良好的实验动物给药和采血(包括途径和体积)规范指南

AGoodPracticeGuidetotheAdministrationofSubstancesandRemovalofBlood,IncludingRoutesandVolumes良好的实验动物给药和采血(包括途径和体积)Karl-HeinzDiehl1,RobinHull2,DavidMorton3,RudolfPfister4,YvonRabemampianina5,DavidSmith6,*,Jean-MarcVidal7andCorvandeVorstenbosch81Aventis,POBox1140,D35001Marburg,Germany德国马尔堡市35001区1140信箱安万特公司2NIBSC,BlanchLane,SouthMiimms,PottersBar,HertfordshireEN63QG英国赫特福德郡EN63QG波特斯巴镇SouthMiimms布兰奇道英国国家生物制品检定所3TheUniversityofBirmingham,MedicalSchool,Edgbaston,BirminghamB152TT英国伯明翰市B152TT艾吉马斯顿伯明翰大学医学院4NovartisPharmaAG,CH-4002Basel,Switzerland瑞士巴塞尔CH-4002诺华制药公司5CentredeRecherchePfizer,Etablissementd’Amboise,Z1Poce´-sur-Cisse-BP15937401AmboiseCedex,France法国AmboiseCedexZ1Poce´-sur-Cisse-BP15937401Etablissementd’Amboise辉瑞研究中心6AstraZenecaR&DCharnwood,BakewellRoad,Loughborough,LeicsLE115RH英国莱斯特郡LE115RH拉夫堡市贝克韦尔路Charnwood阿斯利康研究中心7Aventis,102RoutedeNoisy,95235RomainvilleCe´dex,France法国RomainvilleCe´dex95235Noisy路102号安万特公司8NVOrganon,POBox20,5340BHOss,Netherlands荷兰BHOss534020号信箱欧加农公司Keywords:bloodvolumes;bloodremoval;administrationsubstances;laboratoryanimals;refinement.关键词：血容量；采血；给药；实验动物；简化ThisarticleistheresultofaninitiativebetweentheEuropeanFederationofPharmaceuticalIndustriesAssociations(EFPIA)andtheEuropeanCentrefortheValidationofAlternativeMethods(ECVAM).Itsobjectivesaretoprovidetheresearcherinthesafetyevaluationlaboratorywithanup-to-date,easyto-usesetofdatasheetstoaidinthestudydesignprocesswhilstatthesametimeaffordingmaximumwelfareconsiderationstotheexperimentalanimals.该文章为欧盟制药工业协会(EFPIA)和欧洲替代动物实验方法验证中心(ECVAM)之间的初步结果。其目的在于为安全性评价实验室的研究者提供最新的易于使用的数据库以帮助研究过程，同时最大可能地考虑到实验动物的福利。AlthoughthisarticleistargetedatresearchersintheEuropeanPharmaceuticalIndustry,itisconsideredthattheprinciplesunderpinningthedatasetsandrefinementproposalsareequallyapplicabletoallthosewhousethesetechniquesonanimalsintheirresearch,whetherinresearchinstitutes,universitiesorothersectorsofindustry.Theimplicationsofthisarticlemayleadtodiscussionwithregulators,suchasthoseresponsibleforpharmacopoeialtesting.尽管该文章针对的是欧洲制药工业界的研究者，但支撑该数据库的基本原理及改进建议同样适用于所有在他们的研究中使用这些动物实验技术的人，不论是研究所、大学或其它行业中的研究者。Therearenumerouspublicationsdealingwiththeadministrationoftestsubstancesandtheremovalofbloodsamples,andmanylaboratoriesalsohavetheirown‘in-house’guidelinesthathavebeendevelopedbycustomandpracticeovermanyyears.WithinEuropeanUnionDirective86/609EEC1wehaveanobligationtorefineexperimentstocausetheminimumamountofstress.Wehopethatthisarticlewillprovidebackgrounddatausefultothoseresponsibleforprotocoldesignandreview.有关供试品给予和采血的出版物众多，且许多实验室在多年的经验和实践基础之上亦发展了它们自己的内部指南。在欧盟化妆品标准86/609EEC中，我们有义务简化实验以最小化动物的紧张程度。我们希望该文能够对那些负责方案设计和审核的研究者提供有用的背景数据。Thisguideisbasedonpeer-reviewedpublicationswheneverpossible,butwherethisisnotpossiblewehaveused‘in-house’dataandtheexperienceofthoseontheworkingparty(aswellashelpfulcommentssubmittedbytheindustry)forafinalopinion.Theguidealsoaddressesthecontinuingneedtorefinethetechniquesassociatedwiththeadministrationofsubstancesandthewithdrawalofblood,andsuggestswaysofdoingso.Data-sharingbetweenlaboratoriesshouldbeencouragedtoavoidduplicationofanimalwork,aswellassharingpracticalskillsconcerninganimalwelfareandscientificproblemscausedby‘overdosing’insomewayoranother.Therecommendationsinthisguiderefertothe‘normal’animal,andspecialconsiderationisneeded,forinstance,duringpregnancyandlactation.Interpretationofstudiesmaybeconfoundedwhenlargevolumesareadministeredorexcessivesamplingemployed,particularlyifanaestheticsareused.Copyrightã2001JohnWiley&Sons,Ltd.该文章基于历年所有可能收集到的同行评议出版物，但我们未能够收集到的内部数据和那些工作组的经验(以及行业提交的有用的注释)除外。该指南亦强调了持续性简化与给药和采血有关的技术的必要性，并且建议该如何去进行这方面的工作。应该鼓励实验室间的数据共享以避免重复性动物研究，以及共享在某些方法或其它情况下的“药物过量”所引起的与动物福利有关的实际技术和科学问题。有必要对该指南中涉及到的“正常动物”要求进行特殊考虑，如妊娠和哺乳期间的动物。当给药体积较大或过度采样时对研究结果的诠释可能会令人感到困惑，特别是使用麻醉动物时。GOODPRACTICEGUIDEFORADMINISTRATIONOFSUBSTANCES良好的给药规范指南Introduction引言Dosingofexperimentalanimalsisnecessaryforavarietyofscientificinvestigationsandtomeetregulatorydemands.Thepharmaceuticalindustry,inparticular,hasinvestigatedthelevelsofdosingcompatiblewithanimalwelfareandvalidscience.2Inthepreclinicalstageofthesafetyevaluationofnewdrugsitisnormalpracticetousemultiplesofthe‘effectivedose’inordertoattempttoestablishthenecessarysafetymargins.Wherechemicalsareoflowtoxicityorareonlypoorlysolubleinacceptableformulations,alargevolumemayberequiredtobegiventoindividualanimalstosatisfybothscientificandregulatoryrequirements.Theintendedclinicalusemayalsohaveanimpactontheacceptabilityoflargerthanusualdosevolumes,e.g.imagingagentsorplasmaexpandersforintravenousapplication.各种科学研究都需要对实验动物给药以符合药品注册要求。特别是在制药工业领域已研究了与动物福利以及科学性相一致的给药水平。在新药的临床前安全性评价阶段使用多种“有效剂量”以尽量确定必要的安全性范围是一种常规惯例。在使用低毒或溶解性极差的化学药品以一种可接受的制剂形式进行研究时，动物的个体给药体积可能较大以满足科学性和注册的要求。拟用临床剂量可能会使得给药体积较大，超过了动物可接受的正常给药体积，如静脉内注射用的造影剂或血浆增容药物。TheobjectivesoftheTechnicalSubgroupofEFPIA/ECVAMwereasfollows:(i)toprovideaguideonadministrationvolumesforuseincommonlaboratoryspeciesusedintoxicitystudiesrequiredbyregulatoryauthorities;(ii)toprovideconsensusdosagelevelsforroutineusethatrepresentgoodpracticeintermsofanimalwelfareandpracticality;(iii)toproduceaguidetodosagelevelsrepresentingtheupperlimitofcommonpractice,whichleavesscopetomakethecaseforspecialinvestigations.EFPIA/ECVAM技术小组的目标如下：(i)提供一个药品注册当局所要求的毒性研究中常规使用的实验动物的给药体积的指南；(ii)根据动物福利和实用性提供一个在良好规范条件下常规使用的一致性剂量水平；(iii)提供一个代表常规规范上限的剂量水平，以为特殊研究留下一定的剂量扩展余地。Administrationvolumes给药体积Table1presentsadministrationvolumesforthecommonlyemployedroutesinthemostfrequentlyusedspecies.Theyareconsensusfiguresbasedonpublishedliteratureandinternalguidelines.ThemarmosetandminipigarenowconsideredwithinthiscategorybecausetheyarebeingusedincreasinglyinEurope.表1表示最常使用的种属的一般给药途径下的给药体积。它们是根据发表的文献和内部指南综合得到的结果。现在认为绒猴和小型猪在此类常用动物之列，因为它们在欧洲的使用日渐增加。Twosetsofvaluesareshownineachcolumn:valuesontheleftareintendedasaguideto‘goodpractice’dosevolumesforsingleormultipledosing;valuesontheright,wheregiven,arethepossiblemaximalvalues.Ifmaximalvaluesareexceeded,animalwelfareorscientificimplicationsmayresultandreferencetotheresponsibleveterinarysurgeonshouldbemade.Insomeinstancesvaluesaretheretoaccommodatepharmacopoeialrequirements.每一列显示了两组数据，左侧数据拟用来指导在单次或多次给药的“良好规范”中的给药体积；所给出的右侧数据为可能的最大给药值。如果超过了最大值就会涉及到动物福利或科学性，应当参考负责兽医的外科医生的意见。在某些实际运用中，这些数据应符合药典要求。Someofthesesuggestedmaximumvalueshavebeenobtainedfromrecentliterature,3,4butappearhighwhencomparedwith‘goodpractice’values.Theneedforcarefulattentiontoanimalwelfareandtheformulationofmaterialusedathighdosevolumesareemphasized,particularlyifrepeatdosingisintended.Studydurationcouldberestrictedandscientificvaliditycompromisedbyphysiologicalreactiontohighdosevolumes.Itisthereforeessentialfromanethicalstandpointthattheseissuesarefullyconsidered,e.g.byinspectorateorethicalcommittee,beforeprotocolsarefinalizedandworkcommences.Itisalsostronglyrecommendedforethicalaswellasscientificreasonsthatphysicochemicalcompatibilitystudies(invitro)andsmallscalepilotstudies(smallgroupsofanimals)arecarriedoutonanynewformulationbeforecommittingtolargerscalestudies.Dosevolumesshouldbetheminimumcompatiblewithcompoundformulationandaccuracyofadministration.从近来发表的文献中已经得到了这些建议的最大值中的某些数据，但当与“良好规范”数据相比时显得较高。强调了较高给药体积时对动物福利和使用的原料制剂进行仔细关注的必要性，特别是拟进行重复给药时。研究的持续时间和科学有效性应该让步于由于给药体积过高所出现的生理反应。因此在方案定稿以及着手研究之前通过比如监察员或伦理委员会充分地考虑到了这些出版物中的伦理观要素。亦就伦理及科学依据强烈要求对任何新剂型进行物理化学相容性研究(体外)和小型的先导性研究(少量动物组)以免在大型研究中出现失误。给药体积应该最大限度地与化合物剂型和给药准确性相一致。Administrativeroutes给药途径Oralroute.Onoccasions,itmaybenecessarytorestricttheanimals’foodintakebeforedosing.Thisfactormayaffectabsorption.Largedosevolumes(40mlkg1)havebeenshowntooverloadthestomachcapacityandpassimmediatelyintothesmallbowel.5Largervolumesmayalsorefluxintotheoesophagus.Thedurationoffastingwilldependuponthefeedingpatternofthespecies,thestartingtimeforfoodrestriction,thephysiologyofthespecies,thelengthoftimeofdosing,dietandthelightcycle.6Itisrecommendedthatforaccuracyofdosingandtoavoiddosingaccidentsliquidsareadministeredbygavage.经口给药途径：某些情况下在给药前有必要限制动物的摄食。该因素可能会影响药物吸收。较大的给药体积(40ml/kg)表明超过了胃容量负荷并快速通过胃进入小肠。较大的给药体积亦可以造成食管返流。禁食时间取决于动物种属的饲养方式、禁食的起始时间、种属的生理学特征、给药时间的长短、食物和光照周期。当药液通过灌胃给予时，要求给药必须准确以避免给药意外。Parenteralroutes.Forsubstancesadministeredparenterally,thedosevolumeused,stabilityoftheformulationbeforeandafteradministration,pH,viscosity,osmolality,bufferingcapacity,sterilityandbiocompatibilityoftheformulationarefactorstoconsider.Thisisparticularlyimportantformultipledosestudies.ThesefactorsarereviewedinsomedetailbyClaassen.7Thesmallestneedlesizeshouldbeused,takingintoaccountthedosevolume,viscosityofinjectionmaterial,speedofinjectionandspecies.胃肠外给药途径：对于经胃肠外给予的药物而言，应考虑所采用的制剂的给药体积、给药前和给药后制剂的稳定性、pH、粘度、等渗性、缓冲能力、无菌及生物相容性因素。这对于多次给药研究尤其重要。Claassen总结了这些因素中的某些细节。应使用最小型号的针头、考虑给药体积、注射物粘度、注射速度和动物种属。Subcutaneous.Thisrouteisfrequentlyused.Therateandextentofabsorptiondependontheformulation.皮下给药：该途径经常使用。吸收的速度和程度取决于制剂。Intraperitoneal.Thisrouteisusedinfrequentlyformultipledosestudiesbecauseofpossiblecomplications.Thereisapossibilityofinjectingintotheintestinaltractandirritantmaterialsmaycauseperitonitis.Drugabsorptionfromtheperitonealcavityaftertheadministrationofthecompoundasasuspensionisdependentonthepropertiesofthedrugparticlesandthevehicle,andthedrugmaybeabsorbedintobothsystemicandportalcirculations.腹腔内给药：多次给药研究时较少用到该途径，因为可能会出现并发症。该途径存在着注射入肠道的可能，而且刺激性物质可能引起腹膜炎。化合物以混悬液形式给予后在腹腔的吸收取决于药物粒子及赋型剂的特征，药物可能被吸收进行全身或局部循环。Intramuscular.Intramuscularinjectionsmaybepainfulbecausemusclefibresarenecessarilyplacedundertensionbytheinjectedmaterial.Sitesneedtobechosentominimizethepossibilityofnervedamage.Sitesshouldberotatedformultipledosestudies.Adistinctionneedstobemadebetweenaqueousandoilyformulationswhenspeedofabsorptionisimportant(oilyformulationsarelikelytoremainasadepotfor.＞24h).Withmultipledosestudiesthereisaneedtoconsidertheoccurrenceofinflammationanditssequelae.肌肉内注射：肌肉内注射可能会引起疼痛，因为注射时必须使肌纤维处于紧张状态。必须对注射部位进行选择以尽量减少神经损伤的可能性。多次给药研究不应在同一个部位反复注射。当吸收速度很重要时，必须在水性和油性制剂之间加以选择(油性制剂在注射部位的残留很可能超过24小时。)。进行多剂量研究时，有必要考虑到出现炎症及其后遗症。Intravenousadministration.Forthisroute,distinctionsaremadebetweenbolusinjection,slowintravenousinjectionandintravenousinfusion.ThevaluesinTable1relatetobolusinjectionandslowintravenousinjection.静脉内给药：对于该途径，必须区分团注、缓慢静脉内注射和静脉内输液。表1中的数据与团注和缓慢静脉内注射有关。(i)Bolusinjection.Inmoststudiesusingtheintravenousroutethetestsubstanceisgivenoverashortperiodofapproximately1min.Suchrelativelyrapidinjectionsrequirethetestsubstancetobecompatiblewithbloodandnottooviscous.Whenlargevolumesarerequiredtobegiven,theinjectionmaterialshouldbewarmedtobodytemperature.Therateofinjectionisanimportantfactorinintravenousadministrationanditissuggestedthat,forrodents,therateshouldnotexceed3mlmin-1.Nodetectablechangesinhaematocritorheartratewereobservedindogsfollowingrapidintravenousinjectionof6mlkg-1saline,but20mlkg-1wasassociatedwith15%haemodilutionandatransienttachycardia(up46%over1min).8(i)团注：在大多数采用静脉内给药途径的研究中，受试物在大约1min内快速给予。如此相对迅速的注射要求受试物与血液之间具有相容性且粘度不能太高。当需要给予较大的体积时，注射原料必须加热至与体温相同。在静脉内给药中注射速度是一个重要因素，建议对于啮齿类动物而言，注射速度不应超过3ml/min。犬经静脉内快速注射6ml/kg生理盐溶液后未发现红细胞压积或心率变化，但快速注射20ml/kg后血液被稀释了15%且出现一过性心动过速(一分钟内心率增加达46%)。(ii)Slowintravenousinjection.Becauseoftheexpectedclinicalapplicationofthecompound,orbecauseoflimitingfactorssuchassolubilityorirritancy,itmaybenecessarytoconsideradministeringsubstancesbyslowintravenousinjection.Typically,differenttechniqueswouldbeappliedforslowinjectiontominimizethepossibilityofextravascularinjectionofmaterial.Forslowintravenousinjectionoverthecourseof5–10minastandardorbutterflyneedlemightbeused,orbetterstillanintravenouscannulamaybetapedinplaceinasuperficialvein(shortterm),orsurgicallyplacedsometimepriortouse(longertermormultipleinjections).(ii)缓慢静脉内注射：因为化合物预期的临床适应症或限制性因素如溶解性或刺激性，因此可能有必要考虑通过缓慢静脉内注射给药。特别需加以说明的是缓慢静脉内注射会应用不同的技巧以尽可能地避免原料被注射入血管外组织。对于注射过程为5–10min的缓慢静脉内注射而言，可能需要采用标准的或蝶形针，或浅静脉内注射(适用于短期静脉内注射)时使用静脉内套管并用胶带固定更佳，或在使用前通过外科手术放置注射针(适用于更长时间的注射或多次注射)。Ithasbeenshownthatratsmaybegivendailyintravenousinjectionsofisotonicsalineatdosagesupto80mlkg-1at1mlmin1for4dayswithoutsignificantsignsofdistressorpulmonarylesions.9However,pulmonarylesionsincreasedinincidenceandseveritywhenthedurationoftreatmentincreasedto30daysandtheinjectionwasadministeredateither0.25,0.5or1.0mlmin-1.10Theremaywellhavebeenadverseeffectsatanearliertimepointbutthepathologyhadnothadtimetodevelop.已有证据表明大鼠每日可以1ml/min的速度静脉内注射等渗盐溶液剂量达80ml/kg，共4天，没有明显不适症状或肺部损伤。但是，当注射时间增加至30天时，给药速度为0.25、0.5或1.0ml/min的大鼠肺部损伤的发生率和严重程度均增加。在用药早期可能出现不良反应，但是在这么短的时间内不会有病理变化出现。(iii)Continuousinfusion.Forsimilarreasonsofsolubilityorclinicalindicationitmaybenecessarytoconsidercontinuousinfusion,butcarefulconsiderationisneededifinfusionsareprolonged.Thevolumeandrateofadministrationwilldependonthesubstancebeinggivenandtakeaccountoffluidtherapypractice.Asaguide,thevolumeadministeredonasingleoccasionwillbe,10%ofthecirculatingbloodvolumeover2h.InformationoncirculatingbloodvolumesisavailableinTable3.Minimaleffectiverestraintofanimalswithleaststressisakeyfactortoconsiderforprolongedinfusions.(iii)连续输液：出于溶解性或临床适应症这一类似原因，有必要考虑连续输液，如果长时间输液则必须进行周详的考虑。给药体积和速度取决于所给物质并应考虑液体治疗规范。作为一个指南，单次给药情况下的给药体积占循环血容积的10%时，给药时间应不低于2小时。有关循环血容积的信息见表3。长时间输液应考虑如何尽量减少动物的不适，这是一个关键因素。Thetotaldurationofaninfusionisalsoafactor.Table2presentsrecommendeddoseratesandvolumesfordiscontinuous(4hperday)andcontinuous(24h)infusion.(Furtherdataarerequiredtocompletethistable.)输液的总持续时间亦是一个应该考虑的因素。表2给出了推荐的间断性(4小时/天)和持续性(24小时)输液的给药速度和体积(需要进一步的数据来完善此表)。Volumesandratesfortherabbitarebasedondataderivedfromembryotoxicitystudies,whichshowednoeffectsonthefoetusbutperivasculargranularleucocytecuffingandproliferativeendocarditisindamsreceiving>2mlkg-1h-1.11Infusionratesinratsaretypicallyintherange1–4mlkg-1h-1,12–14butideallyshouldnotexceed2mlkg-1h-1inembryotoxicitystudies.Valuesforthemouse,15dogandmacaque16andminipig(unpublisheddata)arebasedonrepeateddosestudiesof1monthinduration.家兔的给药体积和速度基于来源于胚胎毒性研究的数据，该研究表明对胎儿没有影响，但当给药剂量>2ml/kg/h时，母体出现血管周粒细胞成袖口状聚集以及增殖性心内膜炎。大鼠的典型输液速度在1–4ml/kg/h，但在胚胎毒性研究中的理想速度应不超过2ml/kg/h。对于小鼠、犬和恒河猴以及小型猪(未公开数据)的数据基于为期1个月的重复给药研究。Otherlimits,indicatingtheimportanceofthevehicleformulationathighdosevolumes,arehighlightedinfourpublications.17–20Thesedataindicatethattherearelargedifferencesintoleratedvolumebyi.v.infusion,dependentuponthevehicleused.Thelong-termeffectsonotherphysiologicalsystemshavenotbeeninvestigated.在四篇出版物中突出了其它表示高给药体积时的赋型剂剂型的重要性的有限数据。这些数据表明对于静脉内输液的可耐受体积方面存在着巨大差异，取决于所使用的赋型剂。尚未研究对其它生理系统的长期影响。Intradermal.Thissiteistypicallyusedforassessmentofimmune,inflammatoryorsensitizationresponse.21,22Materialmaybeformulatedwithanadjuvant.Volumesof0.05–0.1mlcanbeused,dependentuponthethicknessoftheskin.皮内给药：该部位给药主要用于评估免疫、炎症或过敏反应。原料可以用佐剂配制。给药体积为0.05–0.1ml，取决于皮肤厚度。Vehiclesforadministration用于给药的赋型剂Vehicleselectionisanimportantconsiderationinallanimalinvestigations.Vehiclesthemselvesshouldofferoptimalexposurebutshouldnotinfluencetheresultsobtainedforthecompoundunderinvestigation,andassuchtheyshouldideallybebiologicallyinert,havenoeffectonthebiophysicalpropertiesofthecompoundandhavenotoxiceffectsontheanimals.Ifacomponentofthevehiclehasbiologicaleffects,thedoseshouldbelimitedsuchthattheseeffectsareminimizedornotproduced.Simplevehiclesusedtoadministercompoundsincludeaqueousisotonicsolutions,bufferedsolutions,co-solventsystems,suspensionsandoils.Fornon-aqueousinjectates,considerationshouldbegivenfortimeofabsorptionbeforere-dosing.Whenadministeringsuspensionstheviscosity,pHandosmolalityofthematerialneedtobeconsidered.Theuseofcosolventsystemsneedscarefulattentionbecausethevehiclesthemselveshavedose-limitingtoxicity.Laboratoriesareencouragedtodevelopastrategytofacilitateselectionofthemostappropriatevehiclebasedontheanimalstudybeingperformedandthepropertiesofthesubstanceunderinvestigation.在所有动物研究中，赋型剂的选择均是一个重要的考虑因素。赋型剂本身应该给药物提供最佳的暴露量而不应影响受试化合物的试验结果，由此一个理想的赋型剂应该无生物活性，对化合物的生物物理特性没有影响且对动物没有毒性作用。如果赋型剂的成分之一具有生物学效应，则应该限制该赋型剂剂量，如此就能够尽可能地减弱该赋型剂的这些效应或不会产生效应。给予化合物时所使用的简单赋型剂包括等渗性水溶液、缓冲溶液、助溶系统、混悬液和油溶液。对于非水性注射液，再次给药前应考虑药物的吸收时间。当给予混悬液时，应考虑原料的粘度、pH和等渗性。使用助溶剂系统必须小心，因为赋型剂本身具有剂量限制性毒性。鼓励实验室根据开展的动物研究以及受试物特征来发展新的策略以促进最佳赋型剂的选择。GOODPRACTICEGUIDEFORBLOODSAMPLING良好采血的规范指南Introduction引言BloodremovalisoneofthemostcommonproceduresperformedonlaboratoryanimalsandmethodsforlaboratorymammalsandbirdswerereviewedinthefirstreportoftheBVA/FRAME/RSPCA/UFAWJointWorkingGrouponRefinement.23Thiscurrentarticleaimstoprovideaneasy-to-useguidebasedonthelatestavailableinformation,andaddressestheneedsoftoxicokinetic(pharmacokinetic)andtoxicologystudies.Thepracticeofbloodsamplingfromavarietyofrodentsusingtheretrobulbarvenousplexustechniqueisstillincommonuseandsuggestionsforalternativeroutesaredescribedbecauseofconcernsoverthesequelaeofusingthismethod.采血为在实验动物中执行的最常序之一，在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW联合工作组的第一次报告中总结了实验哺乳动物和禽类的采血方法。该当前文章的目的在于根据可利用的最新信息提供一个易于使用的指南，并着重于毒代动力学以及毒理学(药代动力学)研究的需要。从各种啮齿类动物的眶后静脉丛采血的方法仍然被广泛使用，因为采用该方法会出现遗症，因此描述了一种建议的替代途径。Circulatingbloodvolumes循环血容量Thecalculationoflimitvolumesforbloodsamplingreliesonaccuratedataoncirculatingbloodvolumes.Areviewoftheliteratureindicatesthatthereisconsiderablevariationinthesevalues,probablyrelatingtothetechniquesused,thestrainandgenderofanimal,etc.Thetechniquesmostfrequentlycitedareradiolabellederythrocytes,24–26radiolabelledtransferrin,27radiolabelledserumalbumin,28–30markerdyes,31enzymedilution,32,33fibreoptics34anddextran-70.35采血量根据准确的循环血容量数据计算。文献综述表明应考虑到这些数据的变异情况，可能与使用的技术、品系和动物性别等有关。引用最多的技术为同位素标记性红细胞、同位素标记性转铁蛋白、同位素标记性血清白蛋白、标记用染料、酶稀释法、光纤和右旋糖苷-70。Table3givesthecirculatingbloodvolumesofthespeciescommonlyusedinsafetyevaluationstudies.Dataonthemarmosetandminipig,whicharebecomingmorefrequentlyusedintoxicology,havenowbeenincluded.Thevaluesshownhavebeenadaptedfromdifferentsourcesassumingthattheanimalismature,healthyandonanadequateplaneofnutrition.23,36–39表3给出了在安全性评价研究中普遍使用的动物种属的循环血容量。此处总结了在毒理学研究中使用得日渐频繁的绒猴和小型猪的数据。显示的数据根据不同来源并假定动物为成熟、健康并且营养充足的数据综合而成。Bloodsamplingvolumes采血体积Ourrecommendationsarebasedonpublishedwork,onrecentworkcarriedouttoinformtheworkingpartyaboutcertainissuesandisbeingsubmittedforpublicationandoninformationfrom‘in-house’standardoperatingprocedures.我们推荐的数据基于公开的研究结果，最近开展的研究以告知工作组有关某些问题的数据和正在被提交以供公开的数据以及来源于内部标准操作程序的信息。Animalwelfareisaprimeconsiderationwhenbloodsamplingisapproachinglimitsbutthescientificimpactofananimal’sphysiologicalresponsealsomustbeconsideredbecausethismayaffectdatainterpretationandvalidity.Assessmentofclinicalsignsshownbytheanimals,priortosampling,withreferraltosupervisoryorveterinarystaffindoubtfulcases,isanexpectedprerequisite.当采血量接近极限时动物福利为首要考虑的问题，但亦必须考虑动物的生理反应与科学性之间的冲突，因为这可能影响数据的阐释和有效性。在可疑的情况下，监察员或兽医应在采血前对动物表现出来的临床症状进行评估。WorkofScipionietal.40indicatedthatremovalofupto40%ofarat’stotalbloodvolumeover24handrepeated2weekslatercausednogrossilleffects.Byandlargetherearefewdataoncriticalaspectsofanimalwell-beingafterremovalofblood,suchasheartrate,respiratorypatterns,varioushormonallevelsandbehaviouralaspectssuchasactivitiesandtimespentcarryingthemout.Allthesemaychangeinresponsetoexcessivebloodremovalbutitwouldrequireconsiderableeffortandresourcestoinvestigatethem.However,haematologicalparameterscanbemeasuredeasilyandinasmallproject41theredbloodcellcount(RBC),haemoglobinlevel(HGB),haematocrit(HCT),meancorpuscularvolume(MCV)andredcelldistributionwidth(RDW)weremeasuredaftertheremovalofvaryingbloodvolumes.Volumesof7.5%,10%,15%and20%ofcirculatingbloodvolumes(as0.3-mlaliquots)wereremovedfrommaleandfemaleSprague-Dawleyrats(n=7)weighingca.250govera24-hperiodtomimicakineticstudy.Animalsthenwerefollowedforupto29days.Scipioni等的工作表明24小时内大鼠的取血量达其总血容量的40%并重复取血2周后总体上不会引起致病性效应。基本上只有少量有关取血后动物健康的临界特征的数据，如心率、呼吸特征、各种激素水平以及行为特征如活动和移动自身所花的时间。所有这些均可能由于过度取血而出现变化，但研究这些变化需要耗费相当多的精力和资源。然而，血液学指标很易通过一个小型的研究来测定，采集不同体积的血量后，测定了动物的红细胞数量(RBC)、血红蛋白水平(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞容量(MCV)和红细胞分布宽度(RDW)。在24小时内的取血体积占体重大约为250g的雄性和雌性SD大鼠(n=7)的循环血容量的7.5%、10%、15%和20%(按0.3-ml等分)以模拟动力学研究。随后对动物进行追踪观察，总共29天。Theresultsshowedthattherewasconsiderablevariationinthetimestakenforalltheseparameterstoreturntobaselinelevels,andinthe15%and20%groupssomeoftheparameters(MCV,RDW)didnotreturntobaselineevenafter29days.Therecoverytimerecommendedhereformultiplesampling,therefore,isthetimetakenforallratsina‘volume’grouptoreturnto‘normal’(thestartinglevelforeachanimalplusorminus10%).Singlesampling(suchasthatrequiredforroutinetoxicitystudies)beyond15%isnotrecommendedbecausehypovolaemicshockmayensueifitisnotdoneveryslowly.Multiplesmallsamplesareunlikelytoproducesuchacuteeffects.结果表明所有这些指标恢复到基线水平所花的时间存在相当大的差异，其中取血时间占循环血容量的15%和20%的动物组中的某些指标(MCV,RDW)在29天后未能恢复到基线水平。此处推荐的针对多次采血的恢复时间是指所有采血组中的大鼠恢复到正常水平(每只大鼠的初始水平加减10%)所耗的时间。推荐单次采血(如常规毒性研究要求如此)的体积不应超过循环血容量的15%，因为如果采血过快可能引起失血性休克。多次少量采血不大可能产生类似的急性效应。Table4featureslimitvolumesandadequaterecoveryperiodsandtakesintoaccountthestressofmultiplesamplinginadditiontootherproceduresinassessingoverallseverity.Thetableaddressesbothsingleandmultiplesamplingregimes.Additionalrecoverytimeisproposedforanimalsontoxicitystudiesbecauseacriticalevaluationofhaematologicalparametersisrequiredinsuchstudies.表4反映了极限体积和足够的恢复期并且考虑了多次采血后的应激性，整体严重性评估中的其它过程除外。该表着重于单次和多次采血体系。建议对毒性研究动物给予额外的恢复时间，因为在此类研究中必须严格评价血液学指标。Thehighervolume(20%)isintendedtofacilitateserialbloodsamplingfortoxico-orpharmacokineticpurposeswheremultiple,smallsamplesareusuallyrequired.However,itshouldberememberedthattheconsequentialhaemodynamiceffectoftakingsuchlargevolumesmaywellaffectthecalculatedhalf-lifeAssessmentofterminalhalf-lifeshouldbepossibleiffinalsamplesaretakenwithin24hofthekillingofananimal.Thesevaluesdonotincludeaterminalsample,whichcanbetakenwhentheanimalisterminallyanaesthetized.Bloodreplacementhasnotbeenconsideredbecausethevolumesproposeddonotwarrantsuchintervention.采用较高的体积(占循环血容量的20%)以利于毒代或药代动力学的连续性采血，此处通常要求多次、少量取样。但是，应该记住如此大体积采血对血液动力学的重大影响，可能影响半衰期的计算。如果最后一次采样在处死动物的24小时内则有可能对终末半衰期进行评估。这些数据不包括最后一个样本，该样本为当动物最终被麻醉时能够被采集的一个样本。未考虑使用血液代用品，因为在推荐的采血体积下不允许使用此类人为干预。UsingthevaluesfromTable4,aneasyreferenceguideforthevolumesthatcanberemovedwithoutsignificantdisturbancetoananimal’snormalphysiologyispresentedinTable5.采用表4中的数据得到不会明显干扰动物正常生理的采血体积的简易参考指南，见表5。Samplingsites采血部位Sitesforvenepunctureandvenesectionhavebeenconsideredmainlyinrodentsandrabbit.23Thisinformationhasbeenreviewedinthelightoftechnicaladvancesinbloodsamplingprocedures;theadvantagesanddisadvantagesofsitesforeachspeciesareshowninTable6,withtherecommendedonesforrepeatedsamplingsummarizedinTable7.静脉穿刺和静脉切开的部位主要考虑用于啮齿类动物和家兔。根据采血程序的技术进展对该信息进行了总结；每种种属的采血部位的优势和缺点见表6，重复采样的推荐部位总结于表7。Itisimportanttonotethatsamplestakenfromdifferentsitesmayshowdifferencesinclinicalpathologyvaluesandhaveimplicationsforhistoricaldatabases.Forthemoretraditionalroutes,adescriptionofthemethodologycanbeobtainedfromthestandardliterature.However,othermethodsrequireaspecialmentionandhavebeenreviewedbelow.值得注意的是从不同部位采集的样品在临床病理数据方面可能有所不同，且对历史数据库有影响。对于更加传统的采血途径，可从标准文献中找到方法学描述。但是，对需要特别提及的其它方法综述如下。Lateraltarsal(saphenous)vein.Thistechniquehasbeenusedinmanylaboratoryanimals,includingrats,mice,hamster,gerbil,guineapig,ferret,mink42andlargeranimals,andvolumessuchas5%ofcirculatingbloodvolumemaybetaken.Itdoesnotrequireananaestheticandsoisparticularlysuitableforrepeatedbloodsamplingasinpharmacokineticstudies.Thesaphenousveinisonthelateralaspectofthetarsaljointandiseasiertoseewhenthefurisshavedandtheareawipedwithalcohol.Theanimalisplacedinasuitablerestrainer,suchasaplastictube,andtheoperatorextendsthehindleg.Theveinisraisedbygentlepressureabovethejointandthevesselispuncturedusingthesmallestgaugeneedlethatenablessufficientlyrapidbloodwithdrawalwithouthaemolysis(e.g.25–27gforratsandmice).Forsmallvolumes,asimplestableadstoadropofbloodformingimmediatelyatthepuncturesiteandamicrohaematocrittubecanbeusedtocollectastandardvolume.Afterbloodhasbeencollected,pressureoverthesiteissufficienttostopfurtherbleeding.Removalofthescabwillenableserialsampling.跗外侧静脉(隐静脉)：该技术已经在许多实验动物中应用，包括大鼠、小鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠、雪貂、水貂以及体型较大的动物，可以采集占循环血容量5%的血量。该方法不要求麻醉，因此特别适用于重复采血，如药代动力学研究。隐静脉在跗骨关节的旁边，当刮去被毛并用酒精擦拭后很容易看见。将动物置于合适的固定器上，比如塑料试管，操作者分开动物的后肢。在关节上轻轻施压则该静脉凸起，然后采用能够满足快速取血而不会引起溶血的最小号的针头刺入血管(如25–27G针头适用于大鼠和小鼠)。对少量采血而言，可以采用简单的刺伤从而在刺伤部位快速形成血滴，此时可使用微量血细胞比容试管收集标准体积的血液。采血后，在刺伤部位施加足够的压力以止血。剥去结痂可连续取血。Thereappeartobenocomplicationsreportedotherthanpersistent(minor)bleedingandthemethodhastheadvantagethatanaesthesiaisnotrequired.Eventhoughnostudieshavebeendoneonanimalwelfareintermsofbodyweightgain,diurnalrhythm,behaviour,etc,itseemsunlikelythatthisroutewillseriouslyaffectananimal’swell-being.除顽固性(很少)出血外，目前看来没有并发症报道，该方法的优势在于不需麻醉。即使没有根据体重增长、昼夜活动规律、行为等进行过有关动物福利的研究，但看来该途径不大可能严重影响动物的健康。Marginalearvein/centralearartery.Bloodsamplingfromthemarginalearveiniscommonlyusedinrabbitsandguineapigs.Thisroutemayalsobechoseninminipigs,oftencombinedwiththeuseofanintravenouscannula.Goodrestraintisnecessaryandtheapplicationoflocalanaestheticcreamsome20–30minbeforebleedinghelpstopreventananimalfromshakingitsheadastheneedleispushedthroughtheskin.Bleedsmayalsobetakenbysmearingthesurfaceovertheveinwithpetroleumjellyandthenpuncturingtheveinandcollectingthebloodintoatube.Fortheremovaloflargeramountsofbloodthecentralarteryinrabbitscanbeused,butafterwardsitmustbecompressedforatleast2mintopreventcontinuingbleedingandhaematoma.Theanimalshouldbecheckedforpersistentbleeding5and10minlater.Repeatedsamplescanbetakenfromthisarteryusinganindwellingcannula,thusfacilitatingakineticregimenover8h.耳缘静脉/耳中央动脉：从耳缘静脉采血最常用于家兔和豚鼠。该途径也可在小型猪中选用，通常与静脉内套管结合使用。必须进行良好的固定，在采血前大约20–30分钟应用局麻膏剂有助于防止针头穿透皮肤时动物头部出现摇摆。也可用凡士林涂在静脉的表面，然后刺破静脉用试管收集血液。如果取血量较大，则可通过家兔耳中央动脉取血，但取后必须按压至少2分钟以止血和防止血肿。持续性放血5和10分钟后应对动物进行检查。使用留置套管能够重复从该动脉采血，因此有利于超过8小时的动力学研究。Sublingualvein.Thistechniqueiseasytoperforminrodentssuchasratsandissuitablefortheremovaloflargevolumesofblood(e.g.0.2–1ml)atfrequentintervals,limitedonlybythebloodvolumetoberemovedandbythenecessaryrepeatedanaesthesia.Arefinedmethod43avoidssomeofthedisadvantagespreviouslyseenandcanbeusedforrepeatedsampling.Ratsareanaesthetizedandheldbyanassistantinasupineposition.Thelooseskinatthenapeoftheneckisgatheredupinordertoproducepartialstasisinthevenousreturnfromthehead.Asecondpersongentlypullsoutthetonguewithacotton-tippedapplicatorstick,graspsitwiththumbandforefingerandoneofthesublingualveins(thereisoneoneachsideofthemidline)ispuncturedwitha23–25ghypodermicneedleasneartothetipofthetongueaspossible.Theratisturnedovertoallowbloodtodripintoatubeandaftertherequisitevolumeofbloodhasbeenobtainedthecompressionatthescruffoftheneckisreleasedandtheanimalisplacedinasupineposition.Thetongueisagainextendedinordertostemtheflowofbloodwithadrycotton-tippedapplicatorstick;usuallythereisnoneedtouseanyhaemostaticagent.舌下静脉：该操作在啮齿类动物如大鼠中易于进行且适合于较大体积(如0.2–1ml)的频繁性采血，仅受限于采血体积和必要的重复性麻醉。一种简化的方法避免了以前的方法中所见到的缺点且能够用于重复性采血。大鼠麻醉后，由助手握持住大鼠，使其处于仰卧位。聚拢颈背部松弛皮肤以便部分阻塞静脉血从头部回流。第二名操作者用顶端被棉花包裹的涂抹棒轻轻拉出舌头，用拇指和食指抓住舌头，用23–25G皮下注射针头刺破舌下静脉之一(中线的左右侧各有一根舌下静脉)，尽可能靠近舌尖。将大鼠翻转以便于血液流入试管中，采集到需要量的血后，松开施加在后颈部的压力，将动物置于仰卧位。再次将舌头拉出用顶端被干棉花包裹的涂抹棒止血；通常没有必要使用任何抗凝剂。Withthistechnique,ratsdonotshowanysignificantdifferencesinfoodorwaterconsumptionorbodyweightgaincomparedwithuntreatedanaesthetizedcontrolanimals.Moreover,thereappeartobefewerpathologicalchangesthanwithretrobulbarsampling44.However,anaesthesiamaystillbealimitingfactor.采用该技术，大鼠在摄食和饮水或体重增长方面与未采血的麻醉对照动物相比没有明显差异。此外，该法较眼球后采血所引起的病理变化更少。但是，麻醉可能仍然是一个限制性因素。Lateraltailvein.Inprinciplethisrouteissimilartothelateraltarsalveinbuttendstoyieldsmallerbloodvolumes(0.1–0.15mlinmice;upto2mlinwarmedrats).Bloodisremovedeitherbysyringe/needleorstabpunctureofalateraltailvein.Anaesthesiaisunnecessary,whichmakesthisrouteparticularlysuitedforrepeatedbloodsampling.Vasodilatationmaybenecessarytopromotebleedingandcanbecausedbyexposingananimalto37°Cfor5–8minorbylocalwarmingofthetail.Thereappeartobefewdisadvantagesthataffectanimalwell-being,butanimalsmustbecloselymonitoredforsignsofdistressifheatexposureisused.尾侧静脉：原则上该途径与跗外侧静脉相似，但倾向于获得较小的采血量(小鼠0.1–0.15ml；处于暖和条件下的大鼠最高可达2ml)。可以通过注射器/针头或刺穿尾侧静脉采血。由于勿需麻醉，这使得该途径特别适用于重复采血。有必要使血管扩张以促进血流，可以将动物暴露于37°C的温度中共5–8min或加热尾部。该方法损伤很小，基本不会影响动物健康，但在加热时必须严密监测动物的不适症状。Cranialvenacava.Minipigsmayberestrainedinaslingorontheirbackswiththeforelegsretractedcaudally.Othermethods,sometimesusedinagriculturalsettings(snouttying,hogtying,suspendinganimalsbytheirrearlegs),arestressfulandareinappropriateforlaboratoryanimalsbecauseofthepotentialadverseeffectsonthescience.Inordertoavoidinjurytothevagusnerve,theneedleisinsertedintotherightsideoftheneck,lateraltothemanubriumsterni,anddirectedata30–45°angletowardstheleftshoulder.Apoppingsensationwillbefeltbythesamplerwhentheneedleentersthevein,andthenbloodcanbereadilywithdrawn.Thismethodcanalsobeutilizedforsequentialvenipuncturebuthaematomasformintheareaaftertheneedleiswithdrawn,thereforeitisbestreservedforproceduresthatdonotrequirewithdrawalmoreoftenthanweekly.45颅大静脉：小型猪可以用绳套固定或将其前肢后缩固定于其背部。农业上有时采用的其它方法(捆绑嘴部、捆绑猪躯干、通过后肢悬吊)会引起动物紧张，因此不适用于实验动物，因为会对研究的科学性产生潜在的不利影响。为避免损伤迷走神经，应将针头插入颈部右侧，胸骨柄旁，以30–45°角向左肩方向进针。当针头进入血管的时候通过取样器可以觉察到破裂的感觉，然后可以轻易地采集到血样。该方法亦被用来作连续性静脉穿刺，但抽出针头后穿刺部位形成血肿，因此在不要求每周频繁采血的情况下，该方法为一种最佳候选程序。Amputationofthetailtip.Thistechniqueiscommonlyusedinratsandmice,withsamplevolumesof0.1–0.2mlbeingobtained.Amputationshouldberestrictedtothetailtip(0.5–1mmshouldbeadequate,andovertimeamaximumof5mmcanberemoved)andrepeatbleedingisfeasibleintheshorttermbyremovingtheclot.Serialamputationsresultinginasignificantshorteningofthetail(i.e.＞5mm)arenotacceptable.Thetechniquemaynotbesuitableforolderanimals.Anaesthesiaisrecommended.尾尖切断术(断尾法):该技术通常用于大鼠和小鼠，采血量为0.1–0.2ml。切断术应仅限于尾尖(每次0.5–1mm应当足够，随试验需要最多只能切除5mm)，通过去除血凝块可在短期内重复采血。可明显缩短尾部(如＞5mm)的连续性切断术不能被接受。该技术不适合老龄动物。建议对动物进行麻醉。Cardiacpuncture.Thisshouldalwaysbecarriedoutundergeneralanaesthesiaandinthepastithasbeenusedwithrecoveryinsmallrodentsduetothelackofalternativeroutes.However,othermethodsarenowavailableandbecauseofpotentiallypainfulandfatalsequelae,suchaspericardialbleedingandcardiactamponade,thistechniqueshouldonlybeusedforterminalbleeds.心脏穿刺：该方法通常在麻醉条件下进行，在过去由于缺乏替代途径，因此被用于对小型啮齿类动物采血。但是，现在有其它方法可供利用，并且由于潜在性疼痛和致命性后遗症，如心包出血以及心脏压塞，因此该技术应仅用于末期采血。Retrobulbarplexus.Theretrobulbarroutehasbeencommonlyusedbyresearchersinthepastbuthasbeenobservedtocauseadverseeffects.Concernhasthereforearisenbecauseoftheseeffectsandtheirpotentialseverity.Recently,however,othermethodshavebeendevelopedthatmeetthescientificrequirementsandalsoimprovethewelfareoftheanimals.Nevertheless,theTechnicalSubgroupfeltthatitwasworthreviewingindetailsomeoftheadvantagesanddisadvantagesofretrobulbarbleedinginthecontextofthenewmethods.眼球后静脉丛：研究者过去普遍采用眼球后采血途径，但会引起的不良反应。因为这些不良反应及其潜在的严重性，因此该方法所涉及到的利害关系正日渐突出。但是，最近已开发出其它符合科学性要求的方法，由此改善了动物福利。然而，技术小组感到在新方法的上下文中应详细回顾眼球后采血的优势和缺点。Bleedingfromthisplexusalwaysshouldbecarriedoutundergeneralanaesthesiainallspeciesandanaesthesiaisarequirementinsomenationalregulations.Themethodhasbeendescribedindetailbyanumberofworkers.46–48对于所有种属的静脉丛采血均应该在常规麻醉条件下进行，在某些国际注册中要求对动物进行麻醉。大量工作者对该方法均进行了详尽的描述。Thereislittlepublishedworkonrefiningthemethod.Theapproach(lateraloraccessviathedorsalorupperaspectoftheeyeinrats)astheoptimalwaytopenetratetheconjunctivainordertominimizetissuedamagehasbeendiscussed.23Anintervalof2weeksbetweenbleedsatthesamesiteshouldallowdamagedtissuetorepairinmostcases,49butthisdoesnotmeanthattheanimalsdonotexperiencesomediscomfortduringtheearlystagesbeforehealingiscomplete;thereare,however,concernsoverrepeatedretrobulbarpunctures.Whereassomestudieshaveshownthatrepeatedorbitalbleedsdonotaffecttheanimals’diurnalrhythm50,51orthehistologyoftheorbitaltissuelongterm52,49(i.e.bothshowedthatanytissuedamagehealed),otherstudieshavefoundhistologicalchanges,abnormalclinicalsignsandevidenceofdiscomfort53–55whichhasledtoanimalshavingtobekilledonhumanegroundsandsolostfromthestudy.Therearealsootherseriouspotentialadverseeffects:仅有少量有关简化该方法的研究工作被公开。作为穿透结膜的最佳方法以尽量减轻组织损伤的途径(从腹侧、背侧和上方进入大鼠眼球)已有所讨论。在同一部位的两次采血之间必须有2周间隔期以使损伤组织可以在大多数情况下恢复，但这并不意味着动物在完全恢复前的早期不会经历某些不适。然而某些研究已表明重复眼窝采血不会长期影响动物的昼夜节律或眼窝组织结构(如这两篇文献中的研究均表明任何组织损伤均痊愈)，其它研究发现了组织变化、异常临床表现和明显不适，从而出现人道立场不得不处死动物从而给研究工作带来损失。该方法还存在其它严重的潜在性不良反应：(i)retrobulbarhaemorrhageresultinginhaematomaandexcessivepressureontheeye,whichisalmostcertainlypainfulfortheanimal;(ii)anypressurerequiredtostempersistentbleeding(e.g.bypressingontheeye)orpressurefromahaematomacanleadtocornealulceration,keratitis,pannusformation,ruptureoftheglobeandmicro-ophthalmia;(iii)damagetotheopticnerveandotherintra-orbitalstructures,whichcanleadtodeficitsinvisionandevenblindness;(iv)fractureofthefragilebonesoftheorbitandneuraldamagebythemicropipette;andpenetrationoftheeyeglobeitselfwithalossofvitreoushumour.(i)引起血肿和眼压过高的眼球后出血，必须会使动物感到疼痛；(ii)任何为止血而施加的压力(如压迫眼部)或来源于血肿的压力均能导致角膜溃疡、角膜炎、角膜翳形成、眼球破裂和小眼畸形；(iii)视神经和其它眼窝内结构损伤可导致视力降低甚至失明；(iv)毛细管引起眼眶脆骨骨折和神经损伤；伴玻璃体液丢失的眼球自身穿通伤。Manyoftheseunwantedsequelaemaystayundetected,beinglocateddeepwithintheorbit.Theincidenceofunwantedside-effectsappearstovarybetween1%and2%,52butmaybefarhigherinthehandsofsometechnicians,eventhoughtheywereexperienced(seetable1ofRef.55).许多这些位于眼窝深处的有害后遗症可能仍然未被发现。有害副作用的发生率差异似乎介于1%和2%之间，但出于所采用的技术不同，该发生率可能远高于此，即使是经验丰富的实验操作人员(见参考文献55中的表1)。FrequencyofneedlepuncturesItisimportanttocarryouttheminimumnumberofneedlepuncturesconsistentwithobtaininggoodscientificdata.Thesamepuncturesiteshouldnotbeused,i.e.usedifferentpointsalongavein.穿刺频率尽量减少穿刺次数从而取得良好的科学性数据这一点非常重要。不应使用同一穿刺部位，如沿着静脉采用不同的穿刺点。Cannulation套管Thisisanimportanttechniqueforrepeatedbleeds.Temporarycannulaesuchasbutterflyneedlesandover-the-needlecannulaecanbeusedintheshortterm(workingday),whereasforlong-termusesurgicalimplantationofbiocompatiblecannulaeisrequired.Thesemethodsallowrepeatedbloodsamplingwithminimaldistressanddiscomfortfortheanimal.Theuseofsubcutaneousvenousaccessportsisalsousefulbecauseitallowsanimplantedanimaltostaywithitspeers,butthereareanumberofpotentialproblemsthatmustbeaddressed:对于重复取血而言这是一项非常重要的技术。在短期(工作日)采血中可使用临时性套管如蝶形针和套管针，然而对于长期取血而言，有必要通过外科手术植入生物排斥性套管。这些方法允许重复采血，且尽量减轻了动物的痛苦和不适。也可利用皮下静脉输液港的作用，植入该装置的动物可与其同类呆在一起，但应该强调的是，该方法存在如下大量潜在性问题：(i)Surgicalskillsareessentialanditmustbedoneinasterilewayforgoodlong-termperformance56andtoavoidcomplicationssuchasinfection.Clottingfrequentlyoccursandmaypreventbothbloodremovalandprolongedinfusionofsubstances.(ii)Itmaybenecessarytorestrainananimalortoseparateitfromitspeersinordertopreventremovalorbitingoftheattachedexternalcannulae,whichiswhyasubcutaneousvenousaccessportispreferredinthelongterm.(iii)Afterlong-termcannulation,penetrationofthevesselcanoccurandananimalmayalsooutgrowitscannula.(i)外科手术技巧为基本要求，必须在无菌条件下进行以使动物长期性保持良好的状态及避免并发症如感染。血凝块频繁出现并可能影响采血和延长药物的输液时间；(ii)可能有必要固定动物或单独饲养以防止套管脱落或引起刺痛，这就是在长期采血中首选套管法的原因；(iii)长期植入套管后，可出现血管渗透且动物亦可能因此沿植入的套管而长出自身的套管。Anaesthesia麻醉Somecommentsonhowvariousanaestheticsaffectthemusclecellsinthespleniccapsule(ifpresent)aregiveninthefirstreportoftheBVA/FRAME/RSPCA/UFAW,23aswellasotheraspectsofpromotingbloodwithdrawal.Inrelationtotheremovalofbloodfromsmalllaboratorymammals,itisworthnotingthatthecombinationoffentanylandfluanisone(Hypnorm),withorwithoutmidazolam(Hypnovel),causesasignificantperipheralvasodilatationinallspecies.Althoughthismakestakingbloodsampleseasier,italsomakespost-samplinghaemorrhagemorelikelyandsoparticularattentionmustbepaidtoensuringhaemostasis.Considerationshouldbegiventotheuseoflocalanaesthetics.在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW的首次报告中给出了某些关于不同的麻醉对脾被膜(有该组织存在的情况下)肌细胞的影响程度的评论以及其它有助于采血的方法。对于小型实验室哺乳动物的采血，值得注意的是联用芬太尼和氟阿尼酮(麻醉药Hypnorm)加或不加咪达唑伦(镇静药Hypnovel)在所有种属中均明显引起外周血管扩张。尽管这有利于采血，但亦更容易出现采血后血肿，因此应特别注意止血。应考虑使用局麻药。Conclusionandrecommendations结论和建议Thereisnowarangeofalternativemethodsfortheremovalofbloodfromallspeciesofanimals,particularlythesmallerrodentswhereinthepastithasnotbeeneasy.Furthermore,somemethodsrequireananaestheticorhaveahigherincidenceofunwantedside-effectsthatmayseriouslyaffectananimal’swelfare,particularlywhenrepeatbleedingisrequired.Wethereforerecommendthat:对所有动物种属的采血现在均有一定的替代性方法，特别是较小的啮齿类动物，而在过去不易做到。此外，某些方法需要麻醉或有害副作用的发生率较高，可能严重影响动物的福利，特别是要求重复取血时。因此我们提出如下建议：(i)recommendedroutesforbleedingarethelateraltailvein,thesublingualveinandthelateraltarsalveinforallrodents,andthemarginalearvein,centraleararteryandthejugularveinforrabbits;(ii)retrobulbarsamplingwithrecoveryshouldbeusedonlywhenotherroutesarenotpractical;(iii)samplingbycardiacroutesisonlycarriedoutasaterminalprocedureundergeneralanaesthesia.(i)推荐的对所有啮齿类动物采血的途径为尾侧静脉、舌下静脉和跗外侧静脉，家兔采用耳缘静脉、耳中央静脉和颈静脉；(ii)眼球后采血并恢复仅适用于无法采用其它途径时；(iii)心脏采血仅作为终末处死动物时在麻醉条件下进行。Finally,wewishtoemphasizethat,asinallexperimentalproceduresinvolvinganimals,thoroughtrainingandcompetenceofpersonneliscrucialforsuccessfulbleeding,minimizingtissuedamageandalsoforthehealthandwelfareoftheanimals.最后，我们想强调的是在所有与动物有关的实验过程中，加强培训和人员的能力对于成功采血、最小化组织损伤以及对于动物的健康和福利是至关重要的。编译：良好的实验动物给药和采血(包括途径和体积)规范指南Karl-HeinzDiehl1,RobinHull2,DavidMorton3,RudolfPfister4,YvonRabemampianina5,DavidSmith6,*,Jean-MarcVidal7和CorvandeVorstenbosch81德国马尔堡市35001区1140信箱安万特公司2英国赫特福德郡EN63QG波特斯巴镇SouthMiimms布兰奇道英国国家生物制品检定所3英国伯明翰市B152TT艾吉马斯顿伯明翰大学医学院4瑞士巴塞尔CH-4002诺华制药公司5法国AmboiseCedexZ1Poce´-sur-Cisse-BP15937401Etablissementd’Amboise辉瑞研究中心6英国莱斯特郡LE115RH拉夫堡市贝克韦尔路Charnwood阿斯利康研究中心7法国RomainvilleCe´dex95235Noisy路102号安万特公司8荷兰BHOss534020号信箱欧加农公司关键词：血容积；采血；给药；实验动物；简化该文章为欧盟制药工业协会(EFPIA)和欧洲替代动物实验方法验证中心(ECVAM)之间的初步研究结果。其目的在于为安全性评价实验室的研究者提供最新的易于使用的数据库以帮助研究设计过程，同时最大可能地考虑到实验动物的福利。尽管该文章针对的是欧洲制药工业界的研究者，但支撑该数据库的基本原理及改进建议同样适用于所有在他们的研究中使用这些动物实验技术的人，不论是研究所、大学或其它行业中的研究者。有关供试品给予和采血的出版物众多，且许多实验室在多年的经验和实践基础之上亦发展了它们自己的内部指南。在欧盟化妆品标准86/609EEC中，我们有义务简化实验以最小化动物的紧张程度。我们希望该文能够对那些负责方案设计和审核的研究者提供有用的背景数据。该文章基于历年所有可能收集到的同行评议出版物，但我们未能够收集到的内部数据和那些工作组的经验(以及行业提交的有用的注释)除外。该指南亦强调了持续性简化与给药和采血有关的技术的必要性，并且建议该如何去进行这方面的工作。应该鼓励实验室间的数据共享以避免重复性动物研究，以及共享在某些方法或其它情况下的“药物过量”所引起的与动物福利有关的实际技术和科学问题。有必要对该指南中涉及到的“正常动物”要求进行特殊考虑，如妊娠和哺乳期间的动物。当给药体积较大或过度采样时对研究结果的诠释可能会令人感到困惑，特别是使用麻醉动物时。良好的给药规范指南引言各种科学研究都需要对实验动物给药以符合药品注册要求。特别是在制药工业领域已研究了与动物福利以及科学性相一致的给药水平。在新药的临床前安全性评价阶段使用多种“有效剂量”以尽量确定必要的安全性范围是一种常规惯例。在使用低毒或溶解性极差的化学药品以一种可接受的制剂形式进行研究时，动物的个体给药体积可能较大以满足科学性和注册的要求。拟用临床剂量可能会使得给药体积较大，超过了动物可接受的正常给药体积，如静脉内注射用的造影剂或血浆增容药物。EFPIA/ECVAM技术小组的目标如下：(i)提供一个药品注册当局所要求的毒性研究中常规使用的实验动物的给药体积的指南；(ii)根据动物福利和实用性提供一个在良好规范条件下常规使用的一致性剂量水平；(iii)提供一个代表常规规范上限的剂量水平，以为特殊研究留下一定的剂量扩展余地。给药体积表1表示最常使用的种属的一般给药途径下的给药体积。它们是根据发表的文献和内部指南综合得到的结果。现在认为绒猴和小型猪在此类常用动物之列，因为它们在欧洲的使用日渐增加。每一列显示了两组数据，左侧数据拟用来指导在单次或多次给药的“良好规范”中的给药体积；所给出的右侧数据为可能的最大给药值。如果超过了最大值就会涉及到动物福利或科学性，应当参考负责兽医的外科医生的意见。在某些实际运用，这些数据应符合药典要求。从近来发表的文献中已经得到了这些建议的最大值中的某些数据，但当与“良好规范”数据相比时显得较高。强调了较高给药体积时对动物福利和使用的原料制剂进行仔细关注的必要性，特别是拟进行重复给药时。研究的持续时间和科学有效性应该让步于由于给药体积过高所出现的生理反应。因此在方案定稿以及着手研究之前通过比如监察员或伦理委员会充分地考虑到了这些出版物中的伦理观要素。亦就伦理及科学依据强烈要求对任何新剂型进行物理化学相容性研究(体外)和小型的先导性研究(少量动物组)以免在大型研究中出现失误。给药体积应该最大限度地与化合物剂型和给药准确性相一致。给药途径经口给药途径：某些情况下在给药前有必要限制动物的摄食。该因素可能会影响药物吸收。较大的给药体积(40ml/kg)表明超过了胃容量负荷并快速通过胃进入小肠。较大的给药体积亦可以造成食管返流。禁食时间取决于动物种属的饲养方式、禁食的起始时间、种属的生理学特征、给药时间的长短、食物和光照周期。当药液通过灌胃给予时，要求给药必须准确以避免给药意外。胃肠外给药途径：对于经胃肠外给予的药物而言，应考虑所采用的制剂的给药体积、给药前和给药后制剂的稳定性、pH、粘度、等渗性、缓冲能力、无菌及生物相容性因素。这对于多次给药研究尤其重要。Claassen总结了这些因素中的某些细节。应使用最小型号的针头、考虑给药体积、注射物粘度、注射速度和动物种属。皮下给药：该途径经常使用。吸收的速度和程度取决于制剂。腹腔内给药：多次给药研究时较少用到该途径，因为可能会出现并发症。该途径存在着注射入肠道的可能，而且刺激性物质可能引起腹膜炎。化合物以混悬液形式给予后在腹腔的吸收取决于药物粒子及赋型剂的特征，药物可能被吸收进行全身或局部循环。肌肉内注射：肌肉内注射可能会引起疼痛，因为注射时必须使肌纤维处于紧张状态。必须对注射部位进行选择以尽量减少神经损伤的可能性。多次给药研究不应在同一个部位反复注射。当吸收速度很重要时，必须在水性和油性制剂之间加以选择(油性制剂在注射部位的残留很可能超过24小时。)。进行多剂量研究时，有必要考虑到出现炎症及其后遗症。静脉内给药：对于该途径，必须区分团注、缓慢静脉内注射和静脉内输液。表1中的数据与团注和缓慢静脉内注射有关。(i)团注：在大多数采用静脉内给药途径的研究中，受试物在大约1min内快速给予。如此相对迅速的注射要求受试物与血液之间具有相容性且粘度不能太高。当需要给予较大的体积时，注射原料必须加热至与体温相同。在静脉内给药中注射速度是一个重要因素，建议对于啮齿类动物而言，注射速度不应超过3ml/min。犬经静脉内快速注射6ml/kg生理盐溶液后未发现红细胞压积或心率变化，但快速注射20ml/kg后血液被稀释了15%且出现一过性心动过速(一分钟内心率增加达46%)。(ii)缓慢静脉内注射：因为化合物预期的临床适应症或限制性因素如溶解性或刺激性，因此可能有必要考虑通过缓慢静脉内注射给药。特别需加以说明的是缓慢静脉内注射会应用不同的技巧以尽可能地避免原料被注射入血管外组织。对于注射过程为5–10min的缓慢静脉内注射而言，可能需要采用标准的或蝶形针，或浅静脉内注射(适用于短期静脉内注射)时使用静脉内套管并用胶带固定更佳，或在使用前通过外科手术放置注射针(适用于更长时间的注射或多次注射)。已有证据表明大鼠每日可以1ml/min的速度静脉内注射等渗盐溶液剂量达80ml/kg，共4天，没有明显不适症状或肺部损伤。但是，当注射时间增加至30天时，给药速度为0.25、0.5或1.0ml/min的大鼠肺部损伤的发生率和严重程度均增加。在用药早期可能出现不良反应，但是在这么短的时间内不会有病理变化出现。(iii)连续输液：出于溶解性或临床适应症这一类似原因，有必要考虑连续输液，如果长时间输液则必须进行周详的考虑。给药体积和速度取决于所给物质并应考虑液体治疗规范。作为一个指南，单次给药情况下的给药体积占循环血容积的10%时，给药时间应不低于2小时。有关循环血容积的信息见表3。长时间输液应考虑如何尽量减少动物的不适，这是一个关键因素。输液的总持续时间亦是一个应该考虑的因素。表2给出了推荐的间断性(4小时/天)和持续性(24小时)输液的给药速度和体积(需要进一步的数据来完善此表)。家兔的给药体积和速度基于来源于胚胎毒性研究的数据，该研究表明对胎儿没有影响，但当给药剂量>2ml/kg/h时，母体出现血管周粒细胞成袖口状聚集以及增殖性心内膜炎。大鼠的典型输液速度在1–4ml/kg/h，但在胚胎毒性研究中的理想速度应不超过2ml/kg/h。对于小鼠、犬和恒河猴以及小型猪(未公开数据)的数据基于为期1个月的重复给药研究。在四篇出版物中突出了其它表示高给药体积时的赋型剂剂型的重要性的有限数据。这些数据表明对于静脉内输液的可耐受体积方面存在着巨大差异，取决于所使用的赋型剂。尚未研究对其它生理系统的长期影响。皮内给药：该部位给药主要用于评估免疫、炎症或过敏反应。原料可以用佐剂配制。给药体积为0.05–0.1ml，取决于皮肤厚度。用于给药的赋型剂在所有动物研究中，赋型剂的选择均是一个重要的考虑因素。赋型剂本身应该给药物提供最佳的暴露量而不应影响受试化合物的试验结果，由此一个理想的赋型剂应该无生物活性，对化合物的生物物理特性没有影响且对动物没有毒性作用。如果赋型剂的成分之一具有生物学效应，则应该限制该赋型剂剂量，如此就能够尽可能地减弱该赋型剂的这些效应或不会产生效应。给予化合物时所使用的简单赋型剂包括等渗性水溶液、缓冲溶液、助溶系统、混悬液和油溶液。对于非水性注射液，再次给药前应考虑药物的吸收时间。当给予混悬液时，应考虑原料的粘度、pH和等渗性。使用助溶剂系统必须小心，因为赋型剂本身具有剂量限制性毒性。鼓励实验室根据开展的动物研究以及受试物特征来发展新的策略以促进最佳赋型剂的选择。良好采血的规范指南引言采血为在实验动物中执行的最常规程序之一，在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW联合工作组的第一次报告中总结了实验哺乳动物和禽类的采血方法。该当前文章的目的在于根据可利用的最新信息提供一个易于使用的指南，并着重于毒代动力学以及毒理学(药代动力学)研究的需要。从各种啮齿类动物的眶后静脉丛采血的方法仍然被广泛使用，因为采用该方法会出现遗症，因此描述了一种建议的替代途径。循环血容量采血量根据准确的循环血容量数据计算。文献综述表明应考虑到这些数据的变异情况，可能与使用的技术、品系和动物性别等有关。引用最多的技术为同位素标记性红细胞、同位素标记性转铁蛋白、同位素标记性血清白蛋白、标记用染料、酶稀释法、光纤和右旋糖苷-70。表3给出了在安全性评价研究中普遍使用的动物种属的循环血容量。此处总结了在毒理学研究中使用得日渐频繁的绒猴和小型猪的数据。显示的数据根据不同来源并假定动物为成熟、健康并且营养充足的数据综合而成。采血体积我们推荐的数据基于公开的研究结果，最近开展的研究以告知工作组有关某些问题的数据和正在被提交以供公开的数据以及来源于内部标准操作程序的信息。当采血量接近极限时动物福利为首要考虑的问题，但亦必须考虑动物的生理反应与科学性之间的冲突，因为这可能影响数据的阐释和有效性。在可疑的情况下，监察员或兽医应在采血前对动物表现出来的临床症状进行评估。Scipioni等的工作表明24小时内大鼠的取血量达其总血容量的40%并重复取血2周后总体上不会引起致病性效应。基本上只有少量有关取血后动物健康的临界特征的数据，如心率、呼吸特征、各种激素水平以及行为特征如活动和移动自身所花的时间。所有这些均可能由于过度取血而出现变化，但研究这些变化需要耗费相当多的精力和资源。然而，血液学指标很易通过一个小型的研究来测定，采集不同体积的血量后，测定了动物的红细胞数量(RBC)、血红蛋白水平(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞容量(MCV)和红细胞分布宽度(RDW)。在24小时内的取血体积占体重大约为250g的雄性和雌性SD大鼠(n=7)的循环血容量的7.5%、10%、15%和20%(按0.3-ml等分)以模拟动力学研究。随后对动物进行追踪观察，总共29天。结果表明所有这些指标恢复到基线水平所花的时间存在相当大的差异，其中取血时间占循环血容量的15%和20%的动物组中的某些指标(MCV,RDW)在29天后未能恢复到基线水平。此处推荐的针对多次采血的恢复时间是指所有采血组中的大鼠恢复到正常水平(每只大鼠的初始水平加减10%)所耗的时间。推荐单次采血(如常规毒性研究要求如此)的体积不应超过循环血容量的15%，因为如果采血过快可能引起失血性休克。多次少量采血不大可能产生类似的急性效应。表4反映了极限体积和足够的恢复期并且考虑了多次采血后的应激性，整体严重性评估中的其它过程除外。该表着重于单次和多次采血体系。建议对毒性研究动物给予额外的恢复时间，因为在此类研究中必须严格评价血液学指标。计划采用较高的体积(占循环血容量的20%)以利于毒代或药代动力学的连续性采血，此处通常要求多次、少量取样。但是，应该记住如此大体积采血对血液动力学的重大影响，可能影响半衰期的计算。如果最后一次采样在处死动物的24小时内则有可能对终末半衰期进行评估。这些数据不包括最后一个样本，该样本为当动物最终被麻醉时能够被采集的一个样本。未考虑使用血液代用品，因为在推荐的采血体积下不允许使用此类人为干预。采用表4中的数据得到不会明显干扰动物正常生理的采血体积的简易参考指南，见表5。采血部位静脉穿刺和静脉切开的部位主要考虑用于啮齿类动物和家兔。根据采血程序的技术进展对该信息进行了总结；每种种属的采血部位的优势和缺点见表6，重复采样的推荐部位总结于表7。值得注意的是从不同部位采集的样品在临床病理数据方面可能有所不同，且对历史数据库有影响。对于更加传统的采血途径，可从标准文献中找到方法学描述。但是，对需要特别提及的其它方法综述如下。跗外侧静脉(隐静脉)：该技术已经在许多实验动物中应用，包括大鼠、小鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠、雪貂、水貂以及体型较大的动物，可以采集占循环血容量5%的血量。该方法不要求麻醉，因此特别适用于重复采血，如药代动力学研究。隐静脉在跗骨关节的旁边，当刮去被毛并用酒精擦拭后很容易看见。将动物置于合适的固定器上，比如塑料试管，操作者分开动物的后肢。在关节上轻轻施压则该静脉凸起，然后采用能够满足快速取血而不会引起溶血的最小号的针头刺入血管(如25–27G针头适用于大鼠和小鼠)。对少量采血而言，可以采用简单的刺伤从而在刺伤部位快速形成血滴，此时可使用微量血细胞比容试管收集标准体积的血液。采血后，在刺伤部位施加足够的压力以止血。剥去结痂可连续取血。除顽固性(很少)出血外，目前看来没有并发症报道，该方法的优势在于不需麻醉。即使没有根据体重增长、昼夜活动规律、行为等进行过有关动物福利的研究，但看来该途径不大可能严重影响动物的健康。耳缘静脉/耳中央动脉：从耳缘静脉采血最常用于家兔和豚鼠。该途径也可在小型猪中选用，通常与静脉内套管结合使用。必须进行良好的固定，在采血前大约20–30分钟应用局麻膏剂有助于防止针头穿透皮肤时动物头部出现摇摆。也可用凡士林涂在静脉的表面，然后刺破静脉用试管收集血液。如果取血量较大，则可通过家兔耳中央动脉取血，但取后必须按压至少2分钟以止血和防止血肿。持续性放血5和10分钟后应对动物进行检查。使用留置套管能够重复从该动脉采血，因此有利于超过8小时的动力学研究。舌下静脉：该操作在啮齿类动物如大鼠中易于进行且适合于较大体积(如0.2–1ml)的频繁性采血，仅受限于采血体积和必要的重复性麻醉。一种简化的方法避免了以前的方法中所见到的缺点且能够用于重复性采血。大鼠麻醉后，由助手握持住大鼠，使其处于仰卧位。聚拢颈背部松弛皮肤以便部分阻塞静脉血从头部回流。第二名操作者用顶端被棉花包裹的涂抹棒轻轻拉出舌头，用拇指和食指抓住舌头，用23–25G皮下注射针头刺破舌下静脉之一(中线的左右侧各有一根舌下静脉)，尽可能靠近舌尖。将大鼠翻转以便于血液流入试管中，采集到需要量的血后，松开施加在后颈部的压力，将动物置于仰卧位。再次将舌头拉出用顶端被干棉花包裹的涂抹棒止血；通常没有必要使用任何抗凝剂。采用该技术，大鼠在摄食和饮水或体重增长方面与未采血的麻醉对照动物相比没有明显差异。此外，该法较眼球后采血所引起的病理变化更少。但是，麻醉可能仍然是一个限制性因素。尾侧静脉：原则上该途径与跗外侧静脉相似，但倾向于获得较小的采血量(小鼠0.1–0.15ml；处于暖和条件下的大鼠最高可达2ml)。可以通过注射器/针头或刺穿尾侧静脉采血。由于勿需麻醉，这使得该途径特别适用于重复采血。有必要使血管扩张以促进血流，可以将动物暴露于37°C的温度中共5–8min或加热尾部。该方法损伤很小，基本不会影响动物健康，但在加热时必须严密监测动物的不适症状。颅大静脉：小型猪可以用绳套固定或将其前肢后缩固定于其背部。农业上有时采用的其它方法(捆绑嘴部、捆绑猪躯干、通过后肢悬吊)会引起动物紧张，因此不适用于实验动物，因为会对研究的科学性产生潜在的不利影响。为避免损伤迷走神经，应将针头插入颈部右侧，胸骨柄旁，以30–45°角向左肩方向进针。当针头进入血管的时候通过取样器可以觉察到破裂的感觉，然后可以轻易地采集到血样。该方法亦被用来作连续性静脉穿刺，但抽出针头后穿刺部位形成血肿，因此在不要求每周频繁采血的情况下，该方法为一种最佳候选程序。尾尖切断术(断尾法):该技术通常用于大鼠和小鼠，采血量为0.1–0.2ml。切断术应仅限于尾尖(每次0.5–1mm应当足够，随试验需要最多只能切除5mm)，通过去除血凝块可在短期内重复采血。可明显缩短尾部(如＞5mm)的连续性切断术不能被接受。该技术不适合老龄动物。建议对动物进行麻醉。心脏穿刺：该方法通常在麻醉条件下进行，在过去由于缺乏替代途径，因此被用于对小型啮齿类动物采血。但是，现在有其它方法可供利用，并且由于潜在性疼痛和致命性后遗症，如心包出血以及心脏压塞，因此该技术应仅用于末期采血。眼球后静脉丛：研究者过去普遍采用眼球后采血途径，但会引起的不良反应。因为这些不良反应及其潜在的严重性，因此该方法所涉及到的利害关系正日渐突出。但是，最近已开发出其它符合科学性要求的方法，由此改善了动物福利。然而，技术小组感到在新方法的上下文中应详细回顾眼球后采血的优势和缺点。对于所有种属的静脉丛采血均应该在常规麻醉条件下进行，在某些国际注册中要求对动物进行麻醉。大量工作者对该方法均进行了详尽的描述。仅有少量有关简化该方法的研究工作被公开。作为穿透结膜的最佳方法以尽量减轻组织损伤的途径(从腹侧、背侧和上方进入大鼠眼球)已有所讨论。在同一部位的两次采血之间必须有2周间隔期以使损伤组织可以在大多数情况下恢复，但这并不意味着动物在完全恢复前的早期不会经历某些不适。然而某些研究已表明重复眼窝采血不会长期影响动物的昼夜节律或眼窝组织结构(如这两篇文献中的研究均表明任何组织损伤均痊愈)，其它研究发现了组织变化、异常临床表现和明显不适，从而出现人道立场不得不处死动物从而给研究工作带来损失。该方法还存在其它严重的潜在性不良反应：(i)引起血肿和眼压过高的眼球后出血，必定会使动物感到疼痛；(ii)任何为止血而施加的压力(如压迫眼部)或来源于血肿的压力均能导致角膜溃疡、角膜炎、角膜翳形成、眼球破裂和小眼畸形；(iii)视神经和其它眼窝内结构损伤可导致视力降低甚至失明；(iv)毛细管引起眼眶脆骨骨折和神经损伤；伴玻璃体液丢失的眼球自身穿通伤。许多这些位于眼窝深处的有害后遗症可能仍然未被发现。有害副作用的发生率差异似乎介于1%和2%之间，但出于所采用的技术不同，该发生率可能远高于此，即使是经验丰富的实验操作人员(见参考文献55中的表1)。穿刺频率尽量减少穿刺次数从而取得良好的科学性数据这一点非常重要。不应使用同一穿刺部位，如沿着静脉采用不同的穿刺点。套管对于重复取血而言这是一项非常重要的技术。在短期(工作日)采血中可使用临时性套管如蝶形针和套管针，然而对于长期取血而言，有必要通过外科手术植入生物排斥性套管。这些方法允许重复采血，且尽量减轻了动物的痛苦和不适。也可利用皮下静脉输液港的作用，植入该装置的动物可与其同类呆在一起，但应该强调的是，该方法存在如下大量潜在性问题：(i)外科手术技巧为基本要求，必须在无菌条件下进行以使动物长期性保持良好的状态及避免并发症如感染。血凝块频繁出现并可能影响采血和延长药物的输液时间；(ii)可能有必要固定动物或单独饲养以防止套管脱落或引起刺痛，这就是在长期采血中首选套管法的原因；(iii)长期植入套管后，可出现血管渗透且动物亦可能因此沿植入的套管而长出自身的套管。麻醉在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW的首次报告中给出了某些关于不同的麻醉对脾被膜(有该组织存在的情况下)肌细胞的影响程度的评论以及其它有助于采血的方法。对于小型实验室哺乳动物的采血，值得注意的是联用芬太尼和氟阿尼酮(麻醉药Hypnorm)加或不加咪达唑伦(镇静药Hypnovel)在所有种属中均明显引起外周血管扩张。尽管这有利于采血，但亦更容易出现采血后血肿，因此应特别注意止血。应考虑使用局麻药。结论和建议对所有动物种属的采血现在均有一定的替代性方法，特别是较小的啮齿类动物，而在过去不易做到。此外，某些方法需要麻醉或有害副作用的发生率较高，可能严重影响动物的福利，特别是要求重复取血时。因此我们提出如下建议：(i)推荐的对所有啮齿类动物采血的途径为尾侧静脉、舌下静脉和跗外侧静脉，家兔采用耳缘静脉、耳中央动脉和颈静脉；(ii)眼球后采血并恢复仅适用于无法采用其它途径时；(iii)心脏采血仅作为终末处死动物时在麻醉条件下进行。最后，我们想强调的是在所有与动物有关的实验过程中，加强培训和人员的能力对于成功采血、最小化组织损伤以及对于动物的健康和福利是至关重要的。参考文献表1符合良好规范的给药体积(以及可能的最大给药体积)a 种属 给药途径和体积(ml/kg-1) 经口 皮下 腹腔 肌肉 静脉内(团注) 静脉内(缓慢注射) 小鼠 10(50) 10(40) 20(80) 0.05b(0.1)b 5 (25) 大鼠 10(40) 5(10) 10(20) 0.1b(0.2)b 5 (20) 家兔 10(15) 1(2) 5(20) 0.25(0.5) 2 (10) 犬 5(15) 1(2) 1(20) 0.25(0.5) 2.5 (5) 短尾猴 5(15) 2(5) c(10) 0.25(0.5) 2 c 绒猴 10(15) 2(5) c(20) 0.25(0.5) 2.5 (10) 小型猪 10(15) 1(2) 1(20) 0.25(0.5) 2.5 (5)a：对于非水性注射液，在再次给药前应考虑吸收时间。每日所使用的肌肉注射部位应不超过两个。皮下注射部位不包括给予弗氏佐剂。b：每个部位的注射体积以毫升表示。C：无可用数据。表2.重复静脉内输液:给药体积/速度(以及可能的最大给药体积/速度)a 每日输液时间 小鼠 大鼠 家兔b 犬 短尾猴 小型猪 每日总体积(ml/kg) 4小时 Lc 20 Lc 20 Lc Lc 24小时 96(192) 60(96) 24(72) 24(96) 60 24 速度(ml/kg/h) 4小时 Lc 5 Lc 5 Lc Lc 24小时 4(8) 2.5(4) 1(3) 1(4) 2.5 1a：非水性注射液见正文。某些情况下显示了两套数据。括号内的数据为可能的最大值。b：基于致畸性研究。c：无可用数据。表3实验动物的循环血容量 种属 血容量(ml/kg) 推荐的平均值a 平均值范围 小鼠 72 63-80 大鼠 64 58-70 家兔 56 44-70 犬(Beagle) 85 79-90 短尾猴(恒河猴) 56 44-67 短尾猴(猕猴) 65 55-75 绒猴 70 58-82 小型猪 65 61-68a：推荐的平均值相当于平均值范围中的中间值。表4体积限度和恢复期 单次采血(如毒性研究) 多次采血(如毒性研究) 采血量占循环血容量百分比(%) 大致恢复期 24小时内采血量占循环血容量百分比(%) 大致恢复期 7.5% 1周 7.5% 1周 10% 2周 10–15% 2周 15% 4周 20% 3周表5指定体重种属的总血容量和推荐的最大采血量 种属(体重) 血容量(ml) 7.5%(ml) 10%(ml) 15%(ml) 20%(ml) 小鼠(25g) 1.8 0.1 0.2 0.3 0.4 大鼠(250g) 16 1.2 1.6 2.4 3.2 家兔(4kg) 224 17 22 34 45 犬(10kg) 850 64 85 127 170 短尾猴(恒河猴)(5kg) 280 21 28 42 56 短尾猴(猕猴)(5kg) 325 24 32 49 65 绒猴(350g) 25 2.0 2.5 3.5 5 小型猪(15kg) 975 73 98 146 195表6不同采血方法的优点和缺点总结 采血途径 普通麻醉 组织损伤a 重复采血 体积 种属 颈静脉 否 低 是  大鼠、犬、家兔 头静脉 否 低 是  短尾猴、犬 隐静脉/跗外侧静脉 否 低 是 () 小鼠/大鼠、绒猴/短尾猴、犬 耳缘静脉 否(局麻) 低 是  家兔、小型猪 股静脉 否 低 是  绒猴/短尾猴 舌下静脉 是 低 是  大鼠 尾侧静脉 否 低 是 () 大鼠、小鼠/绒猴 耳中央动脉 否(局麻) 低 是  家兔 颅大静脉 否 低 是  小型猪 尾尖切断术(1–3mm) 是 中度 受限  小鼠/大鼠 眼球后静脉丛 是 中度/高 是  小鼠/大鼠 心脏b 是 中度 否  小鼠/大鼠/家兔a：组织损伤的可能性基于其可能的发生率以及任何后遗症的严重程度，如炎症反应或组织学损伤b：仅在最终处死动物时于麻醉条件下进行。表7推荐的重复采血部位 种属 推荐部位 小鼠 隐静脉、尾侧静脉 大鼠 隐静脉、尾侧静脉、舌下静脉 家兔 耳缘静脉、耳中央动脉、颈静脉 犬 头静脉、颈静脉、隐静脉 短尾猴 头静脉、隐静脉、股静脉 绒猴 股静脉、隐静脉 小型猪 颅大静脉