两种测定化合物对真菌菌丝生长抑制活性方法的比较

两种测定化合物对真菌菌丝生长抑制活性方法的比较 天然产物研究与开发 N a t P rod R es D ev 2009 , 21: 577 2580 ( ) 文章编号 : 100126880 200904 20577 204 两种测定化合物对真菌菌丝生长抑制活性方法的比较 3 刘 浩 ,张 娜 ,阴春晖,王蓟花 ,马 占鸿,周 立刚 中国农业大学农学与生物技术学院 ,北京 100193 摘 要 :采用带毒平板法和液体培养法测定两种植物抗菌化合物血根碱和白屈菜红碱对植物病原真菌水稻纹 ( ) ( ) ( 枯病菌 R h izocton ia solan i、番茄枯萎病菌 Fusa rium oxysporium f. sp. lycopersici和棉花枯萎病菌 F. oxysporium)f. sp. vasinfectum 的抑制活性 。论文对两种测定方法进行了比较和讨论 ,结果发现 : 和带毒平板法相比 ,采用液 体培养法获得的化合物半抑制浓度要低 。 关键词 :抗真菌化合物 ;带毒平板法 ;液体培养法 ;植物病原真菌 ;菌丝生长 中图分类号 : Q946. 887; R285. 5; S482. 2 文献标识码 : A C om pa r ison be tween Ra d ia l Grow th A ssa y an d L iqu id Su spen s ion C u lture A ssa y for Screen in g of An t ifun ga l Na tura l C om poun d s 3L IU H ao, ZHAN G N a, Y IN Chun2hu i, WAN G J i2hua, MA Zhan2hong, ZHOU L i2gang C ollege of A g ronom y and B iotechnology, Ch ina A g ricu ltu ra l U n iversity, B eijing 100193, Ch ina ( A b stra c t: Inh ib ito ry ac tivitie s of sangu ina rine and che le ryth rine on the m yce lia l grow th of p lan t p a thogen ic fungi . i e. ) R h izocton ia solan i, Fusa rium oxysporium f. sp. lycopersici and F. oxysporium f. sp. vasinfectum we re sc reened by u sing bo th rad ia l grow th a ssay and liqu id su sp en sion cu ltu re a ssay. The two a ssays fo r sc reen ing of an tifunga l ac tivity of na tu ra l ( ) compound s on m yce lia l grow th we re comp a red and d iscu ssed. A s a re su lt, m ed ian inh ib ito ry concen tra tion ICva lue s 50 of the compound s ob ta ined by liqu id su sp en sion cu ltu re a ssay we re lowe r than tho se by rad ia l grow th a ssay. Key word s: an tifunga l compound; rad ia l grow th a ssay; liqu id su sp en sion cu ltu re a ssay; p lan t p a thogen ic fungu s; m yce lia l grow th 由于病原菌易产生抗药性 ,同时一些杀菌剂的 ,目前主要采用带 长的抑制活性测定具有其特殊性 [ 7 , 8 ] 长期使用会造成残留致使环境受到污染 ,这就要求 毒平板法和液体悬浮培养法两类方法 。本研究 不断开发出新型的杀菌剂种类 以两种植物抗菌成分血根碱和白屈菜红碱为例子 ,以满足农业 、食品以 , [ 1 23 ] 及医药等领域对杀菌剂的需求 。对候选化合物 分别采用带毒平板法和液体悬浮培养法测定其抗菌 进行有效 、快速 、灵敏的抗菌活性评价是杀菌剂筛选 活性 ,并对这两种方法的测定结果进行比较和分析 , 和研发中的重要环节 ,针对抗细菌和抗真菌活性成 以期获得较为理想的检测化合物对真菌生长抑制活 分的筛选 ,目前常用的抗菌活性测定方法主要有 :药 性的方法 ,为将来有效地采用丝状真菌筛选抗菌活 () 剂扩散法 如打孔药剂扩散法 、滤纸片法 、杯碟法 、 性成分提供依据 。 (生长速率法 如带毒平板法 、液体悬浮培养法 、多孔 1 材料与方法 ) 板比浊度法 、孢子萌发法 、通过检测细胞酶活性的 [ 4 26 ] 1. 1 供试抗菌化合物与仪器设备分光光度法等 ,这些方法各具优点 ,同时也存在 [ 7 , 8 ] ( )( 血根碱 Sangu ina rine和白屈菜红碱 Che le ryth2 一定的局限性 。 ()( ) ()与单细胞真菌 如酵母菌 和细菌相比 ,丝状真 rine系 从 罂 粟 科 Pap ave raceae 博 落 回 M acleaya 1 )菌生长易成团 ,不均一 ,因此活性成分对丝状真菌生 co rda ta 地上部分分离得到 ,纯度为 98 % ,并对其 H 13 [ 9 ] NMR、C NMR、熔点等数据进行了确认 , 制备的 血根碱和白屈菜红碱的 TLC和 H PLC等层析行为与 收稿日期 : 2008 209 201 接受日期 : 2008 211 210 从中国药品生物制品检定所购 买的 标 准品 完全 一 ( ) 基金项目 : 国家科技支撑项目 2007BAD57B02, 2008BADA5B03; ( ) 高等学校博士学科点专项科研基金 20060019048 ( )致 。多菌灵 Ca rbendazim 购自江苏吴县市农药厂 , 3 通讯作者 Te l: 86 210 262731199; E2m a il: lgzhou@ cau. edu. cn ( ) 1 %的有机溶剂 , 摇床培养 25 ?, 暗 , 150 r /m in 5 纯度为 95 % ,用无菌水配成合适浓度 。所用的化合 ,8 d,每天取出 3 瓶 , 采用过滤法收集菌丝 , 于 60物试剂均为分析纯 。以上溶液均于 4 ?避光保存 。 () 蒸汽灭菌器 L S2B 55L ,江阴滨江医疗设备厂 ; 全温?下烘干至恒重 ,求其平均值 ,在此基础上绘制菌丝 ( (振荡器 H ZQ 2Q ,哈尔滨东联电子技术开发有限 公生长曲线 ,即可得到最佳收获期 水稻纹枯病菌 、番 ) ( 司 ;光照培养箱 H PQ 2280B ,哈尔滨东联电子技 茄枯萎病菌和棉花枯萎病菌的最佳收获期分别为 : ) ( ) 术开发有限公司 ;超净工作台 FLC23 ,哈尔滨东联 6、5 和 4 d。接下来 ,将供试样品用合适的溶剂配 ) (电子技术开发有限公司 ;电子分析天平 AL104 ,梅 成系列浓度的母液 : 2. 0、1. 5、1. 0、0. 5、0. 25、0. 125 ) (μ特勒 2托利多仪器上海有限公司 。 和 0. 0625 m g /mL ,然后取一定量 即 : 300 L 化合 ) 物母液于 30 mL 培养液中 于真菌培养液中 , 此时 1. 2 供试真菌及其培养 ( f. sp. lycop2 化合物在培养液中的浓度分 别为 : 20、15、10、5. 0、 Fusa rium番茄枯萎病菌 oxysporium ) ( μersici;缩写为 F. o. l. 、棉花枯萎病菌 F. oxysporium 215、1. 25、0. 625 g /mL。用接种针将 制备 好的 菌 ) () f. sp. vasinfectum ; 缩写 为 F. o. v. 和 水 稻 纹 枯 病 菌 饼 直径为 5 mm 挑到 混合 好 的带 毒 PDB 培养 液 ( ) ( R h izocton ia solan i,由中国农业大学植物病理学系 中 , 1个三角瓶中接种 1 个菌饼 。然后摇床培养 25 ) 提供 。上述供试的植物病原真菌菌株长期保存在 4 ?,暗 , 150 r /m in,待菌丝生长到最佳收获期时 ,采 ?下 , 在 活 性 测 定 前 , 需 要 在 马 铃 薯 2葡 萄 糖 2琼 脂用过滤法收集菌丝 ,于 60 ?下烘干菌丝至恒重 。实 () () ( )( )PDA 平板上对供试真菌进行活化培养 25 ?,暗 验设阴性对 照 溶 剂 、空白 对 照 水 和阳 性对 照 ( μ) 10 g /mL 的多菌灵 ,每个处理重复 3次 。5 ,10 d, 然后继代培养 1 ,2 次 , 即 可用 于 活性 测 定 。 1. 4 结果观察与数据处理 对于带毒平板法 ,待空白对照菌落接近培养皿 1. 3 真菌生长抑制活性测定[ 4 ] 带毒平板检测法参照 Q u iroga 等 和本实验室 边缘时观察结果 ,采用十字交叉法测菌落直径 。用 [ 10 , 11 ] 已建立的方法 。将供试样品用合适的 溶剂 配 下述公式计算抑制率 : ( ) 菌落扩展 直 径 mm =测 量 菌 落 的 平 均 扩 展 直 径成系列浓度的母液 : 25. 6、12. 8、6. 4、3. 2、1. 6、0. 8 () ()(mm - 菌饼直径 mm m g /mL 针对不同的供试真菌 ,选择对真菌生长影响 (相对较小的溶剂 ,即番茄枯萎病菌用丙酮作溶剂 ;棉 相对抑制率 = 阴性对照菌落扩展直径 - 处理菌 ) 花枯萎病菌用 DM SO 作为溶剂 ; 水稻纹枯病菌用乙 落扩展直径 /阴性对照菌落扩展直径 ×100 % ) (醇作为溶剂 ,然后取一定量 即 : 0. 5 mL 化合物母 试验结果采用 M ic ro soft Exce l软件进行数据整 (μ( ) ) )( 理 ,在分析中 ,供试样品浓度 g /mL 取对数 x, 液于 50 mL PDA 培养基中 于 PDA 培养基 50 ,60 )( ) ?中 ,充分混合 ,此时化合物在培养液中的浓度分 抑制率换算成生物统计机率值 y, 求得抑制活性 μ别为 : 256、128、64、32、16 和 8 g /mL。将混合好的 回归方程 y = ax + b,从而可以求得半抑制浓度 IC。 50 (()培养基均匀倒入培养皿 直径为 90 mm 内 每皿 15 对于液体悬浮培养法 ,待菌丝生长到最佳收获 ) ()mL ,待培养基冷却凝固后 ,即成带毒培养基 。用消 期 即其生物量为其生长过程中最大值 时 ,采用过 () 滤法收集菌丝 ,于 60 ?下烘干至恒重 。抑制率的计 毒的接种针或镊子将制备好的菌饼 直径为 5 mm () 算如下 : 反面 有菌丝的一面向下和培养基贴合 移植到带 (毒培养基上 , 1 个培养皿中央接 1 个菌饼 。实验设 相对抑制率 = 阴 性 对照 菌丝 干重 - 处理 菌丝 干 () () ( ) 阴性对照 溶剂 、空白对照 水 和 阳 性对 照 100 重 /阴性对照菌丝干重 ×100 % μ) ( ) g /mL 的多菌灵 ,每个处理重复 3次 。 半抑制 浓 度 IC的 求 法 同 于 上 述 带 毒 平 板50 [ 5 ] 液体 悬 浮 培 养 法 参 照 W e idenbo rne r 等 和 本 法 。 [ 12 ] 实验室已建立的方法 。在活性测定之前需要确 2 结果与分析 定 3 种供试病原真菌在液体悬浮培养中的最佳收获 () 2. 1 带毒平板法测定抗菌化合物对真菌菌丝生长期 即菌丝干重达到最大值的天数 , 具体操作是 : () 挑取新鲜菌丝 直 径 为 5 mm 的菌 饼 于 无 菌马 铃 的抑制活性 ( ) ( 薯 2葡萄糖 2液 体培 养基 PDB 中 1 个 菌 饼 /30 mL采用带毒平板检测法测定血根碱和白屈菜红碱 ) () 培养基 /100 mL 容 积 的 三 角 瓶 , 同 时 含 有 相 应 的对 3 种植物病原真菌的抑制作用 1 ,血根碱和 Vo l121 刘 浩等 :两种测定化合物对真菌菌丝生长抑制活性方法的比较 579 ( )μ白屈菜红碱对供试真菌都表现 出了 一定 的 抑制 活 IC分别 为 37. 64 和 49. 61 g /mL。另外 , 血 根 50 性 ,对水稻纹枯病菌 的 抑制 作用 最强 , 半 抑 制浓 度碱对病原菌的抑制活性普遍强于白屈菜红碱 。 表 1 带毒平板法测定血根碱和白屈菜红碱对真菌菌丝生长的抑制活性 Tab le 1 Inh ib ito ry ac tivity of sangu ina rine and che le ryth rine on the m yce lia l grow th by rad ia l grow th a ssay IC 化合物 供试真菌 抑制活性回归方程 50( )Compound Fungu s R egre ss equa tion y = ax + b (μ) g /mL = 0. 7572 x + 3. 2542 , r = 0. 9954 202. 12 y 番茄枯萎病菌 F. o. l. 血根碱 Sangu ina rine 棉花枯萎病菌 F. o. v. y = 0. 7066 x + 3. 4996 , r = 0. 9929 132. 86 水稻纹枯病菌 R. solan i y = 0. 9185 x + 3. 5528 , r = 0. 9808 37. 64 番茄枯萎病菌 F. o. l. 棉y = 0. 8014 x + 3. 0073 , r = 0. 9779 306. 55 白屈菜红碱 Che le ryth rine 花枯萎病菌 F. o. v. y = 0. 6770 x + 3. 3987 , r = 0. 9953 251. 59 水稻纹枯病菌 R. solan i y = 0. 8523 x + 3. 5548 , r = 0. 9936 49. 61 μμ 注 :阳性对照为 100 g /mL 浓度的多菌灵 , 对所有供试真菌生长的抑制率为 100 % 。No te: Ca rbendazim a t concen tra tion of 100 g /mL wa su sed a s the po sitive con tro l wh ich grow th inh ib ito ry ra te wa s 100 % aga in st all tested fungi. 2. 2 液体培养法测定抗菌化合物对真菌菌丝生长菜红碱对它们都表现出了很好的抑制活性 ,其中对 的抑制活性水稻纹枯病菌的抑制作用最强 , IC值分别为 0. 47 ,50 μ0. 55 g /mL。采用液体培养法测定血根碱和白屈菜红碱对 3 () 种植物病原真菌的抑制作用 表 2 ,血根碱和白屈 表 2 液体培养法测定血根碱和白屈菜红碱对真菌菌丝生长的抑制活性 Tab le 2 Inh ib ito ry ac tivity of sangu ina rine and che le ryth rine on the m yce lia l grow th by liqu id su sp en sion cu ltu re a ssay IC 化合物 供试真菌 抑制活性回归方程 50( )Compound Fungu s R egre ss equa tion y = ax + b (μ) g /mL = 1. 3544 x + 4. 4591 , r = 0. 9755 2. 51 y 番茄枯萎病菌 F. o. l. 血根碱 Sangu ina rine 棉花枯萎病菌 F. o. v. y = 1. 0894 x + 4. 6906 , r = 0. 9959 1. 92 水稻纹枯病菌 R. solan i y = 1. 1925 x + 5. 3899 , r = 0. 9929 0. 47 番茄枯萎病菌 F. o. l. 棉 白屈菜红碱 Che le ryth rine 3. 29 y = 1. 4204 x + 4. 2649 , r = 0. 9698 花枯萎病菌 F. o. v. y = 1. 3462 x + 4. 5337 , r = 0. 9983 2. 22 水稻纹枯病菌 R. solan i y = 0. 9947 x + 5. 2617 , r = 0. 9785 0. 55 μμ 注 :阳性对照为 10 g /mL 浓度的多菌灵 ,对所有供试真菌生长的抑制率为 100 % 。No te: Carbendazim a t concen tration of 10 g /mL wa s u seda s the po sitive con tro l wh ich grow th inh ib ito ry rate was 100 % aga in st all te sted fungi. 长 ,菌丝的生长速度一般是以菌落扩展的直径来间 3 讨论 接衡量 。该方法的优点是操作比较简单 ,对抗菌化 ()通过实验结果 表 1 和表 2 可以看出 ,带毒平 () 合物的主要剂型 乳油 、水剂 、可湿性粉剂 都很适 板法和液体培养法测定化合物对病原真菌抑制作用 合 ,且重现性好 。带毒平板法对供试真菌要求较严的结果整体趋势是一致的 ,即 2 种生物碱对 3 种植 格 :如真菌易于培养 ,菌丝生长较迅速 、整齐 、生长呈 物病原真菌都有较强的抑制活性 ,其中对水稻纹枯 匍匐状 、产生孢子缓慢等 。本研究采用该方法所得 病菌菌丝生长的抑制作用最为强 ,其次是对棉花枯 出的 IC值要远远大于液体培养法 ,原因主要在于 50萎病菌 ,而对番茄枯萎病菌菌丝生长的抑制作用相 菌丝在固体培养基表面生长 ,相当一部分菌丝不能 对较弱 ;另外 ,还发现血根碱的活性普遍强于白屈菜 直接与培养基中的活性物质接触 ,同时活性物质在 红碱 。但采用带毒平板法和液体培养法测定化合物 [ 7 ] 固体培养基中的“移动 ”也比较困难 。另外 ,不同 ( )对病原真菌菌丝生长的半抑制浓度值 IC上存在 50 很大差别 ,即通过带毒平板法得到的半抑制浓度值 真菌菌落的厚度差别很大 ,因而以菌落扩展直径来 明显高于液体培养法 ,接近两个数量级 。 衡量真菌生长量方面也存在较大的差异 。 带毒平板法主要是测定菌丝在固体培养基上生液体悬浮培养法是将化合物与供试菌在液体培 养基中共培养 ,培养一段时间后 ,将菌液过滤 ,菌体 5 W e idenbo rne r M , H indo rf H , J ha HC, et a l. A n tifunga l ac tivi2 经冰冻干燥或直接在 40 ,60 ?下烘干致恒重 ,以菌 ty of isoflavono id s aga in st fungi of the genu s A sperg illus. Phy2 丝干重衡量 。该方法主要用于测定化合物对真菌菌 tochem istry , 1989 , 28: 331723319. 丝生长的直接影 响 。本 研究 采 用该 方法 所 得出 的 Mo sm ann T. R ap id co lo rim e tric a ssay fo r ce llu la r grow th and 6 IC值要远远低于带毒平板法 , 原因主要在于液体 50su rviva l: app lica tion to p ro life ra tion and cyto toxic ity a ssays. J 悬浮培养有利于各种物质的交流 ,也有利于活性成 Imm unol M ethods, 1983 , 65: 55 263. [ 7 , 13 , 14 ] 分与菌丝的接触 , 因此该方法较为灵敏 。另 H adacek F, Grege r H. Te sting of an tifunga l na tu ra l p roduc ts: 7 外 ,一些真菌用带毒培养基法无法测定 ,可以采用此 m e thodo logie s, comp a rab ility of re su lts and a ssay cho ice. [ 8 ] 法进行测定 。 Phy tochem A na lysis, 2000 , 11: 1372147. 当前 ,天然活性物质的研究已 从单 一 的“化 合 () 8 Zhou L G 周 立 刚 . A n tim ic rob ia l Compound s from P lan ts [ 15 ] () 植 物 抗 菌 化 合 物 . B e ijing: Ch ina A gricu ltu ra l Sc ience 物 ”模式转向“化合物 +生物活性 ”模式 ,我们需 and Techno logy P re ss, 2005. 63285. 要从众多的天然物质中快速筛选出能利用的活性成 1 13 9 M a rek R , Tou sek J , Do sta l J , et a l. H and C NMR study of () 分 ,为活性 成 分 包 括 杀 菌 剂 的 开 发 提 供 先 导 结 qua te rna ry benzo [ c ] p hena th rid ine a lka lo id s. M agn R eson 构 ,对其活性进行评价是重要的步骤 ,为了便于各实 Chem , 1999 , 37: 7812787. 验室或研究小组之间的比较 ,规范活性评价体系是 () () () 10 Tang J 唐 静 , Zhou L G 周 立 刚 , Cao XD 曹 晓 冬 , et [ 8 , 15 ] 非常重要的 。对于化合物对丝状真菌生长的抑 a l. Inh ib ition of p lan t extrac ts, sod ium ca rbona te and sod ium 制活性的测定方法 ,本论文比较了带毒平板法和液 b ica rbona te on the p a thogen of pop la r canke r B otryosphaeria 体悬浮培养法的测定结果 ,认为液体培养法检测化 () doth idea. A cta Phy topha thol S in 植物病理学报 , 2006, 36: 合物对真菌生长的抑制活性较为合理 ,该方法目前 4462453. [ 7 , 8 ] 已得到广泛的应用 。同 时 , 液体 培养 法 还应 该 () () () 11 Tang J 唐静 , Zhou L G 周立刚 , Zhou YM 周亚明 , et a l. Inh ib ito ry effec ts of Phe llodend ron ch inen se Schne id. ex2 向快速 、微量的方向发展 ,近年来在液体悬浮培养法 (trac ts on som e p hytop a thogen ic fungi. N a t P rod R es D ev 天 基础上发展起来的多孔板微量液体培养并结合细胞 ) 然产物研究与开发 , 2008 , 20: 505 2507.酶活性的分光光度法被认为是较为理想的化合物对 12 Tan M , Zhou L G, Q in M , et a l. Chem ica l compo sition and an2 () 供试微生物 真菌或细菌 生长的抑制活性测定方 tim ic rob ia l ac tivity of the flowe r o il of R ussow ia sogd iana [ 16 ] 法 ,本实验室在这方面已有相关的报道 。 () ( ) B ungeB. Fed tsch. A ste raceae from Ch ina. J Essen t O il R es, 2007, 19: 197 2200. 参考文献 13 Pau li A. A n ticand ida l low mo lecu la r compound s from h ighe r 2F lo re s M E, Tronco so2Ro ja s R , Tiznado2H e rnandez M E. B aez1 p lan ts w ith sp ec ia l refe rence to compound s from e ssen tia l B iochem ica l and gene tic re spon se s of fungi to the toxic effec t o ils. M ed R es R ev, 2006 , 26: 2232268. of syn the tic and na tu ra l fungic ide s. Am J A g ric B iol S ci, 14 Kue te V , M e tuno R , N gam en i B , et a l. 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