结构生物学复习

结构生物学复习•生物大分子要发挥功能，必须满足两个条件：第一，凡要发挥功能和活性的生物大分子必须具有特定的，自身特有，相对稳定的三级结构；第二，结构运动。任何的破坏促使没有稳定的三级结构和结构运动，生物大分子是很难发挥生物功能或活性的。3生物大分子（蛋白质、核酸、脂类、糖类）我国第一个蛋白质晶体结构----猪胰岛素晶体结构的测定第一完成单位：生物物理研究所获奖奖种：国家自然科学奖获奖时间：1982获奖等级：2内容简介：60年代初肌红蛋白和血红蛋白晶体结构的测定，标志着一个新的研究领域——蛋白质晶体学的诞生。1969年初，北京胰岛素晶体结构研究组正式成立，生物物理研究所作为北京胰岛素晶体结构研究组的主要成员之一，参加了我国第一个生物大分子晶体结构的测定。经过三年的艰苦努力，确定了2.5埃分辨率的三方二锌猪胰岛素的晶体结构。这一成果使我国正式跨入了国际蛋白质晶体学的研究行列。经过继续努力，于1973年进一步获得了1.8埃分辨率的晶体结构，该成果荣获1978年全国科学大会奖和1982年国家自然科学二等奖，也是当时亚洲地区第一个蛋白质晶体结构，国际上少数几个高分辨率晶体结构之一。4直接测定蛋白质三维结构的三种结构生物学主要研究方法的比较1)X-射线晶体学优点：分辨率高，测定分子大；缺点：需要制备单晶，有相位问题2)核磁共振波谱学••优点：溶液构象，无相位问题；缺点：限于较小的蛋白质分子（目前MW<40kDa）3)电镜三维重构优点：不需大单晶，无相位问题；缺点：目前分辨率尚不如前二者高•5X射线晶体结构分析：使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。••6X射线：是由于原子中的电子在能量相差悬殊的两个能级之间的跃迁而产生的粒子流，是波长介于紫外线和γ射线之间的电磁辐射。•X射线衍射原理1912年劳埃等人根据理论预见，并用实验证实了X射线与晶体相遇时能发生衍射现象，证明了X射线具有电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个里程碑。当一束单色X射线入射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这些规则排列的原子间距离与入射X射线波长有X射线衍射分析相同数量级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射，衍射线在空间分布的方位和强度，与晶体结构密切相关，每种晶体所产的衍射花样都反映出该晶体内部的原子分配规律。这就是X射线衍射的基本原理。7X-射线晶体衍射法（蛋白质晶体学）蛋白质样品准备(Samplepreparation)蛋白质晶体培养(Growcrystals)X射线晶体衍射数据收集(CollectX-raydiffractiondata)晶体数据解析和分析(测定相位Estimatephasesforthediffractionpattern，电子密度图的计算和解释Estimatephasesforthediffractionpattern，结构模型的构建和修正Buildanatomicmodelandrefinethemodel)••••910蛋白质纯品制约瓶颈2)如何解决晶体衍射相位问题？制约瓶颈1)如何培养晶体？蛋白质晶体结构测定蛋白质样品的来源蛋白质分离纯化11天然蛋白质基因达产物适于晶体生长的蛋白质样品的蛋白样品的纯度(Purityoftheproteinsample)高，一般大于95%.蛋白样品的均一性(Samplehomogeneity)高，要求化学组成和分子构象均一.蛋白样品的浓度和储存溶液(Proteinconcentrationandstartingbuffer).：一般筛晶体的蛋白浓度为5-20mg/ml，盐浓度较低，保存在使蛋白稳定的溶液中。12蛋白样品的纯度＞95%PictureofSDSGel(illustration).Differentamountsofproteinsampleareloadedonthegelto1.2.3.4.checkforcontaminantsanddegradationproducts.MarkerLargeamountisloaded,contaminantsarevisible.Normalamountisloaded,proteinlookspure.Lowamountisloaded,degradationproductisvisible.13蛋白样品的均一性动态光散射(DLS)凝胶层析柱native-page电泳胶蛋白样品的浓度和储存溶液一般筛晶体的蛋白浓度为5-20mg/ml.存储蛋白的缓冲液浓度低于外液中的缓冲液浓度盐浓度尽量低4度和-80度分装保存并检测其稳定性★点晶体前将蛋白浓度进行离心或过滤15蛋白表达系统有哪几种？1.原核表达系统2.酵母表达系统3.昆虫表达系统4.哺乳表达系统••••1617原核表达系统的优缺点原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。代表：大肠杆菌表达系统。优点：遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单缺点：蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。酵母表达系统的优缺点代表：甲醇毕赤酵母优点：表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不可控183.昆虫表达系统•昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式，其表达的蛋白水平高达1~-500mg/L，但受到诸多因素的限制和影响，如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等。杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群，是发现最早、研究最多且适用意义很大的昆虫病毒。杆状病毒系统的主要优点包括①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；②蛋白翻译后的加工修饰；③表达水平高；④可容纳大分子的插入片段；⑤能同时表达多个基因。••主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。•194.哺乳动物表达系统•哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。•优点：蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性。缺点：表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。20总之，各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。•因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性，权衡利弊后在研究工作积累和实践探索的基础上，做出谨慎的判断和选择。•21层析技术根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离•IonExchange(IEX)－离子交换–电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化，根据等电点来选择•SizeExclusion(SEC)－分子筛（或凝胶过滤）–分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化•Affinity(AC)－亲和–生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化•HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相–疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖•CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羟基磷灰石–独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化22对于已知pI的物质：在高于其等电点的pH，用阴离子交换剂；在低于其等电点的pH，用阳离子交换剂。•23蛋白质的含量测定24蛋白质的含量测定目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总•蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford•（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。25261）.基于蛋白质的元素组成特点：凯氏定氮法•含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。•27282）.Lowry法1951年Lowry在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立原理：第一步反应：在碱性溶液中蛋白与Cu2+反应形成紫红色的络合物；第二步反应：酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）与蛋白质芳香族氨基酸反应呈深蓝色。••2930优点：同时分析多个样品，简便；灵敏度提高；避免酚试剂局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白质含量测定偏差。缺点：要求溶液完全溶解透明；酚试剂在碱性溶液中稳定性差，导致测定误差；反应受多种物质干扰。••313）.Bradford法由Bradford等人于1976年建立。基本原理：考马斯亮蓝G-250在一定条件下可与蛋白质结合，导致其颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从465nm移至595nm，其吸收度与蛋白质浓度成正比。目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒。32•••优缺点优点：•①操作简便，配合酶标仪，可同时测定多个样品；②③可测定低达25g/ml的蛋白质样品；对干扰剂不敏感；缺点：染料主要结合蛋白质的疏水区，因此不同组成的蛋白质与染料的结合比例不同。•334）BCA（二喹啉甲酸）法原理：第一步，在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+反应形成复合物；第二步，BCA试剂与该复合物反应，生成深紫色化合物，在562nm处有吸收峰。•优点：操作简便，线性范围20～2000有试剂盒出售。g/ml；•345）.紫外分光光度法原理：蛋白质中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽键在215nm附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸收度，计算蛋白质浓度。•C＝A/KL，其中A为吸光度，K为摩尔消光系数，L为光程。•K值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。•35优缺点优点：①操作简便，且敏感度高•（20g/ml）②样品不损失，测定后可继续使用。缺点：•①核酸可干扰测定结果；②不同蛋白质芳香族氨基酸含量变动较大。36蛋白质分子量的测定37SDS-PAGE测定分子量基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，•并按一定比例（1g蛋白质结合1.4gSDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。＝q/f＝q/6r，所有蛋白质的迁移率都相同。••38在SDS-PAGE中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移394041凝胶过滤层析法测定分子量蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：•Mr＝K1－K2Velg在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，•Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的并以它们的lgVe，即可从图中得到样品的分子量。42凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；••在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。•43SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的例如：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kDSDS-PAGE（不加还原剂）结果：45kDSDS-PAGE（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD）则结论是：该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。44质谱法是最精确的分子量测定方法质谱（MassSpectrometry，MS）是带电原•子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。•45晶体的定义“由原子（或离子、分子）在空间周期排列构成的固体物质。注意：（1）一种物质是否是晶体是由其内部结构决定的，而非由外观判断；（2）周期性是晶体结构最基本的特征。47”晶体的基本性质1、内部结构周期性2、对称性3、均一性4、各向异性5、自范性（自限性）6、最小内能性7、稳定性8、固定熔点9、晶面角守恒定律10、使X射线产生衍射48结晶状态是热力学稳定的状态，在一定的外界条件下，结晶状态不可能自发地转变为其他的物理状态•4950蛋白质结晶原理施加引起蛋白质溶液饱和度变化的因素清澈的蛋白质溶液↓饱和溶液↓过饱和溶液↓发生沉淀↓蛋白质的无定形沉淀当满足“适当的”条件，蛋白质就有可能以晶体形式从溶液中析出。51结晶相图在亚稳态区不能自发形成晶体3421饱和曲线晶体可能出现的区域？蛋白质晶体内部结构为三维周期有序重复排列，要求每个结晶重复单位(分子或其复合体)的化学组成与分子构象是均一的。YZXO待结晶的蛋白质分子或复合体蛋白结晶液52蛋白质晶体生长过程蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。结晶的基本过程包括：•1.促使过饱和2.促使行核3.晶核长大53影响结晶的因素蛋白质纯度沉淀剂溶解pH值缓冲系统蛋白质浓度有机溶剂盐类或离子去污剂温度其他（环境振动、重力、配体等）••••••••••54蛋白结晶常用沉淀剂最常用的三类沉淀剂：盐、有机溶剂、聚乙二醇（PEG）硫酸铵—离子型，可以用硫酸锂，还有磷酸钾、氯化钠、甲酸铵等，通过盐析作用沉淀生物大分子PEG聚乙二醇：极性分子，通过与水分子相互作用，使生物大分子达到饱和。PEG3350，PEG8000，PEG200，PEG400等有机溶剂：异丙醇，二甲基-2,4-戊二醇，丙酮••••55初始10-20mg/ml•••细胞色素C200mg/mlEV683CMpro3mg/ml57蛋白质浓度蛋白质在等电点附近有最小溶解度PH常用蛋白质结晶技术－－蛋白质溶液从清澈到浑浊的动态过程的实现X射线蛋白质晶体学从第一个蛋白质被结晶到现在，有许多种结晶方法和技术得到了发展和完善，例如静置法，透析法、变温法、扩散法、微重力条件下的结晶，凝胶中的结晶等等，而且随着研究的不断发展，将会有更多的结晶技术出现。在各种技术中，目前应用最广的是汽相扩散法，微量透析法和微量静置法。据不完全统计，现在由这三种方法培养出来的晶体数分别占蛋白质晶体总数的95％，5％和5％。58在起始状态时，结晶母液与外液之间存在某些“因素”的梯度差，随着汽相扩散的进行，这些梯度差发生变化。如果变化后的条件“合适”，母液中的蛋白质就蛋白质结晶母液有可能以晶体状态析出。X射线蛋白质晶体学坐滴(sittingdrop)汽相扩散法外液硅化的盖玻片悬滴(hangingdrop)汽相扩散法59经典的汽相扩散法的原理Resultsandwhatwemaydo•Cleardropafterweeks)concentrations（protein，precipitate）1)2)3)IncreaseLeaveitforseedingWait60Resultsandwhatwemaydo•Dustorgrowthbacteria1)Filterthesolutions2)AddNaN361Resultsandwhatwemaydo•Precipitates1)2)3)WaitDiscardHalftheconcentrations62Resultsandwhatwemaydo•Needle,plate,micro-shower,clusterCrystals1)Optimization2)Seeding63晶体的初步鉴定64小分子晶体蛋白质晶体边界完整，漂亮常不完整，易出现多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水不变化因脱水而变坏溶解性慢快偏光性强相对弱染色性弱强漂浮性下沉漂浮蛋白质晶体的初步鉴定和挑选1、刮擦法：在体视显微镜下用玻璃针或针尖刮擦晶体，蛋白质晶体很容易破碎成小碎片，而盐晶体则比较难。2、染色法：在母液中加入很少量的染料，如伊兹特晶体染色剂(Izitcrystaldye)，蛋白质晶体将被染为蓝色。3、偏振光法：用偏振光观察晶体，盐晶体会出现双折射现象，而蛋白质晶体不会。4.跑电泳：挑起晶体用母液多次洗涤后跑电泳，蛋白晶体有条带5.空白对照：同种沉淀剂条件下，若不加蛋白也能长出晶体表明有可能是盐晶6.脱水：蛋白晶体含水量高，脱水后变形变坏，盐晶则影响不大。65微观接种:将一颗晶体破碎成无数小晶核后接种到新的液滴中X射线蛋白质晶体学66宏观接种:是指将一颗肉眼可见的晶体接种到新的液滴中。蛋白质晶体生长的接种法（seeding）复合物晶体生长方法共晶法浸泡法••67X射线蛋白质晶体学为了研究蛋白质与其大分子配体的相互识别与作用的机理（例如：研究蛋白质－DNA相互作用、抗原抗体相互作用、蛋白质－结合蛋白的相互作用等等），通常利用共晶法制备二者复合物的晶体。实践经验表明，共晶法制备复合物晶体对配体之间的亲和力的要求并不是很高。+‖共晶(co-crystallizing)68蛋白质晶体生长的共晶法(co-crystallizing)浸泡法可能的用途：为了研究蛋白质与其小分子配体(包括底物类似物、活性抑制剂等)的作用机理，利用浸泡法制备二者复合物的晶体。传统上，为了解决晶体衍射相位问题的需要，可以利用浸泡法制备蛋白质晶体的重原子衍生物。X射线蛋白质晶体学69蛋白-蛋白复合物晶体不能运用浸泡法作为浸泡法原理的扩展，可以将生物大分子晶体“浸泡”在含有重原子的高压气体中。生物大分子晶体蛋白质晶体生长的浸泡法(soaking)含有小分子配体的溶液X射线蛋白质晶体学71同一种蛋白质可以在不同条件下生长成不同晶型的晶体；可以在不同的条件培养出同一种晶型的蛋白质晶体。72X射线蛋白X-rays质晶体学X-rays液氮气流维持冷冻状态液氮低温冷冻使用相对不便，成本偏高。但是，由于无玻璃毛细管使得吸收效应大大减少，而且晶体的低温冷冻状态使其耐辐射能力大大增加，有可能加大曝光时间并收集尽可能多的衍射画面。密封的薄壁玻璃毛细管残留的结晶母液室温使用比较方便，成本较低。但是，由于封装晶体的玻璃毛细管以及残留的结晶母液对X射线的吸收，使得衍射强度的测量误差较大。选择晶体的安装方式－－室温或者液氮低温冷冻X-ray是由高速运动着的(带电或不带电)粒子与某种物质相撞击后突然减速，且与该物质中的内层电子相作用而产生的。X-ray的产生需要有几个基本条件：1.产生并发射自由电子2.迫使自由电子作定向高速运动。3.在电子运动的路径上设置使其减速的障碍物。73常用的X射线发生方法TheX-raygeneratorinthehomelaboratory1）封闭的X射线管（SealedX-rayTube）2）旋转阳极X射线管（RotatingAnodeX-rayTube）3）同步辐射（SynchrotronRadiation）装置7475同步辐射：synchrotronradiation，带电粒子在电磁•场的作用下沿弯转轨道行进时所发出的电磁辐射当速度接近光速的带电粒子在磁场中加速和改变运动方向时，发射出的强电磁波。•同步辐射光优点：1）强度高光的强度比旋转靶高102-106倍，光子能量高达6-40kev。这样极大的缩短了收集晶体衍射数据的时间，记录一副静止或回摆衍射画面，所需时间仅以秒计。并且极大的提高了蛋白质结构测定的分辨率，可接近原子分辨率0.12nm或更好。真正的可实现微小晶体的分析。762）发散度小发散度只有零点几毫弧度，而普通X射线为几度，因而通过准直器后强度损失少，而且对晶体的损伤小，晶体衍射点锐利，不弥散。尤其适合于晶胞大的晶体结构测定同步辐射光优点：3）波长可调同步辐射X射线，为无特征光的白色射线，可调范围在0.1-0.3nm，甚至可获得更短的小于0.1nm的X射线。即可满足多波长反常散射实验和劳厄衍射研究的需要784）脉冲时间结构由于同步辐射是以束团形式发射，因而具有脉冲时间结构。脉冲时间为10-12s数量级，两脉冲时间的时间间隔为10-8s，因而可以用来研究生物大分子在10-6-10-12s时间间隔内的构象变化，开展时间分辨晶体学研究。铅屏X射线管底片晶体晶体可看作三维立体光栅根据劳厄斑点的分布可算出晶面间距掌握晶体点阵结构80劳厄斑点点阵将晶体中的每个结构基元抽象成一个点，将这些点按晶体周期性重复的方式排列，就构成点阵点阵点将这些微粒抽象为几何点，称为点阵点结构基元点阵点所代表的具体内容称为结构基元•••81对于实际的三维晶体，将其恰当地划分成一个个完全等同的平行六面体，叫晶胞。它代表了晶体结构的基本重复单位。整个晶体就是晶胞在三维空间周期性地重复排列堆砌而成.晶胞对应于正当格子只有7种形状.一定是平行六面体.82(2)晶胞晶胞知识要点晶胞一定是一个平行六面体，其三边长度a,b,c不一定相等，也不一定垂直。•划分晶胞要遵循2个原则：一是尽可能反映晶体内结构的对称性；二是尽可能小。整个晶体就是由晶胞周期性的在三维空间并置堆砌而成的。83晶胞的划分晶系对称性正当晶胞•素晶胞：含1个结构基元正当晶胞复晶胞：含2个以上结构基元84它有哪些特征，怎样描述这些特征呢？85晶胞的大小和形状用晶胞参数来表示晶胞晶胞中各原子的坐标位置用分数坐标来表示晶胞：能够反映晶体结构对称性的基本重复单元。lattice：Bravais1.简单三斜aP2.3.简单单斜mP底心单斜mC(mA,mB)4.5.简单正交oPC心正交oC(oA.oB)体心正交oI面心正交oF6.7.868.R心六方hR9.棱方hP10.简单四方tP11.体心四方tI12.简单立方cP13.体心立方cI14.面心立方cF•可以发现，除了在正交晶系中四类晶胞可同时出现外，在其他晶系中由于受到对称性的限制或是不同类型阵点可相互转换的缘故，都不能同时出现。如：立方晶系中，底心点阵与该晶系的对称性不符（在4个按立方体对角线排列的方向上有87三重轴），所以不能存在。其一：有些晶系的特征对称元素不允许加点.其二：有些晶系的面心或底心加点后可以划分为体积更小的对称性不变的平行六面体单位88例如：四方底心可划为四方简单四方面心可划为四方体心例如:立方晶系不可能存在底心点阵,否则,与4×3的要求不符.七大晶系（Thecrystalsystems）晶胞参数约束条件晶系(Crystalsystem)(Conditionsimposedoncellgeometry)三斜晶系(Triclinic)单斜晶系(Monoclinic)正交晶系(Orthorhombic)四方晶系(Tetragonal)三方晶系(Trigonal)OR六方晶系(Hexagonal)立方晶系(Cubic)无（None）≠≠＝＝＝＝＝≠≠≠≠＝≠＝＝＝90°，＞90°＝＝＝90°＝＝＝90°＝＝90°，＝120°＝＝≠90°＝＝90°，＝120°＝＝＝90°89aaaaaaabbbbbbbc,c,c,c,c,c,c,空间点阵类型晶系(Crystalsystem)(TheLatticeTypes)三斜晶系(Triclinic)P单斜晶系(Monoclinic)P，C正交晶系(Orthorhombic)P，I，F，C（A，B）四方晶系(Tetragonal)P，I三方晶系(Trigonal)P，R六方晶系(Hexagonal)P（与三方晶系的P相同）立方晶系(Cubic)P，I，F9014种空间点阵类型晶胞的二个要素晶胞的二个基本要素：一是晶胞大小和形状；二是晶胞中各原子坐标位置。晶胞大小和形状可用晶胞参数表示；晶胞中原子位置可用分数坐标表示。91对称元素的种类–旋转轴（n）–镜面（m）–对称中心（i）•–旋转反轴（n）微观对称元素–平移–滑移面–螺旋轴（ns）———————————————————————————–：第一类对称元素，不产生对映体–：第二类对称元素，产生对映体•92宏观对称元素93宏观对称元素的组合——32个结晶学点群宏观对称元素中任意几个可能同时存在于某一晶体的外形对称性中这些元素可以进行组合对称元素进行组合时必须遵循几个原则略满足这些原则的组合只能有32种即为32种对称类型称为32个结晶学点群生物大分子晶体不存在m和对称元素，只有11种点群,,32个点群的意义在于：不管晶体形状及多样性如何复杂,但它的宏观对称性必属于32个点群中的某一个,绝不会找不到它的对称类型.32个点群是研究晶体宏观对称性的依据,也是晶体宏观对称性可靠性的系统.微观对称元素平移：对称元素是轴线，动作是沿某轴线方向平移一定距离。晶体结构经过平移动作后结构复原滑移面：对称元素是一个面。动作是依靠面的反映和沿规定方向平移一定距离。螺旋轴：对称元素是一个轴，动作是首先绕轴旋转一个角度，接着沿轴方向平移一定距离。•••94组成蛋白质大分子的单个氨基酸有不对称碳原子，而蛋白分子中又只有L型氨基酸，因此蛋白质晶体的对称元素只有对称轴，•而没有m、i。这样230空间群，在蛋白质晶体中只有65种仅含对称轴的空间群。蛋白质晶体不可能存在的对称元素包括镜面对称中心旋转反轴:•95因此,按照对称性分类,晶体结构可分为：7种格子形状(晶系)14种空间点阵型式32个点群(宏观对称类型)230个空间群(微观对称类型)9665个空间群11个点群蛋白晶体空间群符号LS1S2S3•1.第一字母(L)是点阵描述符号，指明点阵带心类型：P,I，F，C，R。2.其于三个符号(S1S2S3)表示在特定方向（对每种晶系分别规定）上的对称元素。3.如果没有二义性可能，常用符号的省略形式用写成P1m1)。(如Pm，而不97运用以下规则，可以从对称元素获得H-M空间群符号。X射线在晶体中的衍射现象，实质上是大量的原子散射波互相干涉的结果。晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。概括地讲，一个衍射花样的特征，可以认为由两个方面的内容组成：一方面是衍射线在空间的分布规律,（称之为衍射几何），衍射线的分布规律是晶胞的大小、形状和位向决定另一方面是衍射线束的强度,衍射线的强度则取决于原子的品种和它们在晶胞中的位置。••X射线衍射理论所要解决的中心问题:在衍射现•象与晶体结构之间建立起定性和定量的关系。9899100稳定蛋白质构象的力101102研究一级结构需要阐明的内容包括：（1）蛋白质分子的多肽链数目。（2）每条肽链的末端残基种类。（3）每条肽链的氨基酸顺序。（4）链内或链间二硫键的配置等•10310α-螺旋和-折叠结构比较4区别点α-螺旋-折叠形状氢键R－基团延伸性升1AA残基高度举例螺旋状链内，与长轴平行较大较大0.15nm毛发角蛋白锯齿状链间，与长轴垂直较小较小0.36nm蚕丝蛋白ITC实验“配体”放在进样针中“大分子”放于样品池中测量反应热••••••单次ITC实验所能得到的参数亲和力（KD）反应热(∆H)结合为点数（N)105•总结解离常数kd与平衡解离常数KD的区别:解离常数Kd不可能大于1，Kd的单位是S-1；Kd表示单位时间内解离了的AB（即AB）占解离前初始AB的比例，由此可见Kd能表示解离反应的快慢，Kd越大代表解离越快，Kd越小代表解离越慢；平衡解离常数KD=Kd/Ka，KD单位是M（mol/L）；KD=[A][B]/[AB]，KD可以表示出处于平衡状态时AB的解离程度，KD越大说明解离越多，代表AB之间亲和力越弱，KD越小说明解离越少，代表AB间亲和力越强；根据KD，可以计算出AB发生解离的比例（百分比），反之亦可推导。如：解离百分比为20%，则KD=0.2*0.2/(1-0.2)=0.05(M)；再如KD=10-6M，则解离百分比约为0.1%。106107平衡解离常数KD数值越大，表示双反映分子A和B的亲和力小108微量热技术(microcalorimetry)等温滴定量热（isothermal••titrationcalorimetry,ITC)DSC)差示扫描量热(differentialscanningcalorimetry,近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确的监测和记录一个变化过程的量热曲线。原位、在线和无损伤的同时提供热力学和动力学信息。•109微量热法特点：它不干扰蛋白质和核酸的生物功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核算体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质没有任何限制条件样品用量小，方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液量热实验完毕的样品未遭破坏，还可进行后续生化分析•••110112BIAcore的三个核心技术A.表面等离子共振（SurfacePlasmaResonance,SPR）光学组件B.微射流卡盘（IntegratedFluidicCartridge,IFC）C.芯片（Chips）