透析相关流程

透析相关用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（视使用的透析袋孔径而定，常用0.45um）聚合物如聚乙二醇（6000－12000碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩的：1、减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。4、吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。5、超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo超滤膜的分子量截留值：膜名称分子量截留值孔的大的平均直径XM－300300，000140XM－200100，00055XM－5050，00030PM－3030，00022UM－2020，00018PM－1010，00015UM－21，00012UM0550010用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。二、干燥 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的缓冲液中。3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。一、主要内容（一）了解蛋白质的沉淀作用。1.原理：向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。2.操作：(1)取10%鸡蛋白溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出。如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液；(2)取少许沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解，另取剩余的混合物，加入过量的硫酸铵粉末，使其成为硫酸铵的饱和液，观察沉淀产生。(二)蛋白质的透析1.原理：蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐常用的方法为透析法蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其他低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，透析袋可用玻璃纸、火棉胶、动物膜、羊皮纸等制成，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。2.操作：(1)透析器的制备：取5%火棉胶溶液5ml，放入洁净而干燥的小三角瓶中，徐徐转动，使其干化，用指甲或小刀刮开瓶口的薄膜，轻轻拉开，再用自来水将薄膜与瓶塞渐渐冲开即可作为本实验所用的透析袋，将其保存在水中，用时取出；(2)注入含鸡蛋清氯化钠蛋白溶液5ml于上述自制透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其上开口端位于水面之上。经过20分钟后，自烧杯中取出水样1ml于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中已有Cl–存在，再自烧杯中取出水1ml于另一试管中进行双缩脲反应，加入10%氢氧化钠溶液2ml，摇匀，再加入1%硫酸铜溶液两滴，随加随摇。观察是否有紫玫瑰色出现。什么？(3)每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时则可观察到火棉胶袋内出现轻微混浊，此即为蛋白沉淀。