荧光定量PCR中探针法与染料法的区别

荧光定量pcr中探针法与染料法的区别: 一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述: 1.荧光定量PCR探针法:探针法即除了引物外另外设置一个探针,在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团,这个时候,两个平衡不发光,但是当DNA 通过引物合成的时候,探针被折断,释放出发光集团和淬灭集团,两个距离较远,发光集团产生荧光,被机器收集到信号,从而检测基因的量 2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法:染料能够与双链结合,当PCR扩增的时候,染料结合到DNA上,从而发光,单个的染料不发光,这样就能收集到信号,我们可以看出,染料法特异性不强,只要是双链的DNA都回结合发光。 二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点 1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,能够用多重体系反应的方法,能够预测和提前进行反应条件的优化,缺点是要合成探针,成本高 2、染料法经济实惠,可以做溶解曲线,全部PCR产物的TM值,缺点就是特异性没有探针法好 【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择 如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统,多色多通道检测是当 今的主流趋势——仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。定量pcr仪需要考虑的另外一个因素是软件,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用,市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新,生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪,各有各精彩。 1. 传统的96孔板式定量PCR仪传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材,可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应,但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应,因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致,样本和样本之间的温度控制也可能存在差异,对于灵敏度极高的定量PCR来说,任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大,不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大,温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢,因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR 仪的荧光检测分析系统,由于96孔板上样品孔的位置是固定的,每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同,有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行,试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源,5色滤光镜,可同时激发96个样品,超低温CCD具备同时多点多色检测的能力,能够有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和 Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量,可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量pcr引物和探针设计软件Primer Express非常有用,“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针(生物通摘自ABI技术资料)”。各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA 或RNA拷贝数。可以动态显示PCR扩增曲线的生成,定量的线性范围大于9个数量级,区分5000和10000个拷贝的DNA可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。当然,也可以作为普通PCR仪使用。ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒,覆盖人类全部4万个基因,二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP 检测试剂盒,为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI 的定量PCR仪均支持两种定量化学:TaqMan荧光探针和SYBR Green I荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异,有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜,新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高,带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块,使得高通量处理数据的能力大大增强,应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造,采用LED光源PMT光电倍增管荧检测器。96个单色LED光源对应96孔板,但是单色LED激发波长范围较窄。Option 是单道单个光电倍增管荧光检测器,升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器,PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品,所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT可同时进行双色检测(FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。优势之一是带梯度功能。Bio-Rad(伯乐)也算是个熟悉的品牌, iCycler iQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的,荧光检测波长范围400-700nm,可4波长同时检测,仪器的设计灵活,定性和定量部分可独立工作,同样可完成梯度PCR。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ被Bio-Rad收购后, Option和iCycler iQ目前还是各自走各自的销售渠道,至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。 小中大2.创新概念的离心式实时定量pcr仪为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点,聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪,以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。PCR扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样,借助空气加热和转子在腔内旋转,转子上每个孔都是“等位”的,几乎无差别,很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃,最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触,接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小,但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪,可以达到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒),优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上,升温后离心到管底与反应体系混合,实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快,对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应,Roche的LightCycler仅需20—30 分钟即可完成,可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用,因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了,或者换句话来说,2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。由于转子上的样品孔是旋转可移动的,因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器,随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的,使用的是同一个检测器和激发光源,有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长;离心式定量PCR都是逐个检测样品的,所以大多采用了长寿的LED(发光二极管)冷光源,运行前无须预热,无须校正;系统检测重复性也更好。离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小,能容纳的样本量有限,由于是离心式转子,常规的96孔板和条形管就不适用,有的还需要特殊的消耗品,增加使用成本。当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。Roche 的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮!现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点-----快速:利用空气动力学原理,20-30分钟内完成30-40个循环。控温准确:变温速率最高可达20℃/秒,温差≤±0.3°C多波长检测:可同时在530、640及710nm三个通道进行检测,实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。此外动态检测范围达10个数量级,而无须将样品稀释;具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增,具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBR Green I检测、序列特异杂交探针等;探针及引物设计方便,杂交探针及引物设计的限制少,而且亦可方便地选用合适大小的扩增子(100-1000bp)。但是Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管,这在某种程度上提高了消耗成本,也不方便作为常规PCR仪使用。Corbett的Rotor-Gene 也是离心式的定量pcr仪。在品牌的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在国内那样家喻户晓,之所以特别提到这个产品,确实是因为Corbett的设计有独到之处。比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道), 4个独立LED激发光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保证最少的光谱交叉(0.99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转,使得样品间的温度均一性极佳(±0.01℃/秒),同一热反应室提供完全相同的反应条件,同一光学通路提供完全相同的测量通道,每标本每循环检测32次,满足高精度和一致性要求。Rotot- Gene3000提供了36 x0.2ml和72x0.1ml两种转子,检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的,因而可以使用普通的0.2ml PCR管,并允许在试管盖上标记,这降低了使用成本。Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler,但优于多数的固定加热模块的机型,能达到5℃/秒(管内实际升温速度达到 2.5℃/秒)。Corbett还有一个光学变性专利——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序,检测荧光染料信号大小的变化,找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度,在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度,也不需要延长孵育时间。这个专利使得反应过程大大缩短。Rotot-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少,只能靠反应速度快,同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。对于大量样品的实验室,Corbett同时还提供定量PCR反应自动加样系统,不单可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性,也可以配套Roche和ABI 的定量PCR仪。这样就不用担心加样累坏了。