PAGE/NUMPAGES2015年版中国药典微生物限度检查方法考证方案(DOC)佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：1/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法考证方案草拟部门：QC组署名：日期：部门：QC组署名：日期：审查部门：质量部署名：日期：同意质量负责人署名：日期：质量部本文件依据需要应散发于以下部门：颁发01质量部下表用于订正/更改主要内容及历史。文件编号订正原由订正日期TS-VP-4201-00按GMP（2010年订正版）要求新拟订佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：2/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案目录概括考证目的和范围组织及职责考证进度表考证所需要的仪器设施及有关文件确实认考证所需要的菌种、培育基、查验样品确实认考证项目和考证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证--惯例倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法考证—离心积淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法考证—离心积淀-薄膜过滤法误差与漏项控制考证报告会审佛山市华普生药业有限企业概括文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：3/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案我企业生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本企业对该产品的微生物限度检查方法予以考证。经过考证以确认所采纳的微生物限度检查方法合用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文件介绍甲硝唑对细菌有抑菌特征，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，能够经过离心积淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本考证方案经过试验菌株的回收率测试，第一确认惯例倾注平皿法能否合用于本品的微生物限度检查；如惯例倾注平皿法不合用，则进一步考证可去除供试品抑菌物质的离心积淀-薄膜过滤法能否合用于本品的微生物限度检查。本考证方案依据样品特征拟订微生物限度检查方法和查验条件，按拟订的方法进行试验，依据考证结果判断能否切合考证标准。考证目的和范围考证该产品的微生物限度检查方法的合用性，对其有效性进行评论，保证查验结果的靠谱性。本考证方案采纳3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的考证。组织及职责3.1考证方案和考证报告的草拟、审查、同意考证方案由质量部QC组负责草拟，由质量部审查，最后由质量负责人同意。考证方案实行达成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法考证的结果、撰写报告，由质量部审查，最后由质量负责人同意报告。3.2考证方案的培训考证方案在经质量负责人同意后，，由QC组组长对本次考证明行的有关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。3.3考证方案实行过程中的更改和误差考证方案实行过程中若有更改和误差，质量负责人应该组织进行评估并采纳相应的控制举措。3.4考证工作小构成员表姓名部门及职务黄汉新质量负责人/质量授权人胡建新质量部QA组长曾凤敏质量部QC组长刘红华质量部QC考证进度计划表本次微生物限度检查方法考证的计划安排时间是考证所需要的仪器设施及有关文件确实认职责负责考证方案及报告的同意审查考证方案、审查考证报告并协调工作负责考证方案审查、实行、汇总报告及培训工作负责考证方案草拟、详细实行、报告工作2015年12月至2016年1月。佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：4/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案5.1.主要查验仪器设施确认表序仪器设施名称型号编号校准单位校准日期有效期至号电子天平生化培育箱生化培育箱生化培育箱立式压力蒸汽灭菌锅6生物干净安全柜检查人/日期：复核人/日期：5.2.考证所需文件确实认表文件名称文件编码能否有效版本文件保留处《人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准》□是□否质量部《人工牛黄甲硝唑胶囊查验操作规程》□是□否质量部《取样操作规程》□是□否质量部《微生物限度检查操作规程》□是□否质量部《微生物实验室洁净消毒操作规程》□是□否质量部《培育基的#管理#》□是□否质量部《检定菌的保留、传代、使用、销毁规□是□否质量部程》《LDZX-30FBS立式压力压蒸汽灭菌器□是□否质量部操作规程》《SPX-150B生化培育箱操作规程》□是□否质量部《BHC-1300IIA/B3生物干净安全柜操□是□否质量部作规程》《JJ200电子天平操作规程》□是□否质量部检查人/日期：复核人/日期：考证所需要的菌种、培育基、查验样品确实认6.1.试验菌种检查表佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：5/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案冻干菌种序号菌种名称代码根源批号1金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003中国食品药品检定研究院2铜绿假单胞菌CMCC（B）10104中国食品药品检定研究院3枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501中国食品药品检定研究院4白色念珠菌CMCC（F）98001中国食品药品检定研究院5黑曲霉CMCC（F）98003中国食品药品检定研究院6大肠埃希菌CMCC（B）44102中国食品药品检定研究院7乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094中国食品药品检定研究院检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培育基检查序号名称生产厂家能否经过培育批号基合用性试验01胰酪大豆胨液体培育基北京三药科技开发企业□是□否02胰酪大豆胨琼脂培育基北京三药科技开发企业□是□否03沙氏葡萄糖液体培育基北京三药科技开发企业□是□否04沙氏葡萄糖琼脂培育基北京三药科技开发企业□是□否05麦康凯液体培育基北京三药科技开发企业□是□否06麦康凯琼脂培育基北京三药科技开发企业□是□否07RV沙门菌增菌液体培育基北京三药科技开发企业□是□否08木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼北京三药科技开发企业□是□否脂培育基09三糖铁琼脂培育基北京三药科技开发企业□是□否检查人/日期：复核人/日期：佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：6/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案6.3.查验样品确认表序号品名批号规格能否按GMP生产厂家要求生产1人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业有限企业甲硝唑0.2g□是□否胶囊人工牛黄5mg2人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业有限企业甲硝唑0.2g□是□否胶囊人工牛黄5mg3人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业有限企业甲硝唑0.2g□是□否胶囊人工牛黄5mg检查人/日期：复核人/日期：考证项目和考证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法考证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超出5代，并采纳适合的菌种收藏技术进行保留，以保证试验菌株的生物学特征。7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中，30～35℃培育18～24小时，取此培育液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采纳10倍递加稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培育物至10ml沙氏葡萄糖液体培育基中，20～25℃培育2～3天，取此培育液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采纳10倍递加稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培育物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培育5～7天，直到获取丰富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采纳10倍递加稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下搁置，应在2小时内使用；若保留在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保留在2～8℃,在考证过的储存期内使用。考证时，对各试验菌的回收率逐个进行考证。7.3.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证--惯例倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：7/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案7.3.2.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培育3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培育5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培育箱中培育5天，点计菌落数。7.3.3.供试品比较组取1：10的供试液1ml注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，平行制备2个平皿。置30～35℃培育箱中培育5天，点计菌落数。另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀，平行制备～25℃培育箱中培育5天，点计菌落数。2个平皿。置207.3.4.菌液比较组取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培育箱中培育3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培育5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立刻倾注不超出45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培育箱中培育5天，点计菌落数。7.3.5.惯例倾注平皿法方法考证的接受标准试验组菌落数减去供试品比较组菌落数的值与菌液比较组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0.5?2范围内。7.3.6.惯例倾注平皿法方法考证的结果7.3.6.1.惯例倾注平皿法测定需氧菌总数方法考证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数12均值12均值12均值收率金黄色葡萄球菌佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：8/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数121212收率均值均值均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：7.3.6.2.惯例倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法考证结果佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：9/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数121212收率均值均值均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：5天试验菌株菌种试验组供试品比较组菌液比较组试验菌的回代数121212收率均值均值均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：7.3.7.惯例倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法考证小结依据考证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认惯例倾注平皿法合用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如惯例倾注平皿法合用于霉菌与酵母菌总数检查，但不合用于需氧菌总数检查，则下边进一步考证可去除供试品抑菌物质的离心积淀-薄膜过滤法能否合用于本品的需氧菌总数检查。7.4.需氧菌总数检查—离心积淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：10/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液储备液。取1:10的供试液储备液50ml，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。7.4.2.试验组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜2次（100ml/次），而后在第3次冲刷液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。拿出滤膜菌面向上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培育5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.3.供试品比较组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。拿出滤膜菌面向上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育5天，点计菌落数。7.4.4.菌液比较组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，200ml经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。拿出滤膜菌面向上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培育5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.5.稀释剂比较组依据7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，而后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下边的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。拿出滤膜菌面向上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培育5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.6.离心积淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法考证的接受标准试验组菌落数减去供试品比较组菌落数的值与菌液比较组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0.5?2范围内，同时稀释剂比较组与菌液比较组菌落数的比值应也在0.5?2范围内。7.4.7.离心积淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法考证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：11/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案菌试验组供试品比较组菌液比较组稀释剂比较组试验组稀释剂对试验菌种各菌株回照组各菌株代1均均均收率株回收率211212数值值值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：12/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案菌试验组供试品比较组菌液比较组稀释剂比较组试验组稀释剂对试验菌种各菌株回照组各菌株代1均1均均收率株回收率21212数值值值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：13/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案菌试验组供试品比较组菌液比较组稀释剂比较组试验组稀释剂对试验菌种各菌株回照组各菌株代1均1均均收率株回收率21212数值值值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：7.4.8.离心积淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法考证小结依据考证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂比较组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内，则可确认离心积淀-薄膜过滤法合用于本品的需氧菌总数检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此考证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。7.5.控制菌检查方法考证—离心积淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法考证--惯例倾注平皿法的试验中，证明了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不可以使用惯例倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了保证控制菌检查的靠谱性，采纳可去除供试品抑菌物质的离心积淀-薄膜过滤法进行控制菌检查，依据以下方案进行方法学考证。试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，因此选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学考证。试验菌株的传代次数不得超出5代，并采纳适合的菌种收藏技术进行保留，以保证试验菌株的生物学特征。7.5.2控制菌检查方法考证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中，30～佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：14/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案35℃培育18～24小时，取此培育液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采纳10倍递加稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。菌液制备后若在室温下搁置，应在2小时内使用；若保留在2～8℃，可在24小时内使用。考证时，对各试验菌的回收率逐个进行考证。大肠埃希菌检查方法考证供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液储备液。取1:10的供试液储备液50ml，经500转/分钟离心4分钟，取上清液得供试液。7.5.3.2.试验组取供试液10ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜2次（100ml/次），而后在第3次冲刷液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入项下制备的50～100cfu的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。取上述增菌培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中,42～44℃培育24～48小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～72小时。麦康凯琼脂培育基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。阳性比较组照项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，而后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下边的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。取上述增菌培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中,42～44℃培育24～48小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～72小时。麦康凯琼脂培育基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。阴性比较组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。阴性比较应无菌生长。离心积淀-薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法考证结果佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：15/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育基胰酪大豆胨液体培育基麦康凯液体培育基麦康凯琼脂培育基配制批号配制批号平板配制批号培育箱型号编号型号编号型号编号结果判断温度℃温度℃温度℃培育时间开始月日时开始月日时开始月日时结束月日时结束月日时结束月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育基胰酪大豆胨液体培育基麦康凯液体培育基麦康凯琼脂培育基配制批号配制批号平板配制批号型号编号型号编号型号编号结果判断培育箱温度℃温度℃温度℃培育时间开始月日时开始月日时开始月日时结束月日时结束月日时结束月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：16/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育基胰酪大豆胨液体培育基麦康凯液体培育基麦康凯琼脂培育基配制批号配制批号平板配制批号培育箱型号编号型号编号型号编号结果判断温度℃温度℃温度℃培育时间开始月日时开始月日时开始月日时结束月日时结束月日时结束月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法考证结果小结依据考证方案的要求进行试验，若试验组与阳性比较组均检出典型大肠埃希菌，阴性比较组无菌生长，则可确认离心积淀-薄膜过滤法合用于本品的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此考证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查。7.5.4沙门菌检查方法考证供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml制成1:10的供试液。取所有供试液经500转/分钟离心4分钟，取所有上清液为供试液。7.5.4.2.试验组取所有供试液，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜2次（100ml/次）。而后在第3次冲刷液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入项下制备的50～100cfu的乙型副伤寒沙门菌，过滤。取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。取上述增菌培育物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培育基,30～35℃培育18～24小时。取少许RV沙门菌增菌液体培育物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上应生长优秀，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针精选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培育基高佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：17/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案层斜面长进行斜面和高层穿刺接种，培育18～24小时。阳性比较组照项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将乙型副伤寒沙门菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，而后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下边的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲刷滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。取上述增菌培育物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培育基,30～35℃培育18～24小时。取少许RV沙门菌增菌液体培育物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上应生长优秀，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针精选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培育基高层斜面长进行斜面和高层穿刺接种，培育18～24小时。阴性比较组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量经过薄膜（孔径0.45μm混淆纤维素膜）后，取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～35℃培育18～24小时。阴性比较应无菌生长。离心积淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法考证结果佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：18/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育胰酪大豆胨液RV沙门增菌液木糖赖氨酸脱氧胆酸三糖铁琼脂培育基斜基体培育基体培育基盐琼脂培育基平板面和高层穿刺接种配制批号配制批号配制批号配制批号结果判型号型号型号型号培育断编号编号编号编号箱温度℃温度℃温度℃温度℃培育月日时月日时月日时月日时时间至月日时至月日时至月日时至月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育胰酪大豆胨液RV沙门增菌液木糖赖氨酸脱氧胆酸三糖铁琼脂培育基斜基体培育基体培育基盐琼脂培育基平板面和高层穿刺接种配制批号配制批号配制批号配制批号结果判型号型号型号型号培育断编号编号编号编号箱温度℃温度℃温度℃温度℃培育月日时月日时月日时月日时时间至月日时至月日时至月日时至月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：19/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌比较菌根源批号（菌种编号）过程增菌培育选择培育分别培育培育胰酪大豆胨液RV沙门增菌液木糖赖氨酸脱氧胆酸三糖铁琼脂培育基斜基体培育基体培育基盐琼脂培育基平板面和高层穿刺接种配制批号配制批号配制批号配制批号结果判型号型号型号型号培育断编号编号编号编号箱温度℃温度℃温度℃温度℃培育月日时月日时月日时月日时时间至月日时至月日时至月日时至月日时试验组阳性比较组阴性比较组试验人/日期：复核人/日期：乙型副伤寒沙门菌检查方法考证结果小结依据考证方案的要求进行试验，若试验组与阳性比较组均检出典型乙型副伤寒沙门菌，阴性对照组无菌生长，则可确认离心积淀-薄膜过滤法合用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此考证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查。误差与漏项控制：微生物限度检查方法考证过程中存在和发现的任何误差与漏项，都应进行详尽的记录，并应按企业GMP文件《误差办理规程》进行检查与办理。误差检查与办理的报告和支持文件，应作为此确认方案的附录部分。误差和漏项记录表误差和漏项：办理过程：检查人/日期：复核人/日期：佛山市华普生药业文件种类：技术标准奏效日期：文件编码：TS-VP-4201-00页数：20/20有限企业人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法考证方案9.考证报告会审考证报告会审表人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度考证项目名称考证项目负责人黄汉新检查方法考证考证起止日期考证报告编号R-TS-VP-4201-00考证结论：评论和建议：考证报告会审人署名草拟部门：质量部QC组署名/日期：部门：质量部QC组署名/日期：审查部门：质量部QA组署名/日期：同意质量负责人署名/日期：