大肠杆菌表达重组蛋白的细胞冻融与超声破碎

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1.仪器与材料：-80C冰箱；超声波细胞破碎仪；50mMPBS或50mMTris-HCIpH7.5;50ml离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4C离心15min，弃上清。2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mMPBS或50mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和口EDTA带His标签不加）,PMSF终浓度为100gg/ml,EDTA的终浓度为。取20gl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2超声波处理（对超声波及热敏感的蛋白慎用）2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH>8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。二包涵体蛋白的纯化1菌体的破碎(加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了)1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mMPBS或20mMTris-HCIpH7.5;裂解液bufferA;溶菌酶10mg/ml;50ml,15ml离心管；冷冻离心机1.2方法⑴收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4C离心15min，弃上清。(2)菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mMPBS或20mMTris-HCl(选择使蛋白稳定的缓冲液和pH,—般为7.5-8.0)，重悬洗涤2-3次，弃掉上清。(3)然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml-10ml裂解液)(4)每毫升悬液中加入100ul10mg/ml溶菌酶(即溶菌酶终浓度1mg/ml)。在冰上孵育15min(5)对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。(6)4C，4000rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2包涵体的洗涤(1)将包涵体沉淀重悬于含有适量脲(1-4M)的BufferA中，每克湿重加4-6ml洗涤液。(2)超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4C涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。⑶4"C，4000rpm/min离心15分钟。(4)重复上述操作2次至上清液透明无色。(5)将包涵体沉淀重悬于BufferA，4C，4000rpm/min离心15分钟，弃掉上清。BufferA50mMTris-HClpH8,0.2mMEDTA,100mMNaCl,1%Tritonx-100（或2%脱氧胆酸钠）1mMDTT1mMPMSF溶菌酶10mg/ml注意事项：⑴包涵体洗涤时增加NaCI浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。⑵经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。(3)包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。(4)用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：⑴菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的BufferA中，4C涡旋悬液30min,4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。⑵取一小部分上清用BufferA稀释到盐酸胍浓度为4M,然后4C涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M,重复上面操作一直到2M把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE!泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。(3)摸索好条件后，直接将剩余上清直接用BufferA稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4C涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓冲体系选择合适的测定方法。一、考马斯亮蓝法(bradford法)－在本实验室中主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度测定(一)实验原理考马斯亮蓝法(bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。/&Ble'bradford法的突出优点是：~G_Z~|(1)灵敏度高%w(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。（3）干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。za1z:+t此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。#（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂tritonx-100、十二烷基硫酸钠（SDS和0.1M的NaOHk%{n­*（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。+（二）试剂与器材61.试剂：­Q*H@::（1）标准蛋白质溶液，用G—球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%勺乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升SY0;.Rg2.器材：=A7z­Ujg（1）可见光分光光度计bZ!?4（2）旋涡混合器CV­|h6-#（3）试管16支=HB!9（三）操作方法|O{!=r1.标准方法（要用96孔板进行实验，方法参照pierce公司试剂盒，此方法可以保留，但是要加96孔板实验方法）$t（1）取13支试管，1支作空白，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0（空白）、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。2U:X}（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O力卩5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂。NIS3*注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。H（3）另取O.1mL未知浓度的蛋白溶液同上测定cL!3（ln?（4）用标准蛋白质量（mg为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。NL9V@0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。{\?8Zk72.微量法xtiRuXj6R当样品中蛋白质浓度较稀时（10—100ug/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G—250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。RGFU[B50.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。W0%]G­x二、紫外吸收法N[1]HF1l}*优点：1紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。2低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH42SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。缺点：1测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。2若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰虽然可以适当的校正，但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。fVr）CI>Q93进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。H（一）280nm的光吸收法M$因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。%'Zu!h'6A测定：将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。注意事项：1蛋白质浓度可控制在0.1〜1.0mg/ml左右。2通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。;@l*=&A（二）280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260=1.8:Ds=#w2:{纯核酸的光吸收比值：A280/A260=0.5;Scf%t_}测定：含有核酸的样品蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。’？1['+蛋白质浓度(mg/ml)=1.45XA280-0.74XA2604gnpIO-w三BCA法蛋白定量1原理：BCA(bicinchoninicacid)是理想的蛋白质定量方法。碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物,测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。2特点：(1)BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂(EDTAEGTA)还原剂(DTT,巯基乙醇)和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。⑵准确灵敏，线性范围广：BCA试剂的蛋白质测定范围是10〜2000µg/ml。(3)经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。3材料BCAA液：pH11.25，1%Na2BCA（二锌可宁酸钠），2%Na2CO3・H2Q0.16%Na2Tartrate，0.4%NaOH,0.95%NaHCO3。B液:4%CuSO4-5H2OPBS缓冲液96孔板酶标仪4操作步骤⑴配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA式剂A加1体积BCA式剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。⑵稀释标准品：取10µl标准品用PBS稀释至100µl(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20µl加到96孔板的蛋白标准品孔中，力卩PBS补足到20µl。⑶力卩适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20µl。⑷各孔加入200µlBCA工作液，37oC水浴30分钟。(5)冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。5注意事项(1)在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37oC温育使溶解，如发现细菌污染则应丢弃。(2)样品中若含有EDTAEGTADTT硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford法测定蛋白浓度；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。(3)要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔,每次均应做标准曲线。(4)当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周