TRPV4在气道压力诱导大鼠气道黏液高分泌中的-第三军医大学学报

TRPV4在气道压力诱导大鼠气道黏液高分泌中的-第三军医大学学报 TRPV4在气道压力诱导大鼠气道黏液高分泌中的作用 吴砚樵，周向东 摘要:目的 探讨机械通气产生的气道压力对大鼠气道黏液高分泌的影响及机制。方法 48只SD大鼠随机分为4组，实施麻醉和气管切开后接小动物呼吸机进行机械通气。对照组: 大鼠气管插管后自主呼吸;(2)机械通气组:再分10cmHO，20cmHO，30cmHO 3个气222 道压力水平，每个压力水平8只大鼠机械通气6小时;(3) 钌红干预组:施加机械通气前鼠 尾静脉注射TRPV4非特异性阻断剂钌红(ruthenium red, RR)进行预处理;(4) 4α-PDD干预 组:机械通气前鼠尾静脉注射4-α-佛波醇-12,13-二癸酸(4-α-phorbol-12, 13-didecanoate, 4α-PDD)进行预处理。实验完毕后收集大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。采用 ELSIA法检测BALF中MUC5AC蛋白含量，RT-PCR法检测大鼠肺组织MUC5AC mRNA 达水平。结果 与对照组相比，机械通气组MUC5AC蛋白及mRNA表达水平均增加， 30cmH2O压力水平呈显著增加(P<0.01)，这一作用可被RR减弱(P<0.05),被4α-PDD增 强(P<0.05)。结论 机械通气产生的气道压力可以通过作用于TRPV4诱导MUC5AC表达 增加,这可能是压力诱导气道黏液高分泌的调节机制之一。 【关键词】 压力;黏蛋白类;机械通气;瞬时感受器电位香草酸受体4;气道;大鼠 Role of transient receptor potential vanilloid 4 in the effect of high airway pressure on airway mucous hypersecretion in rat WU yan-qiao， ZHOU Xiang-dong. (Department of Respiratory Medicine，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China) Abstract: Objective To investigate the effect of high airway pressure by mechanical ventilation on the mucin (MUC)5AC expression in rat and its possible signaling pathway. Methods Forty eight Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups. After anesthesia and tracheotomy were performed,the rats were challenged with tracheal cannula and received ventilation with small animal ventilator.Control grup keep spontaneous breath without mechanical ventilation; Mechanical ventilation group were respectively ventilated with 10,20 and 30cmHO airway pressure levels 2 for six hours,(n=8); Ruthenium red (RR) pre-treatment group were injected with RR, an antagonist of TRPV4 before ventilation; 4-α-phorbol-12,13-didecanoate(4α-PDD) pre-treatment group were injected with 4α-PDD ,an agonist of TRPV4 before ventilation.Rats were sacrificed and the bronchoalvelar lavage fluid(BALF) and lung tissue were collected and stored with correct methods. The MUC5AC protein was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，MUC5AC mRNA level was analyzed by RT-PCR. Results Compared with control group,the expression of MUC5AC protein and mRNA were higher in mechanical ventilation group,and significantly higher in 30cmHO airway pressure level(P<0.01).After pretreatment 2 with RR, the relative content of MUC5AC protein and mRNA were decreased significantly in 30cmHO airway pressure level (P<0.05). After pretreatment with 2 4α-PDD, the relative content of MUC5AC protein and mRNA were significantly higher in 30cmHO airway pressure level (P<0.05). Conclusions Mechanical 2 ventilation with higher airway pressure can significantly up-regulates the expression of MUC5AC protein and mRNA.This process may through TRPV4 signal pathway。 Key words:Pressure; Mucin;Mechanical Ventilation;TRPV4;airway; Rat 呼吸机在临床中应用日益广泛，正压机械通气必然会带来远高于自主呼吸的 气道压力，增高的气道压力又会给肺组织带来一系列生理和病理改变。我们通过 前期实验发现慢性机械压力可以诱导气道上皮细胞MUC5AC表达增加[1]，但该 研究是针对细胞模型施加静态压力，而机械通气时气道压力是一个动态变化过 程，能否诱导黏液高分泌国内尚未见相关报道。瞬时感受器电位香草酸受体4型 通道蛋白(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)是一种已知的机械敏 感性离子通道，在呼吸系统中广泛表达，研究表明其在呼吸机相关性肺损伤的初 始阶段发挥了重要作用[2]。因此我们推测机械通气时的高气道压力有可能通过 TRPV4诱导气道黏液高分泌。本实验通过不同压力水平的机械通气，进一步探讨 气道压力与黏液高分泌的关系，以及TRPV4在这一过程中的作用，以期更深入研 究气道黏液高分泌的信号传导机制。 材料与方法 一、材料 1. 主要材料: SD大鼠(重庆医科大学实验动物中心);小动物呼吸机Inspira ASVP(Harvard公司);辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG(中杉金桥公司);小鼠抗大鼠呼吸道粘蛋白单克隆抗体 RTE11(美国SH Randell 教授惠赠);MUC5AC PCR引物(上海生工生物公司合成);ELISA试剂盒(碧云天公司)，4-α-佛波醇-12,13-二癸酸(4-α-phorbol-12,13-didecanoate,4α-PDD)、钌红(ruthenium red,RR)(Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。 二、方法 1. 大鼠机械通气实验模型:20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠后行气管切开，插入自制气管导管，除对照组外均与小动物呼吸机相连接，采用小动物呼吸机的ASVP压力控制模式机械通气，根据不同实验组设定气道压力，吸入气为空气，F=40次/min，通气时间为6小时，机械通气大鼠维库溴铵肌注保持肌松。 2. 分组与干预因素:健康雄性SD大鼠48只，体质量250-300g，随机分为:(1)对照组:大鼠气管插管后自主呼吸;(2)机械通气组:分10cmHO，20cmHO，2230cmHO 3个气道压力，每个压力水平8只大鼠机械通气6小时;(3)RR干预组:2 施加机械通气前鼠尾静脉注射20μM RR进行预处理，其余条件不变;(4) 4α-PDD干预组:施加机械通气前鼠尾静脉注射30μM 4α-PDD进行预处理。 3. 检测样本获取:通气结束后腹主动脉放血处死大鼠，气管导管内缓慢注入5ml无菌生理盐水至各肺叶均匀膨胀，然后吸出，重复3次，收集3次灌洗液，3000 r/min离心10 min后取上清液待测。收集各组大鼠肺组织，冷冻粉碎，分别称取100mg待测。 4. ELISA法检测MUC5AC含量:取BALF上清液50μL，与50μL重碳酸盐一起于40?包被96孔板，干燥，PBS洗板3次，含2%牛血清白蛋白的PBS室温封闭1 h;再次洗板，加入1:500稀释的抗大鼠气道MUC单抗RTE11 100ul，37?孵育1 h，加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1:10000) 37?孵育1h，四甲基联苯胺过氧化物酶溶液显色，终止反应后测各孔A值(λ=492m)，得到MUC5AC的相对值: 5.RT-PCR法检测黏蛋白MUC5AC mRNA 采用Trizol法分别提取各组肺组织样本总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测RNA在260、280 nm的吸光度值，确保比值介于1.6-1.8，保存于-20?备用。随后以两步法行RT-PCR，MUC5AC的 PCR引物序列:上游5’-TGTTCTATGAGGGCTGCGTCT-3’， 下游5’-ATGTCGTGGGACGCACAGA-3’。参照试剂盒合成cDNA第一链，然后行PCR扩增。扩增条件:94?预变性3min终止;紧随35个循环，每一个循环94?变性30s，64?复性30s，72?延伸90s，后72?延伸5min补齐末端。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，约103bp处为MUC5AC目的基因片段，在240bp处有GAPDH基因片段。电泳结果经光密度面积积分分析，以与管家基因GAPDH mRNA的比值作为目的基因mRNA的相对含量。 6. 采用SPSS 10.0统计软件包分析，检测结果以均数?差(?s)表示，多组间比较行单因素方差分析，如差异有统计学意义，再进行组间的两两比较(t检验)，P<0.05为差异有统计学意义: 结 论 1. 1. 不同压力水平机械通气对BALF中MUC5AC蛋白含量的影响 与对照组相比，机械通气后各组MUC5ACmRNA、蛋白表达均有增加，且 30 cmHO压力水平的MUC5AC转录和表达水平与对增加呈压力梯度依赖性，2 照组相比显著升高(P<0.01)，与前期细胞模型实验结果相符。后续实验采用30cmHO压力水平作为RR和4α-PDD干预对象，见图1、表1. 2 M:Maker;1:对照组;2:10 cmHO;3:20 cmHO;4:30 cmHO 222 图1 RT-PCR检测不同压力机械通气对MUC5AC mRNA的影响 表1 不同程度的压力对 MUC5AC含量的影响(?s，n=8) 组别 MUC5AC mRNA MUC5AC 对照组 1.68?0.35 0.29?0.05 10cmHO组 2.54?0.42 0.38?0.07 2 20cmHO组 3.18?0.81 0.44?0.03 2 30cmHO组 6.23?0.54* 0.71?0.10*2 注:与对照组相比，* P<0.01 2. RR及4α-PDD干预对MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白表达的影响 给予RR预处理后，降低了30 cmHO压力水平机械通气组MUC5AC蛋白含量2 及mRNA表达水平(P<0.05)，给予4α-PDD预处理后30 cmHO压力水平2MUC5AC蛋白含量及mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，见图2、表2。 M:Maker;1:30 cmHO;2:RR干预组;3:4α-PDD干预组 2 图2 各组MUC5AC mRNA表达水平 表2 各组MUC5AC转录及表达以及p-ERK数量的变化(?s，n=8) 组别 MUC5AC MUC5AC mRNA 30 cmHO组 0.71?0.10 6.23?0.54 2 RR干预组 0.41?0.06* 4.15?0.22* 4α-PDD干预组 1.12?0.09* 8.47?0.35* 注:与30cmHO组相比，*P<0.05 2 讨 论 气道黏液高分泌的刺激因素及信号传导途径错综复杂，物理刺激因素如:温度、渗透压、剪切力、机械牵张等是近年来研究的新方向。肺作为一个动力器官，伴随呼吸运动一生都要处在机械力作用下，气道压力是重要的机械力学因素之一。哮喘、COPD等病理状态使气道压力上升，作为治疗手段的正压机械通气使气道压力处于更高水平。高气道压力可导致直接气压伤，并能通过诱导各种细胞因子和炎性介质的释放导致一系列细胞结构及功能改变:因此研究气道压力对黏液高分的影响具有可行性及临床意义。 TRPV4是瞬时感受器电位离子通道家族(Transient receptor potential，TRP) 香草酸受体亚族成员。TRP家族在哺乳动物体内多承担着细胞感受器的角色，将 2+细胞外环境的变化转导为细胞膜兴奋性和第二信使信号(如Ca)的变化，感受细胞内外的各种刺激。TRPV亚族有6个成员，均属非选择性阳离子通道，对钙离子具有较高通透性。其中TRPV4在呼吸系统表达相对较多，气道上皮细胞、气 2+道平滑肌细胞、肺泡壁、肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞上均有表达[3-5]。Ca是重要的细胞内信号转导分子，参与膜的兴奋性、神经递质的释放、突触传递、 2+肌细胞的收缩等重要生理功能的调节。Ca也是黏液高分泌重要的细胞内调节因 2+素，NE、ROS等已知的黏液高分泌强刺激因素可以通过Ca离子内流引发的细胞内游离钙离子浓度波动调控MUC分泌的快速启动和分泌程度[6-7]。Zhu等研究发现COPD发病与TRPV4基因多样性有关[8]。Karmouty-Quintana等报道通过核磁共振可以检测到TRPV1特异性激活剂辣椒素引发的大鼠气道黏液分泌增加[9]。Hamanaka等在对大鼠离体肺进行高气道峰压(Peak inflation pressure，PIP)机械通气致急性肺损伤模型的研究中，发现TRPV4的激活可通过Ca2+内流增加导致肺血管内皮通透性增加及肺泡中隔屏障的破坏[10]。因此我们推测机械通气产生的高气道压力很有可能通过TRPV4途径影响黏液高分泌。国外研究还显示TRPV4与气道粘膜纤毛的摆动频率(Ciliary beat frequency ，CBF)有关[11]，表明其还可能参与了气道黏液清除机制。 本实验采用不同压力水平的压力控制通气作用于SD大鼠气道，实验模型更接近于临床实际，更进一步从动物模型验证了压力对气道黏液高分泌的影响。与对照组相比ELISA法和RT-PCR法显示机械通气组大鼠BALF中MUC5AC蛋白含量及MUC5AC mRNA转录水平增加，并且与压力水平呈正相关，30cmHO压力2组呈显著增加，表明机械通气导致的高气道压力确实能够在基因转录及蛋白表达水平上诱导MUC5AC合成。进一步实验发现对30cmHO压力组给予钌红预处理2 后，MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白表达均呈明显下调，而给予4α-PDD预处理后，MUC5AC转录及蛋白合成均明显增加，表明TRPV4离子通道确实参与了机械压力诱导MUC5AC高分泌信号转导过程。 本研究结果表明气道压力可诱导MUC5AC的过度分泌，机械敏感性离子通道TRPV4参与其中，深化了我们对气道黏液高分泌调控机制的认识，为气道黏液高分泌疾的研究提供了新的方向。 参考文献 [1]. 吴砚樵,周向东, 慢性机械压力诱导气道上皮黏蛋白5AC的表达[J]. 第三军医大学学报, 2010. 32(15): p. 1597. 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