抚仙湖沉积物中微生物解磷能力分析及其对沉积物磷释放的影响

苏州科技学院硕士论文摘要I摘要云南省抚仙湖是滇中地区水质最好，水量最大的淡水蓄积处，由于当地粗放的磷矿开采方式和农业面源污染，抚仙湖产生了较为严重的水污染问题。磷被认为是影响富营养化的限制因素，而抚仙湖沉积物中磷的释放可能是引起抚仙湖水体富营养化的潜在因素。目前对抚仙湖沉积物中内源磷的研究较少，尤其是微生物作用下沉积物磷的释放潜力研究未见报道，本论文通过对抚仙湖柱状沉积物中微生物生物量、碱性磷酸酶活性和解磷细菌解磷能力的垂直分布特征以及微生物作用下的沉积物磷的释放特征开展研究，探讨抚仙湖磷的释放潜力。论文主要结论如下：(1)首先分析沉积物中微生物量的垂向分布，发现不同深度沉积物生物量不同，表层最多，中间层次之，底层相对较少。并且发现不同污染来源沉积物生物量也有所不同，位于抚仙湖北岸农业面源污染区的梁王河口和南部湖区的隔河口生物量较高，其次为轻度污染区的老凹嘴，湖心和水土流失区域的尖山河口生物量最低，在沉积物表层10cm内微生物生物量均值活性范围为25-285mgC/kg，较高的生物量使微生物成为影响沉积物磷释放的重要因素。(2)进一步分析沉积物中碱性磷酸酶活性的垂向分布，发现碱性磷酸酶活性大小顺序大致上与生物量大小分布一致，但是也有所不同，表层沉积物中碱性磷酸酶活性远高于底层，底层和中间层的碱性磷酸酶活性变化不大，也说明微生物对碱性磷酸酶的分泌主要发生在表层，表层10cm取平均值其范围为47.57-182.56mg/(kg·h)，研究区域的酶活性平均值为122.31mg/(kg·h)。(3)采用平板分离法对表层沉积物中解磷细菌计数可得，沉积物中有大量解有机磷和无机磷细菌，在103-106cfu/g数量级上，其中老凹嘴沉积物中解有机磷细菌最多，隔河解无机磷细菌最多，解有机磷细菌数量要高于解无机磷细菌数量1-2个数量级。(4)进一步分析沉积物微生物解磷能力，发现沉积物中微生物对有机磷和无机磷均有解磷能力，六个点沉积物微生物解无机磷能力普遍高于解有机磷能力，底层微生物经过培养后也能表现出较高的解磷能力。除东大河和尖山河口外，其它4个采样点沉积物微生物解有机磷和解无机磷能力存在显著差异（P<0.05）。(5)最后分析在微生物作用下沉积物磷的释放能力，加菌组溶液中磷含量普遍高于非加菌组，沉积物在无机磷解磷菌的作用下比在有机磷细菌作用下表现出较为明显高的释放量。从以上各个因素来看，沉积物中的磷在微生物作用下会有较高的释放的潜力。关键词：抚仙湖沉积物；生物量；碱性磷酸酶；解磷能力苏州科技学院硕士论文AbstractIIAbstractThecentralregionofYunnanProvince,Fuxianlakehavethebestwaterqualityandhavethelargestwateramountasafreshwaterreservoir.Becauseoftheextensivemodeofphosphaterockminingandagriculturalnon-pointsourcepollution,Fuxianlakeproducedamoreseriouswaterpollutionproblem.Phosphorusisthoughttobealimitingfactorforeutrophication.thereleaseofPhosphorusfromthesedimentsofFuxianlakemaybeaunderlyingfactorstocausewaterbodyeutrophication.Atpresent,thestudyontheendogenousphosphorusinthesedimentsofFuxianlakeisless,especiallyundertheactionofmicroorganismsofsedimentphosphorusreleasepotentialiswithoutreport.ThisthesisthroughthestudyofVerticaldistributionofmicrobialbiomass,alkalinephosphataseactivity,thephosphate-solubilizingabilityofphosphate-solubilizingbacteriadandapotentialabilityaboutthereleaseofPhosphorusandthereleasecharacteristicsofthesedimentsundertheactionofmicrobesinthesedimenttoprobethepotentialofthereleaseofphosphorusinthesedimentfromFuxinlake.Themaincontentofthisthesisareasfollowsones.(1)Firstlyweanalysethetheverticaldistributionofmicrobialbiomass,foundthatwithdifferentdepththemicrobialbiomassisdifferent,surfacelayerhavethemostmicrobialbiomass,thenisthemiddletier,thegroundfloorhavethelestmicrobialbiomass.Andfoundthatdifferentspollutionsourcesedimentthemicrobialbiomassisalsodifferent.IntheLiangwangherivermouthwhichLocatedintheAgriculturalnon-pointsourcepollutionareainthenorthshoreofFuxianlakeandGeherivermouthwhichLocatedOnthesouthShorehavehighermicrobialbiomass,thenisLaowazuiwhichisintheLightpollutionarea,LakeCenterandJianshanherivermouthintheSoilandwaterlossarea.Themicrobialbiomassaverageactiverangeis25-285mgC/kginside10cmsediments,higherbiomassmicroorganismshasbecomeaimportantinfluencingfactorsofsedimentphosphorusrelease.(2)Furtherweanalysetheverticaldistributionofalkalinephosphataseactivity,foundthatthedistributionofalkalinephosphataseactivityissimilywiththedistributionofmicrobialbiomass.Butthereisalsosomedifferent,theactivitiesofalkalinephosphataseinsurfacesedimentismuchhigherthanthebottom,thebottomandmiddlelayerschangelittle,Italsoshowedthemicrobestoalkalinephosphatasesecretionoccursmainlyinthesurfacelayer.Averagedtherangeis47.57-182.56mg/(kg·h)inTop10cmofthesediments,theaverageofthestudyareais122.31mg/(kg·h).苏州科技学院硕士论文AbstractIII(3)Usingplatecountmethodforphosphate-solubilizingbacteriacounts,foundthatthereisalargenumberofOrganicphosphorusbacteriaandInorganicphosphorusbacteria,Ontheorderofmagnitudeof103-106cfu/g.Laowadihavemostorganicphosphorusbacteriainthesediment,GeheriverhavemostInorganicphosphorusbacteria.AteachsamplingpointOrganicphosphorusbacteriaishigherthaninorganicphosphorusbacteria1-2ordersofmagnitude.(4)Thenanalyzesedimentmicrobialphosphate-solubilizingability,foundinsedimentsarephosphate-solubilizingmicroorganismsoforganicphosphorusandinorganicphosphorusability,Sixpointsinsedimentmicrobialsolutioninorganicphosphorusabilityofcommonorganophosphorusabovesolution,theunderlyingmicrobialaftertrainingalsocanshowhigher.phosphate-solubilizingability.InadditiontoDongdaherivermouthandJianshanherivermouth,Other4samplingpointsofsedimenthavesignificantdifferencesonAbilitytodissolveorganicphosphorusandInorganicphosphorus.(5)Finallytaketheanalysisundertheactionofmicroorganismssedimentphosphorusreleaseability,experimentsshowthatundertheactionoforganicphosphorusbacteriaandtheinorganicbacteriasedimentscanreleasephosphorus,aboveshowsthatsedimentphosphorusinundertheactionofmicroorganismsisthereleaseofhighpotential.Keywords:Keywords:fuxianlake;sediments;biomass;alkalinephosphatase;phosphate-solubilizingability.苏州科技学院硕士论文目录目录摘要.........................................................IAbstract....................................................II第一章绪论..................................................11.1国内外研究现状..............................................11.1.1湖泊污染现状及其危害..................................11.1.2磷与湖泊富营养化......................................61.1.3沉积物中磷的形态及提取方法............................81.1.4沉积物磷释放影响因素.................................101.1.5解磷细菌研究........................................131.2研究的目的和意义...........................................14第二章实验材料与方法.......................................152.1样品的采样................................................152.1.1采样点选择...........................................152.1.2采样方式.............................................162.2样品的处理.................................................172.3实验方法...................................................172.3.1采样点水深和透明度的测定............................172.3.2上覆水DO的测定.....................................172.3.3上覆水TP测定........................................172.3.4沉积物含水率测定.....................................182.3.5沉积物烧失量测定.....................................182.3.6沉积物OM测定........................................182.3.7沉积物生物量碳测定...................................182.3.8解磷细菌的计数.......................................192.3.9碱性磷酸酶活性的测定.................................192.3.10沉积物微生物解磷能力................................202.3.11微生物作用下沉积物磷的释放特征.....................202.4实验仪器和数据分析........................................212.4.1实验仪器.............................................212.4.2数据处理............................................21第三章结果与讨论...........................................223.1结果.......................................................22苏州科技学院硕士论文目录3.1.1抚仙湖沉积物及上覆水部分理化指标.....................223.1.2沉积物生物量垂向分布................................263.1.3解磷细菌的分布.......................................273.1.4碱性磷酸酶活性的垂直分布.............................273.1.5沉积物微生物解磷能力分析............................293.1.6微生物作用下沉积物磷的释放特征......................313.2讨论.......................................................343.2.1采样点上覆水沉积物的理化特征........................343.2.2沉积物生物量碳垂向分布特征..........................363.2.3解磷细菌的计数......................................363.2.4沉积物碱性磷酸酶的垂向分布特征......................373.2.5沉积物微生物解磷能力分析............................383.2.6微生物作用下沉积物磷的释放特征......................393.2.7解磷能力和生物指标相关性分析.........................39第四章结论.................................................41参考文献....................................................42致谢........................................................47作者简介....................................................48苏州科技学院硕士论文第一章绪论1第一章绪论1.1国内外研究现状1.1.1湖泊污染现状及其危害1.1.1.1我国湖泊污染现状及危害我国湖泊众多的国家，根据国家科技部“十一五”期间进行的“中国湖泊水质、水量与生物资源调查”，2006年，全国湖面面积在1.0km2以上的天然湖泊共有2693个，分布在28个省（自治区，直辖市）总面积81414km2，约占全国国土面积的0．9％。近30年来，全国新发现新生面积大于1.0km2的湖泊分别共有131个和60个，原面积大于1.0km2的湖泊消失243个。拥有湖泊最多且面积最大的湖泊区是青藏高原湖泊区分别占全国湖泊总数量和总面积的39.2%和51.4%[1]。中国经济的快速发展极大的提高了中国人民的物质生活水平，但相应的也给湖泊环境带来了巨大威胁[2]，由于人类的生活方式、强度和不同湖泊自然演化速度、方向等差异，导致我国湖泊出现了水污染严重，富营养化等一系列生态环境问题[3]，从水利部水文局公布的调查报告来看，2003年对全国范围内52个湖泊进行水质评价，21个湖泊水质良好，31个湖泊存在不同程度的污染，其中严重污染的的湖泊站到50%。从2007年国家环保局环境公报显示，我国主要湖泊富营养化问题仍然十分突出。在全国28个国家重点湖（库）中，符合和优于Ⅲ类水的有8个，而Ⅲ类水以下的有20个，其中劣五类的高达11个。从监测的28个湖（库）中，重度富营养化的2个，中度和轻度富营养化的有12个[5]。2010年统计数据显示，在26个国控重点湖泊（水库）中，水质满足Ⅱ类的1个，占3.8%；Ⅲ类的5个，占19.2%；Ⅳ类的4个，占15.4%；Ⅴ类的6个，占23.1%；劣Ⅴ类10个，38.5%。营养状态为重度富营养的1个，占3.8%；中度营养的2个，占7.7%，轻度营养的11个，占42.3%；其他均为中营养，占46.2%[5]。近些年来，由于工业和农业的发展导致大量的工业污水和生活污染物直接或间接流向湖泊，给湖泊环境带来了巨大压力。以五大湖，太湖、滇池、巢湖、洞庭湖、鄱阳湖为例，据统计，2010年，五大湖区45.8亿吨废水排入，接纳化学需氧量51.2万吨，其中工业废水和生物污水占主体地位，分别达到到47.6%和52.4%[6]。我国湖泊富营养化问题越来越严重，其危害也越来越突出，主要表现在3个方面：（1）产生赤潮和水华影响湖泊水体的生态化境在一定的环境条件下，水体中一些微生物，如浮游植物、细菌或原生动物等生长和繁殖速率出现异常，生长和繁殖速率大大加快，出现其过量的生长和聚集而呈现一定特征，主要是由于藻类的种类和数量有所不同，水体在表观上会反应出不同的颜色。苏州科技学院硕士论文第一章绪论2通常来讲这种富营养化发生在海洋叫做“赤潮”，而发生在湖泊、水库叫做“水华”。在水华和赤潮发生的时候，水体中透明度急剧下降，由于表层水体中有充足的阳光和丰富的藻类而有丰富的溶解氧，底层由于光线的剧减和大量的藻类沉降腐烂而消耗了大量的氧使之成厌氧状态。在这种厌氧状态下水质恶化严重，鱼虾类等大型动植物大量死亡[7]。我国近20年来水华现象异常严重，滇池、太湖、巢湖三大湖的严重水华现象已是人所共知[7-9]，北京城区的河、湖自2000年以来连续几年大规模爆发的水华现象在社会上造成了很大的影响[10]。更值得重视的是不少饮用水的水源也发生水华现象[11]，这些现象发生直接影响人民的生活和身体健康[12]。（2）影响水体的利用当水质出现富营养化时，人和动物就不能直接利用水，饮用水资源也会受到影响。由于藻类和浮游生物的大量死亡，在沉积物中存在较大量的生物有机物残体，在厌氧或者缺氧的情况下能够被微生物分解，产生甲烷、硫化氢等有害气体。同时亚硝酸盐和硝酸盐等有毒物质也会处在于富营养化水体中，可能导致人畜中毒事件的发生，危害人类生命财产安全。出现富营养化的湖泊、水库，不但能影响水体的处理与利用，给饮用水处理带来问题，而且对渔业生产也产生危害。并且水质一旦遭到破坏后，恢复水体的清洁就需要相当长的时间。（3）加速湖泊、水库沼泽化的进程在自然状态下湖泊有其衰亡过程，但是由于富营养化，藻类和水生生物大量衍生繁殖，水中的营养物质大量增加，使得此过程被人为的加速，破坏了生态环境。吴庆龙等研究了东太湖沼泽化发展趋势发现东太湖沼泽化速度正在加快[13]。1.1.1.2抚仙湖湖区概况和其污染现状（1）抚仙湖湖区概况抚仙湖位于云南省中部，昆明市东部约60千米，北纬24°21′28″-24°38′00″，东经102°49′12″-102°57′26″之间。跨澄江、江川、华宁三县。湖泊面积211平方千米，最深155米，是我国已知的第二深水湖泊。抚仙湖是一个南北向的断层溶蚀湖泊，形如倒置葫芦状，两端大、中间小，北部宽而深，南部窄而浅，中间呈喉扼形，湖面高度为1722m，湖面积216Km2，湖容量为206亿m3，湖水平均深度为95.2m。抚仙湖湖区位于亚热带季风气候区，属于亚热带半湿润季节气候。全年大多天气晴朗，日照充足，气温高，温差日较大，降水量少，湿度风速较大。苏州科技学院硕士论文第一章绪论3抚仙湖除经由隔河接纳星云湖以上部分的水量外，大部分是由分布在湖周围的许多入湖河道及其区间坡面径流直接汇入的，其中较大的河流有30余条，由于流域地形的特点，这些河道均很短小[14]。图1-1抚仙湖地理位置（2）抚仙湖污染现状吴斌等人对2005全年和2009年6月抚仙湖北岸水质及主要入湖河流中的TN、TP和COD等污染因子进行监测与分析结果表明，抚仙湖中TN和TP浓度随着岸距的减小而增大，说明抚仙湖北岸的水质与入湖的污染程度有着直接关系。2005年和苏州科技学院硕士论文第一章绪论42009年抚仙湖整体水质都为Ⅰ类，但抚仙湖北岸的水质分别达到Ⅲ-劣Ⅴ和Ⅱ-Ⅴ类标准[15]。王林等人对云南省玉溪市环境监测站1980-2010年水质监测数据进行了统计分析，表明抚仙湖水质目前总体保持Ⅰ类水质标准，但水质呈缓慢下降趋势，变化的主要因子是BOD5、CODMn有机污染物，且BOD5浓度上升了2倍，CODMn也上升了0.58倍[16]。潘继征等人对抚仙湖透明度的时空变化及影响因子进行分析得到2005年6-7月抚仙湖水体透明度范围为0.5-6.2m，平均值为4.6m，分析从1980年以来常规监测资料表明近20年来透明度呈下降趋势[17]。李荫玺等人对二十多年来抚仙湖表层水中的藻类监测资料进行的研究，发现抚仙湖浮游植物生物量增长了10.5倍，种群结构从45种增加到78种[18]。沉积物中枝角类微化石的研究显示，随着近20年湖泊营养水平的提高，枝角类也由贫营养种类向富营养种类转化[19]。LIU采用137Cs对抚仙湖沉积物进行定年，发现80年代以来湖泊北部沉积物受到人为活动的影响，出现重金属Pb、Zn、Cd和Cr污染[20]。苏州科技学院硕士论文第一章绪论5表1-1抚仙湖各类指标数据化学需氧量氨氮亚硝酸盐硝酸盐总氮总磷磷酸盐湖心测值80.0630.0089L0.0970.190.0160.012评价结果Ⅰ类Ⅰ类//Ⅰ类Ⅱ类/北岸-东大河测值11.50.0790.0089L0.17950.3550.0370.023评价结果Ⅰ类Ⅰ类//Ⅱ类Ⅲ类/北岸-梁王河测值170.0390.0089L0.1180.170.0210.016评价结果Ⅲ类Ⅰ类//Ⅰ类Ⅱ类/西岸测值8.50.05250.0089L0.1820.2350.0320.023评价结果Ⅰ类Ⅰ类//Ⅱ类Ⅲ类/东岸测值10.50.04250.0089L0.0990.2150.0330.019评价结果Ⅰ类Ⅰ类//Ⅱ类Ⅲ类/由表1-1中可以看到，抚仙湖化学需氧量、氨氮和总氮等指标均达到Ⅰ类或Ⅱ类水质标准，只有总磷大部分在Ⅱ类在Ⅲ类水之间，说明抚仙湖受到磷污染较为严重。苏州科技学院硕士论文第一章绪论61.1.2磷与湖泊富营养化1.1.2.1富营养化概念最开始，富营养化是用来描述植物营养物浓度增加对水生生态系统的生物学效应。有学者认为富营养化是湖泊发展过程中的自然过程。此后有人提出的用湖泊中氮、磷的含量来衡量一个湖泊的富营养化程度[21]。但是富营养化并没有严格的定义，因为对任何一个水体的营养盐进行描述时往往是相对于其以前所有的情况，并且不同水体对营养的响应也有所差别。有学者认为由于接纳了较为过量的氮、磷等营养物质，使湖、库等水体中藻类以及其它水生生物大量生长繁殖，使水体透明度剧烈下降，溶解氧含量大幅降低，有毒有害物质积累，致使湖泊水质恶化，大型水生动物死亡，加速了湖泊老化的自然过程，使湖泊的生态环境和生态平衡都受到阻碍和破快的现象就是湖泊富营养化[22]。1.1.2.2湖泊富营养化发生原因从表面上看，富营养化与蓝细菌和真核藻类引起的“水华”有很大关系。大量的研究表明，富营养化实质上是由于氮磷营养元素的大量排放导致水体中初级生产力异常增大的现象，主要是指藻类的大量增加。在适宜的光照、pH、温度和充足的营养物的条件下天然水体中藻类通过光合作用合成其所需的营养物质，其基本的反应式为：106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H+能量+微量元素C106H263N16P+138O2从上述反应式看以看出，在藻类光合作用中所需要的众多的的元素中，氮、磷是参与藻类光合作用的重要元素，从反应式可以看到，磷才是水体富营养化的限制因子。主要由于在天然水体中磷的含量是很低的，能够有效的限制水生生物的生长繁殖，其次由于能够满足大部分水生生物生长繁殖所需要的磷的含量很少，在生物体中，C∶N∶P的比值为106∶16∶1。最后由于藻类中有许多种类都能够自行固氮来满足自身需要，同时为别的水生生物提供氮源，但是磷的循环中没有上述机制，只能在水体中转化形态。大量的研究表明，许多因素都能导致湖泊的富营养化，如湖泊的地理形态，营养盐含量，和水的流速和流向等内在因素，还有人类活动中生活污水的排放、畜牧业污水排放，工业污水排放和农业中化肥和农药的使用等，这些都能成为湖泊富营养化的主导因素。水体中磷按来源可分为外源磷和内源磷，外源性磷是指来大气沉降、径流等外部苏州科技学院硕士论文第一章绪论7输入的磷。内源性磷主要是指外源性磷的长期输入和水生生物残渣所形成的沉积物中的磷。当外源磷的负荷减少后，沉积物中的磷可能会释放到水体中，成为水体中磷的来源，在一定条件下，成为引起水体的富营养化。高丽等对滇池沉积物磷内源负荷及其对水体的贡献研究得出可溶性磷在水-土界面的浓度梯度为沉积物磷向水体扩散提供了条件，在外源减少的情况下沉积物磷内负荷将在一定时间内成为滇池富营养化的主导因子[23]。王建军等人对云南滇池和抚仙湖沉积物-水界面营养盐通量及氧气对其影响进行研究表明，两者界面磷扩散通量均高于表观通量，而且好氧条件下的扩散通量与表观通量之间的差异较厌氧条件下的大，这表明两种营养盐均存在释放的潜力[24]。孙青等[25]也对北京官厅水库进行研究，发现沉积物释放的磷主要集中在水库的底部，通过扩散作用能够释放到表层上覆水中，沉积物中含有大量的磷，沉积物可能是是官厅水中巨大的磷“汇”。水体富营养化的外源因素主要是由于人类生产和生活活动的加剧，导致进入水体中的磷的含量大量增加。外源性污染主要是包括点源和非点源两类，点源中有工业废水和生活污水，而非点源包括降雨径流等过程中把地表和大气中的溶解的污染物带入湖泊而使提水遭受污染的所有污染源。1.1.2.3富营养化的危害在富营养化水体中营养盐含量增加，导致藻类的生物量也大量的增加，富营养化开始阶段，水体中大型植物也会大量的增加，但是由于藻类的过量生长，水体中的溶解氧会大量减少，透明度大幅降低，导致水体中生物量大量死亡，沉积物中生物残体大量增加，其主要后果有：（1）水体水质变坏，腥臭难闻在富营养化状态的水体中有不同种类的藻类，有一些藻类能够散发出腥味异臭，并且由于藻类大量的死亡，其分解时所产的恶臭性气体也能加大腥臭味，从嗅觉和视觉上影响和干扰人们的正常生活。（2）水体的透明度降低由于水体中含有大量的有机体，伴随着生物的大量死亡，水体中浊度会越来越大，水体中的透明度呈剧烈下降趋势。（3）水体中溶解氧含量降低由于透明度下降，使得阳光难以透射进湖泊深层。使得底层光合生物不能有效的利用光照，光合作用受到限制不能释放大量氧气，并且死亡藻类残体分解时消耗了大量的溶解氧，导致水体溶解氧急剧降低，水体中鱼，虾等动物大量死亡，对渔业有一定影响。（4）向水体释放有毒、有害物质。在富营养化水体中某些藻类能够分泌、释放有苏州科技学院硕士论文第一章绪论8毒性的物质。这些有毒、有害物质一旦进入引用水体中，可能人和动物的肠胃炎症，有害人体健康。（5）对水生生态的影响在自然状况下，湖泊中的各种生物应该处于一个相对平衡的状态，但当水体一旦发生了富营养化，这种平衡就会被打破，造成生态失衡。生物的种群与数量会发生剧烈变化，对湖泊的生态环境造成严重破坏。1.1.3沉积物中磷的形态及提取方法1.2.3.1沉积物中磷的形态了解磷的赋存形态有助于摸清磷在水-沉积物界面的迁移转化规律，沉积物中磷的形态对沉积物中磷的迁移能力和生态效应都有重要意义[26]。湖泊沉积物中磷主要分为有机磷和无机磷两种形式，而无机磷又有多种形态，这些不同形态的磷对水体富营养化影响有着较大差别，主要是因为沉积物中不同形态的磷有着不同的释放特性和生物有效性。（一）沉积物有机磷有机磷包括多种种类，传统上许多学者将有机磷当做一个形态，将不易直接被藻类和水生植物吸收的糖类磷酸盐、核苷酸、腐殖质和富里酸[27]等看成一个形态-有机磷。此类有机磷的分离和鉴定都很困难，其分解只能在其他生物作用下，尤其是微生物的作用下，分解为能够被植物利用的活性可溶性磷。有机磷化合物在有微生物存在的条件能够被相应的分解为活性可溶性磷，在一定条件下释放到水体中成为能够引起水体富营养化的潜在因素。（二）沉积物无机磷无机磷主要是指在沉积物中，吸附在沉积物上的溶解磷酸盐和磷与水体中的铁、铝、锰等金属离子结合所形成的不同结合态的磷。沉积物中无机磷主要分为易交换态磷或弱吸附态磷、铝结合态磷、铁结合态磷、闭蓄态磷、钙结合态磷和原生碎屑磷[28]。也有学者将无机磷分为可溶性磷（DP）、铁结合态磷（Fe-P）、铝结合态磷（Al-P）、钙结合态磷（Ca-P）、闭蓄态磷（Oc-P）[22]。现在以以下几种类型对沉积物中无机磷形态进行介绍：1）易交换态磷或若吸附态磷被沉积物中活性的铁或氢氧化物、锰氧化物以及黏土矿等颗粒表面吸附或共沉淀的磷称为是易交换态磷或弱吸附态磷[29]。在磷的各种形态中，这种磷的含量一般不是很高，因为易交换态磷或弱吸附态磷易被藻类浮游生物等利用。许多因素都能导致易苏州科技学院硕士论文第一章绪论9交换态磷或若吸附态磷释放到上覆水中，如pH、温度、水动力条件及风浪、生物扰动等都能导致这些形态的磷向上覆水中扩散，进而影响水体的营养盐状况，有可能导致富营养化的发生。2）铁结合态磷（Fe-P）和铝结合态磷（Al-P）铁结合态磷和铝结合态磷为两种形态磷较为相近，在一定条件下可以进入水体被藻类和水生植物利用，是两种潜在的活性磷部分，在一定条件下可以转化为易交换态磷，有研究表明内源磷的释放大部分来自这两种磷[30]。铁磷极易受到pH值影响，在中性或者偏酸一点时（pH5-7），铁磷较为稳定，而酸性较大或碱性环境中铁磷最不稳定，沉积物中的铁磷容易被释放出来。另外铁磷在溶解氧较大和有细菌存在时容易发生氧化还原反应，也会导致铁磷的释放[31]。一般情况下，铝磷以三价态稳定存在，铝的化合物对磷也具有吸附能力，铝磷相较于铁磷而言更为稳定。他的稳定性主要受到pH值得影响，pH过高或者过低都能使铝磷中的磷释放，并且在一定条件铝磷会逐渐转化为铁磷。因此，在控制沉积物内源磷释放时可以投加铝盐，其与磷形成稳定的结合态能够长期有效的控制内源磷的释放。3）钙结合态磷（Ca-P）沉积物中钙结合态磷主要是以钙的磷酸盐的形式存在的，由于其磷酸盐不易溶解，故钙磷也较为稳定。这主要包括与湖泊沉积碳酸钙、自生磷灰石以及生物骨骼等含磷矿物的磷的存在形式[32]。钙磷的来源对其稳定性的影响较大，如原生磷灰石较为稳定，只有在强酸的环境中才会被释放，其稳定性受物理及生物的影响较小；而自生磷灰石的稳定性就差一些，pH过高或者过低都会引起磷从沉积物中释放出来，并且由于生物呼吸作用产生的pH降低对自生钙磷有较强的溶出作用。如果沉积中钙磷部分被释放出来，将会对水体富营养化起到很大作用[33]。4）闭蓄态磷（Oc-P）闭蓄态磷是指一类由Fe2O3膜覆盖的磷酸盐，其包括一些铝磷和钙磷，当铝磷和钙磷表面被Fe2O3覆盖时，由于Fe2O3较为稳定，所以其能够长时间的存在，一般情况下，我们认为这部分磷不是生物可利用磷[34]。1.2.3.2沉积物中磷的形态的提取方法目前国内外许多学者相继发表了有关磷的形态分析的研究成果，但不同学者运用的方法却不尽相同，最早在1957年Chang和Jackson首先将土壤中磷进行了分级，分别为不稳定性或弱结合态磷（Lsor-P）、铝结合态磷（Al-P）、铁结合态磷（Fe-P）、钙结合态磷（Ca-P）、惰性磷（refractouryP）以及水溶态磷（RSP）[35]。1976年Williams等人将沉积物磷分为磷灰石磷（AP）、非磷灰石及有机磷，此方法后来别称作Williams法[36]。1980年Hieltjeshe与Lijklema将沉积物磷划分为不稳定性磷（NH4Cl-RP）、铁苏州科技学院硕士论文第一章绪论10铝结合态磷（NaOH-RP）、钙结合态磷（HCl-RP）及残留磷，在第一步中用NH4Cl用提取剂[37]。1990年我国学者翁焕新将Chang和Jackson法稍加修正，将其应用于美国华盛顿河流和湖泊沉积物中的提取，提出不同结合态磷主要包括无机磷(铁磷、钙磷、铝磷)、固着态铁磷和铝磷[38]。1992年，ruttenberg首次提出区分海相沉积物中自生磷和碎屑磷的磷形态分离方法，建设性提出了在提取步骤中用氢氧化镁和水分别洗涤沉积物，用来最大程度的降低沉积物对溶解磷磷的重吸附问题，由此形成SEDEx提取法或称为Ruttenberg法[39]。1996年，Gloterman成功的提取铁结合态磷、钙结合态磷、酸可提有机磷以及碱可提有机磷，在还原剂连二亚硫酸钠存在的前提下，采用EDTA代替NTA进行提取[40]。2000年，Gilbin等人对Gloterman的方法略加修改，并结合凝胶排斥色谱技术对沉积中酸可提有机磷、碱可提有机磷、胡敏酸磷、富里酸磷等进行了分离分析[41]。2001年欧洲标准测量组织提出的SMT（TheStandardsMeasuremengtsandtestingProgramme），来研究污泥中磷的形态。SMT法将沉积物中磷分为5中分别为：非磷灰石无机磷（NAIP：与铁，锰，铝氧化物及其氢氧化物结合的磷）、磷灰石无机磷（AP：与钙结合的各种磷）、无机磷（IP）、有机磷（OP）以及总磷（TP）[43]。欧洲标准测量组织于1996年开始验证了4中方法(Willimas法、Hieltjes—Lijklema法、Ruttenberg法、Goherman法)，被看作是获得一个综合的标准方法的基础。但这四种方法也有各自的优缺点：1）Willimas法优点是简单实用，其缺点是部分NaOH提取的磷被CaCO3吸收；2）Hieltjes—Lijklema法也具有简单实用特点但是提取过程中NaOH能溶解少量的铁磷和铝磷，其部分有解磷会水解，并且与生物可利用性没有联系。3)Ruttenberg可以提取特定的组分，也可以提取沉积物中有机磷部分，并且可提供关于生物可用性的部分信息，但其使用性不强，NTA和EDTA对磷的测定会产生干扰，且溶液的制备相当复杂，有时有些步骤要重复进行。4）Goherman法能够区分出不同磷酸盐形态，且提取液中磷不会再次吸附到剩余沉积物中，但是此法耗时较多，实用性较差。1.1.4沉积物磷释放影响因素沉积物中磷的释放受到众多环境因素的影响[43-45]，如PH，氧化还原条件、微生物、沉积物扰动状况等。大体上可以分为物理释放，化学释放和生物释放三类。1.1.4.1物理释放物理释放主要包括沉积物扩散及扰动所导致磷的释放。1）扩散：在沉积物表层泥水界面处存在磷酸盐的浓度梯度，由于表层间隙水中苏州科技学院硕士论文第一章绪论11磷酸盐浓度大于上覆水浓度而导致磷酸盐从间隙水中扩散到上覆水中去[46]。范成新等研究显示随着沉积物深度的增加，间隙水中的溶解性磷的含量迅速增加，主要是由于在表层存在间隙水和上覆水的浓度梯度，而深层沉积物就不存在大的磷酸盐浓度梯度而趋于稳定状态[47]。也有研究表明在沉积物-水的界面处有一层氢氧化物，这些氢氧化物导致沉积物表层间隙水中磷的含量较低主要是因为该层氢氧化物对磷有很强的吸附能力，且被吸附于表层中磷酸盐容易释放到上覆水中，都能导致表层沉积物间隙水磷含量较低[48]。随着沉积物深度的增加，溶解氧逐渐减小，铁的氢氧化物较少，可使可溶性磷释放到间隙水中。从扩散的角度讲，沉积物中间隙水与上覆水中磷的浓度梯度越大，磷的释放通量也就越大。2）扰动：扰动是影响内源磷释放重要因素[49,50]，由于风和湖泊内流等引起的扰动对磷的沉积的影响有两个方面，可能会增加或者减少沉积物中磷向上覆水中的释放量。Laenen等人的研究发现沉积物再悬浮有可能是内源磷释放的主要来源[51]。范成新等对风浪作用下太湖悬浮态颗粒物中磷的动态释放估算得出磷的释放量和扰动强度之间成正比关系[52]。朱光伟等对太湖沉积物悬浮物中营养盐释放的波浪水槽实验显示，小波掀沙对沉积物中氮、磷浓度的影响很小，大波掀沙则能显著的提高营养盐含量[53]。王立志等研究发现浅水湖泊中颗粒态磷和溶解态磷受到风浪扰动的影响较大，当风浪扰动加强时上述两种形式的磷被较大的释放，且扰动向水体中释放的主要为颗粒磷[54]。1.1.4.2化学释放沉积物中化学变化主要包括氧化还原电位、pH值、温度、光照。1）氧化还原电位：沉积物中氧化还原电位对磷酸盐的形态和释放存在较大影响，当沉积物中氧化还原电位较高时沉积物中以铁的价态主要是三价铁离子，而其与磷酸盐能结合成不溶的磷酸铁或者与OH-结合成为难溶的氢氧化铁。当水中氧化还原电位较低时，沉积物中铁主要以二价铁离子形成存在，三价铁被还原成为二价铁，不溶态磷酸铁和氢氧化铁别溶解析出磷。有研究表明，即使沉积物的氧化还原电位降至-400mv，大量的三价铁仍然能够存在于沉积物中，这就为其和磷酸盐结合成不溶的磷酸铁提供了大量的铁离子，这就为磷的吸附提供了有利的条件，且有利于对磷酸二氢盐的吸附[55]。2）pH值：pH值是影响沉积物磷释放的关键因素。金相灿等研究得出，pH值对沉积物磷释放的影响主要表现在pH值影响铁、铝、钙等元素与磷的结合状态，过高或过低的pH值都能引起相应的结合态磷的释放[56]。袁和忠等研究pH控制条件下太湖梅梁湾沉积物中磷的释放特征结果表明pH值条件对沉积物磷的释放具有显著条件，强酸性（pH为2.0左右）及强碱性（pH≧9.5时）都利于磷的释放。中性条件下苏州科技学院硕士论文第一章绪论12对磷的释放作用不明显[57]。Jin等在室内模拟研究了太湖不同湖区沉积物的释放通量，通过添加酸碱物质的方法来控制模拟实验的水体的pH值，研究结果表明，水体中磷的含量与pH值之间有较为明显的相关性[58]。Jensen等研究了丹麦不同湖泊pH值与磷酸根离子的含量之间的关系，发现有一部分湖泊在搞pH值得条件下溶解性活性磷的释放加强[59]。。Niu等研究沉积物磷生物可利用性，研究了不同pH值条件下水中磷的变化规律提出高的pH值有利于内源磷的是释放[60]。3）温度：温度能够影响影响水生动物、植物、微生物的生长繁殖和活性，对有机质矿化过程的快慢也有影响。有研究表明当温度上升1-3℃时，沉积物中磷的释放量将会大幅度提高[61]。不同的季节内源磷释放量也会有所不同，由于温度的不同，在夏天磷的释放量达到最大值，为冬天释放量最低。这主要是因为温度会促使沉积物表层氧化还原电位的降低，使高价铁还原成低价铁，使磷酸盐释放。4）光照：光照也是影响沉积物磷释放的因素之一，在一些较浅的湖泊中，阳光可以较多透射如湖泊中，这样就为底栖生物的生存提供了条件，主要是为藻类的光合作用提供了有利条件，致使底栖藻类在湖泊中大量繁殖，其生存和繁殖吸收了沉积物中大量的磷，导致在短时期内表现为光照对沉积物中磷的释放量呈现负相关，但随着藻类的死亡和分解，其吸收于沉积物中磷又可以释放到上覆水中，成为造成富营养化的磷的来源。有研究显示，光照对水体pH值和氧化还原电位提高也有帮助，是阻碍内源磷释放的因素之一[62]。1.1.4.3生物释放沉积物磷生物释放主要通过3种方式，细菌、真菌、原生动物等低等微生物释放、大型水生植物、底栖藻类的释放和底栖动物的生命活动中释放。沉积物中细菌等微生物对沉积物中磷的释放起着重要作用。细菌可分解沉积物中不溶态有机磷和无机磷，使其转化为可溶性磷化合物供自身生命活动需要，但大部分分解的可溶性磷都被释放到上覆水中去[63]。水生植物在生命活动中可分泌可溶性磷，并且其死亡后通过微生物的分解作用也能将磷释放到水体中。许多的大型底栖无脊椎动物在沉积物-水界面的挖洞、过滤、摄氏和排泄活动也能够增加氧化态磷的释放量。但是，实验条件下却得到了相反的结果，这是因为大型无脊椎动物的活动能够增加溶解氧输入沉积物的通量，因此减少磷的释放。最后，沉积物表面会形成一层由藻类和细菌组成的生物膜，而磷的释放通量的增加或者减小取决于藻类和细菌的生长情况[64]。孙晓航等对太湖沉积物及湖水的好氧厌氧进行连续模拟实验，结果表明，在好氧环境中，微生物有助于磷的聚集，而在厌氧条件下，微生物强化了磷的释放，沉积物磷的形态分析结果表明微生物作用下，铁结合态磷更容易释放出来[65]。游雪静等研究认为证实了沉积物中微生物对磷有释放和吸收的作用[66]。苏州科技学院硕士论文第一章绪论131.1.5解磷细菌研究1.1.5.1解磷菌的种类、生态分布能够分解土壤中含磷化合物的一类细菌统称为解磷菌（phosphobacteri），按其对磷的分解类型可分为无机磷细菌和有机磷细菌。二者之间没有严格的界限，有些细菌对无机磷和有机磷均有解磷能力。磷细菌能把土壤中不溶态磷化合物分解为可溶态磷化合物供生物利用，是土壤中生物可用性磷素重要来源。根据其种属进行归类，主要包括巨大芽孢杆菌Bacillusmegatherium，假单胞菌属中的一些种Pseudomonassp.，节杆菌属中的一些种Arthrobactersp.，氧化硫硫杆菌Thiobacillusthiooxiduns.，产碱菌属Alcaliqene.，芽孢杆菌属中的一些种Bacillussp，色杆菌Chromobacterium，欧文氏菌属Erwinia，黄杆菌Flarobacterium，固氮菌属Azotobacter及沙雷氏菌属Serratia。不同的土壤、不同作物根际中解磷细菌的数量和种群分布存在一定的差异，易瑞玲分析我国旱地地区中磷细菌数量，结果显示磷细菌差异比较大，其中磷细菌数量最多的黑钙土磷细菌，其次为黄棕土，最少的为白土。林启美研究了农田、林地、草地和菜地4中生态系统中有机磷细菌和无机磷细菌的数量发现，有机磷细菌明显高于无机磷磷细菌，有机磷和无机磷细菌都是以菜地中最多，农田中磷细菌最少[67]。Ponmurugan和Gopi报道，不同作物根际土壤中解磷细菌数量不同，其中落花生根际磷细菌数量做多，而鸭脚稗根际磷细菌数量最少[68]。1.1.5.2解磷菌对土壤中磷释放影响林启美等通过对4种溶磷细菌和真菌溶解磷矿粉的特性，证实了微生物能够破坏磷矿粉结构，通过再次培养磷矿粉中的磷更容易释放出来。当增加了培养基中磷矿粉浓度时，磷细菌的溶磷量将显著降低，而提高培养基中碳源物质浓度，淋溶量会减少[69]。李繁等对7株解有机磷细菌进行了分离和鉴定，结果表明，解磷细菌的解磷能力不稳定，在菌株培养与保存过程中，部分菌株会丧失解磷能力。赵晓蓉等人研究发现，解磷细菌能增强土壤的溶磷能力，促进植物生长繁殖[70]。于翠等研究发现在植物不同生育期根际微生物种类不同，根际与非根基解磷菌的根际效应不明显[71]。李文红对西湖沉积物中解磷菌进行分析，发现不同解磷细菌解磷能力差异较大，有些磷细菌在纯化后会失去解磷能力[72]。有人研究了有机磷化合物对磷细菌生长和解磷的影响，以卵磷脂作为磷细菌的有机磷来源，发现不同的有机磷化合物添加量和添加时间都会对磷细菌产生影响。陈永亮研究发现，在缺磷的条件下，幼苗根际组织内与根际分泌的碱性磷酸酶活性均有提高，而碱性磷酸酶是微生物对有机磷分解能力时重要的一种酶。综上所述解磷菌对土壤中磷的释放具有重要作用，是土壤中磷转化的关键性因素苏州科技学院硕士论文第一章绪论14之一。1.2研究的目的和意义近年来，随着抚仙湖工农业生产和城市建设的发展，大量污染物排入抚仙湖，并且抚仙湖流域内废弃磷矿大量堆积，裸露的废弃矿石和废土石通过自然风化和降雨淋溶的作用随河道直接流入抚仙湖使抚仙湖面临严重磷污染形式，沉积物中内源磷释放潜力增大，本文研究微生物作用下抚仙湖沉积物磷的释放潜力，为抚仙湖治理和保护提供一定的基础理论依据。苏州科技学院硕士论文第二章实验材料与方法15第二章实验材料与方法2.1样品的采样2.1.1采样点选择以抚仙湖流域东北部磷矿开发区对抚仙湖北部湖区的污染为研究目标。在抚仙湖北部东岸为陡峭山林，入湖径流散布，水土流失较轻；磷矿开发区的分布在东大河、代村河流域，这两条河流自北岸东段进入抚仙湖；北岸西段入湖的山冲河、梁王河、镇海营沟、沙盆河等为农业面源污染区；其西岸为高山林地，尖山河是最具代表性的水土流失河流；另外有南岸受到星云湖影响较大的隔河。根据污染来源的不同确定采样点，在抚仙湖北部湖区分别代表水土流失污染区、农业面源污染区、磷矿开发污染区和轻污染区的尖山河口、梁王河口、东大河口、和老凹嘴，以及湖心最深处和南部湖区的隔河口布设沉积物采样点（图2-1），采样点具体经纬度如表2-1所示图2-1采样点位置苏州科技学院硕士论文第二章实验材料与方法16表2-1采样点经纬度采样点经纬度尖山河口102°52′56.64″