耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核
表达载体的构建
?
984?中国药物与临床2010年9月第lO卷第9期ChineseRemedies&ini塑 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
mecA基因原核表达载体的构建
郭慧芳张燕军
【摘要】目的对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因片段进行扩增表达,纯化及鉴定.方
法应用聚合酶链反应(PCS)扩增技术获得编码PBP2a转肽酶区的meeA基因片段,将此目的基因片段与pET一
21a(+)载体连接,构建pET一21a(+)一mecA的重组质粒,经双酶切,测序正确后,将重组质粒转入E.coliBL21DE3
中.用IPTG诱导meeA融合蛋白,并对表达产物进行鉴定.结果构建了mecA基因的原核表达载体,并获得高效
表达.结论获得了mecA基因编码的PBP2a蛋白,为MRSA的耐药机制,药物治疗等进一步研究奠定了基础.
【关键词】葡萄球菌,金黄色;基因;青霉素结合蛋白2a
ConstructionofaprokaryoticexpressionvectorofmecAgeneinMRSAGUOHui-fang,ZH
ANGYah-jan.De—
partmento厂Clinicol己aboratory,ShanxiProvincialPeopleSHospit01,Taiyuan030012.China
【Abstract】ObjecfiveToamplifiy,express,purifyandidentifythemecAgenefragmentofmethicillin—resistant
Staphylococcusaureus(MRSA).MethodsPCRamplificationwasusedtoobtainmecAgene
fragmentcontaining
transpeptidasePBP2acodingregion,whichwasconjugatedwithpET一21a(+)carriertoestablishrecombinantplasmid ofpET一21a(+)一mecA.Afterdoubleenzymedigestionandsequenceverification,therecombinantplasmidw
astrans—
formedintoEcoliBL21fDE3).IprrGinductionofmecAfusionproteinwasperformedandex
pressionproductswere
verified.ResultsTheprokaryoticexpressionvectorofmecAgenewasestablishedwithahigh
lyefficientexpression.
ConclusionAnmecAgenefragmentcodingPBP2aproteinwasobtained,whichmayprovide
abasisforfurtherstudy
ofdrugresistanceandmedicaltreatmentofMRSA. 【Keywords】Staphylococcusaureus;Gerie;PBP2a 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是威胁人
类健康的重要耐药致病菌之一[,随着其感染率的
不断上升,已引起全球范围内的广泛关注.MRSA不
仅对B一内酰胺类抗生素均耐药,而且对氨基糖苷
类,大环内酯类,四环素类,氟喹诺酮类,磺胺类,利
福平均产生不同程度的耐药.MRSA的检出率正逐
年递增.耐药情况也愈发严重,一旦临床上出现
MRSA的感染,对于临床医生来说都是很棘手的.
MRSA的主要耐药机制与其mecA基因大量表
达一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a有关,PBP2a
与8一内酰胺类抗生素结合活性很低,可替代高亲和
力的PBPs行使功能,因此了解关于PBP2a的结构
和功能,对于研究和开发拮抗MRSA的药物具有重
要的指导意义.本研究应用聚合酶链反应(PCR)方
法扩增出mecA基因片段,克隆至原核表达载体,诱
导其在大肠杆菌中表达,以期为后续的药物研发,检
测试剂盒的研制等提供数据.
1材料与方法
基金项目:山西省人民医院青年基金(200751) 作者单位:030012太原,山西省人民医院检验科 1.1菌株来源:2008年8月至2009年8月.我科共 收集134株MRSA,从中选取20株进行试验. 1.2主要试剂:pET一21a(+)质粒,大肠杆菌XL1一 BLUE,细菌DNA柱提取试剂盒,质粒抽提试剂盒, DNA胶回收试剂盒均购自上海生物工程有限公司: MRSA分离株,ATCC25923由本科微生物室保存;限 制性内切酶为Takara公司产品;所有引物由上海生 物工程有限公司合成
1.3主要实验仪器:Vilber凝胶成像
系统 (France);Mx3000P基因扩增仪(美国).
1.4MRSA菌株的鉴定:所有我室保存的MRSA菌 株均是由头孢西丁筛选得到的.从中选取2O株进行 mecA基因的检测.引物:上游5一GCAATCGC— TAAAGAACTA一3,下游5一TGGGACCAACATAAC— CTA一3,以敏感的金黄色葡萄球菌的
菌株 ATCC25923为阴性对照进行PCR,在加好的PCR 体系中分别直接接种2O株MRSA(约0.5)作为 模板,条件为94?变性5rain后,94?30S,50oC 30s,72eC40S循环30次,72.C延伸10rain结束. 1.5mecA基因的PCR扩增:?细菌DNA模板的制 中国药物与临床2010年9月第lO卷第9期
ChineseRemedies&Clinics,September2010,v01.1O,No.9
备:用接种环挑取单个菌落接种于装有5mlLB培 养液的锥形瓶中,37?,150r/min恒温摇床过夜;取 出培养瓶.取1.5ml置于EP管中.按DNA提取试
剂盒,用柱抽提的方法提取出DNA.?引物:上游:5一 CCGGATCCACTATTCATGCTAAAGITCAAAAG一3. 下游:5一CCCAAGCTYATI~CATCTATATCGTA1_I?,一 1rrATTA一3.?扩增:反应体系:细菌DNA模板1 l,10mmol/L的引物各4,dNTP8l,反应缓冲液 2Ol,加灭菌去离子水至总体积5Ol.PCR反应条 件为94?变性5min后94?30S.48cc30S和 72cClmin,循环35次,72?延伸10min结束反 应;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,并进行琼脂糖凝 胶回收
1.6目的基因与载体连接:?将纯化的目的基因片 段,与PET一21a进行BamHI和HindIII双酶切.37 ?过夜.?将酶切后的目的基因和pET一21a进行连 接(配好体系后,4?过夜).
1.7重组子提取和鉴定:?感受态细菌DH5o~的制 备:将E.coliDH5c~在LB培养基分离两代后转移到 一
无菌的,冰预冷的聚丙烯离心管中,冰上放置l5 min,4000r/rain,4?离心20min,弃上清.加入预冷 的10ml0.1mol/LCaC1悬浮细菌,冰上放置lO min,弃上清.加入预冷的1ml0.1mol/LCaC1(含 15%甘油)悬浮细菌.分装(80Ixl/管)于预冷的离心 管中.一70?保存备用.?连接产物的转化:取出感 受态细菌,一管加入mecA—pET21a连接物5l,另 管中加入一标准质粒1Ixl,混匀后置于冰上30min. 42?水浴60S.迅速放置冰上3,5min,每管中加入 900txlLB(不含Amp),置37cc摇床震摇1h.?质 粒DNA的提取鉴定:蓝白斑筛选细菌菌落后,进行 质粒抽提,并送上海生工生物工程技术服务有限公
司测序分析.
1.8mecA基因的诱导和表达:将确证的pET一21a (+)一mecA转化到感受态E.coliBL21(DE3)中,挑取 单菌落,接种于含2mlLB/Amp+试管中,37qC震摇 (225r/min)过夜,次日将过夜菌以1:40倍稀释后再 37继续震摇.取出1ml细菌做对照用,其余菌液 分于4个大试管中,分别加入IPTG至终浓度为 0.5,1,2,4mmol/L,继续震摇4,5h,各取出1ml菌 液加入到1.5ml离心管中,12000r/min离心1min 收集细菌,向沉淀中加入50l2×十二烷基硫酸钠 (SDS)上样缓冲液,混匀后煮沸5min,取20l进行 10%SDS一多丙烯酰胺冻胶电泳(PAGE),80V电泳2 ?
985?
h.电泳结束后,考马斯亮蓝染色.
1.9重组蛋白纯化和鉴定:挑选一株表达量多的细 菌,IFrG诱导融合蛋白表达,取诱导后菌液.经离 心,重悬,溶菌,温育等过程后,得到不溶的包涵体. 经两次透析复性,测AA的值,按公式计算蛋白 浓度.取融合蛋白10l进行10%SDS—PAGE,80V 电泳2h进行鉴定,确定其相对分子质量是否正确. 其余冻存于一20?冰箱.
2结果
2.1MRSA鉴定结果:20株经头孢西丁筛选的 MRSA有l8株在223bp处出现明显条带.将没有 出现mecA基因的2株细菌去除后.其余进行后续 试验.
2.2mecA基因的扩增:经PCR扩增后的产物进行 电泳,在1000bp处出现明显条带,与片段预期结果
一
致见图1
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
M:DNAmarker;l:lilacA 图1PCR扩增目的基因片段
2.3重组质粒pET一21a(+-mecA酶切鉴定结果: 将重组子pET一21a(+)一mecA同时用进行BamHI 和Hindm双酶切后.进行凝胶电泳.可以看到含有 插入片段的重组载体.经酶切后得到1条约为3400
,与实验预期相符.见图 bp及l条1000bp的条带
2
3400bo
1000bp
1:pET一2la(+)质粒(未重组的);2,4:经BamHI和Hing~[酶切过 的不同pET一21a(+),meeA重组质粒;M:marker 图2重组质粒PET一21a(+)一mecA双酶切鉴定 ?
986?中国药物与临床2010年9月第10卷第9期ChineseRemedie—
s&—
Cli—
nics
2.4重组子的测序:将重组子送上海生物工程技术 服务有限公司进行测序.测序结果与Genebank X52593基本一致.
2.5重组蛋白的表达与纯化:重组质粒经IPTG诱 导后.在38000bp处新增明显条带,且基本未见杂 蛋白带.见图3.
175ooO
83ooO
62O00
475o0
3250o
250oO
l65o0
6500
M:marker;I:对照组:2:1P'I~诱导后的重组质粒;3:纯化后的融台蛋白
图3重组蛋白的表达与纯化
3讨论
MRSA产生4种主要的青霉素结合蛋白PBPs, 即PBPI,PBP2,PBP3和PBP4.PBPs是细菌细胞壁 合成过程中所必需的转肽酶,它通过催化肽链之间 的连接,构成细胞壁肽聚糖的多层网状立体结构, 13一内酰胺类抗生素通过与PBPs结合而抑制PBPs 的酶活性,阻碍细胞壁黏肽合成,使细菌细胞壁缺 损,菌体膨胀崩解;而MRSA产生了一种特殊的 PBP2a.PBP2a约含有668个氨基酸,相对分子质量 约为78000.该蛋白由N一末端跨膜区,非青霉素结 合区和转肽酶区三部分组成[2],第327,668位氨基 酸为转肽酶区,内含低亲和力的B一内酰胺类抗生素 作用的位点,因而很少或不被该类抗生素结合,当 B一内酰胺类抗生素破坏高亲和力PBPs时,PBP2a 仍能维持细菌的生长和繁殖,表现出耐药性. MRSA的耐药决定因子为mac,其中mecA为结
构基因.它大量表达这种特殊的编码PBP2a蛋白, 从而导致了金黄色葡萄球菌耐药.mecA基因是金黄 色葡萄球菌通过转座机制获得的外来基因,它不仅 介导金黄色葡萄球菌对B一内酰胺类抗生素的耐药 性,而且mecA基因所在的DNA片段SCCmec还能 不断的获得积累其他的耐药基因,促进金黄色葡萄 球菌多重耐药性的发展.
选择的质粒pET系统是目前最理想的利用大
肠杆菌表达外源基因的原核载体之一.具有如下优点:?N端含有17启动子,1_7转录起始元件,17启 动子是目前大肠杆菌中最强的启动子,只有在1_7噬 菌体RNA聚合酶的作用下才能被启动;?载体上有 大肠杆菌trxA基因,编码109个氨基酸的硫氧化蛋 白,外源蛋白与硫氧化蛋白的融合表达可以保护外 源蛋白不易被降解:?具有氨苄青霉素抗性基因,可 以抑制大肠杆菌其他基因的表达,从而提高目的基 因的表达效率,同时还可作为阳性克隆的筛选标志; ?含有laclq阻遏蛋白基因.可诱导高效表达;?c 端含有HisTag.便于镍柱亲和层析纯化蛋白. 金黄色葡萄球菌能引起严重的感染,广泛向社 区扩散,而且其严重的耐药性使之成为世界范围内 医学领域的一个重要难题.因此对其耐药机制的研 究成为众人关注的热点,近年来,随着各种检测技术 的进步,金黄色葡萄球菌的耐药机制也更为清晰,由 于mecA基因的存在是MRSA耐药性表达的前提, 所以本实验针对其mecA基因进行研究.在基因水 平上对mecA原核表达载体的构建,诱导其在大肠 杆菌表达,这对进一步研究其生物学特性以及结构 和功能有重要意义.也为深入研究MRSA的耐药机
制及抗MRSA的新型药物的设计提供理论依据.
参考文献
1PearsonH.Bacteriadefte8last—resortantibiotic.Nature,2002,6: 469
3/JimD,StrynadkaNCJ.Structuralbasisforthep—lactamresis-
tanceofmethicillinresistantstaphylococcusaureus.NatstrutBi-
ol,2002,9(11):870.
2樊新,岳乔红,杨柳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因
的鉴定分析.现代检验医学杂志,2007,22(6):66—67.
(收稿日期:2010—06—24)