H I V检测及临床意义ppt课件

HIV检测及临床意义中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室尚红*——HIV的发现Montagnie(LAS)1983.Science220:868-871Gallo(HTLV)1983.Science220:865-86Levy(ARV)1984.Science225:840-8421986国际病毒分类委员会：HIVHIV-21986西非中国每年新发现的HIV/AIDS病例数（1985~2002）*HIV感染可通过两种途径检测直接检测病毒或其组成部分检测人体HIV免疫反应——HIV特异性抗体从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-3个月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应*HIV感染后抗原和抗体的变化及其与疾病关系HIV感染人体后出现一过性病毒血症，6-8周后血清抗体阳转，病毒滴度降低，在随后的5-8年无症状带毒期里HIV抗体一直存在，但病毒难查到。进入AIDS期后血浆中病毒再次出现。故诊断HIV感染多数时间用抗体检测诊断，极早期（窗口期）用抗原检测。*HIV抗体诊断 目前临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认实验。*一、检测试剂 筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。 目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。 自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在的场所用快速试剂进行血液筛查。*2、确认试剂必须经国家药品监督管理局注册批准。确认试剂包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验试剂。目前以免疫印迹试剂最为常用。*ELISA方法： 目前最常用的初筛实验，自1985年首次检测HIV-1抗体的试剂盒供市以来，已从第一代的全病毒抗原间接法发展到第四代的以重组的多肽抗原及抗P24抗体包被的双夹心法，使窗口期缩短了2-3周。*四代艾滋病酶联免疫试剂比较第四代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体Closingthewindow第一代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG、IgM抗体,第四代试剂同时检测IgG、IgM抗体和P24抗原使窗口期缩短。*检测结果的和处理阴性反应出具HIV抗体阴性报告，如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，可以进行HIV-1P24抗原或HIV核酸检测，或2－3个月以后再做抗体检测。筛查实验呈阳性发现反应，可出具“HIV抗体待复查”的报告，不能出阳性报告。HIV抗体初筛检测流程图快速诊断试剂：采用乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析三种原理快速、不需特殊仪器敏感度、特异度低于ELISA，且价格贵适用于血站覆盖不到的边远地区/城市大医院急诊手术前检查快速诊断阳性结果还需经ELISA方法验证HIV抗体确认 常用的确认实验方法是免疫印迹法（WB）。免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测蛋白印迹实验（WB） ——广泛使用的确认实验用聚丙烯酰胺凝胶电泳将纯化的HIV蛋白抗原分开后转移到硝酸纤维膜上。标本中存在的HIV抗体与条带上的抗原结合，再加入酶偶联的抗人IgG抗体和底物，在抗原抗体结合的部位会出现有色条带其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做确认试剂。不同的研究机构有不同的判定WB结果判定标准“不确定”(±)：出现HIV-1特异性条带，但带型不足以 确认阳性，每三个月随访一次，共两次， 仍属可疑，判为阴性 组织 阳性 阴性 WHO 2ENV+GAG+POL 无条带或只有P17 FDA（USA） 1ENV+p24/p31 无条带 CHINA ２ENV或１ENV+p24 无HIV-1特异性条带 HIV-1抗体特异带 HIV-2抗体特异带 env gp160/gp120gp41 gp140/gp105、gp36，也可为gp125/gp80、gp36 gag p55、p24、p17（或p18） p56、p26、p16 pol p66（或p65）、p51、p31 p68、p53、p34               HIV抗体确认检测流程图免疫印迹法(HIV1/2混合型)HIV-1阳性反应可疑反应出现HIV-2指带HIV-1阳性报告可疑反应阳性反应阴性反应报告HIV-2血清学阳性反应报告必要时测核酸阴性报告免疫印迹法（HIV-2）每3个月随访一次，共2次，仍属可疑，则作阴性报告如随访期间出现阳性反应则报告阳性阴性反应阴性报告                 P24抗原测定 （一）适用范围 HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。 第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的诊断。 监测病程进展和抗病毒治疗效果。**可编辑（三）结果报告和解释1、HIV-1P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。2、HIV-1P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能依此确诊。3、HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。HIV核酸检测1、辅助诊断 某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。 单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否，但当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（>1000）提示感染发生的可能性非常大。 使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析与判断。2、窗口期辅助诊断 在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒RNA测定具有特殊的意义。 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的RNA检测以降低窗口期传播的残余危险度。3、病程监控 由于HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与HIV感染有关。4、指导治疗及疗效测定 并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如>35000-50000拷贝/毫升）才具有良好的效果。 只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低50%才被认为临床有效。通过监测病毒滴度反映疗效5、预测疾病进程 HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量与6年发病率的关系为：<500时5.4%，501-3000时16.6%，3001-10000时31.7%，10001-30000时55.2%，>30000时则为80%。定性检测 HIV核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于HIV感染的辅助诊断。通常使用PCR或RT-PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见的毒株，也可使用复合引物。定量检测 定量检测常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的HIVRNA定量测定方法有逆转录PCR实验（RT-PCR）、核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为20-50拷贝/毫升 按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方法、样品种类和样品量。 测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。 应附上仪器打印的数据。各种HIV定量检测方法的比较   Roche Bayer(前Chiron) Organon 技术 RT-PCR bDNA NuclisensHIV-1QT 结果比较 约2xbDNA2.0 2.0版结果约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同 与Roche基本相同 优点 通过了FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性 操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性 通过了FDA认证可使用多种组织，如生殖道分泌液对A-G亚型有较好的反应性检测范围大 缺点 操作容易污染测定范围较小（相对于NASBA）少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进对O亚型检测能力较差 对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。 早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。实验内、外误差相对较大。 检测范围 标准版(Amplicor1.0及1.5)400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):50-75,000c/mL bDNA3.0版:100-500,000c/mL NuclisensHIV-1QT:40-10,000,000c/mL(取决于样品量)关于不同HIV定量检测方法的选择 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世 不同定量方法结果之间还无法直接比较 同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测艾滋病免疫指标的检测随着政府加速对国产抗艾滋病药物上市的批准，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙光。艾滋病临床治疗中各种免疫指标(CD4+、CD8+T细胞等)对于确定感染状态、预测发病、评价药物疗效及新药开发具有重要的作用。CD4T淋巴细胞：（流式细胞术） CD4T细胞是HIV的主要靶细胞,感染后随着病程进展，CD4T细胞不断下降 <500/mm3——有临床诊断意义 <200/mm3——AIDS[CDC] 病程进展，AIDS诊断和疗效观察的指标HIV感染几周内，出现类流感症状，也称为血清阳转期，CD4细胞的数量降低。随之出现的免疫应答可以控制急性症状，恢复CD4细胞的数量，但并不能清除病毒。随着CD4细胞不断下降，当降至500/ul左右时，开始出现机会性感染或其它疾病，进入症状期。当CD4低于200/ul时，即进入艾滋病期。CD4+T淋巴细胞小于350/ul（结合病毒载量，确定治疗时机）有效HIV感染病毒变异和耐药性的测定 随着HAART治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株正在不断出现，甚至对一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药。 因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的测试方法，包括基因型HIV耐药测试和表型HIV耐药测试。表型HIV耐药性测试方法 能直接测出HIV-1对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-1感染者有效地用药。 目前市面上供应试剂盒已有2种，即AV（VicroAntivirogram）和PS（VirologicPhenoSense），两者方法均应用从生长于载体中的HIV-1而获得的重组病毒和病人标本中蛋白酶与逆转录酶序列，分析与野病毒之间IC50值相差倍数，一般达5—10倍以上为阳性。 这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。基因型HIV耐药性测试方法 当病毒对某些药物产生耐药性时，病毒基因会发生一些明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药物的治疗效果。 检查从病人血液标本中分离到的HIV基因物质，应用核酸序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况， 优点简单快速，费用低。 缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐药的程度。*********